Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hög Utbyte Expression av rekombinanta humana proteiner med transient transfektion av HEK293 celler i suspension

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

Konsten att producera rekombinanta proteiner med komplexa posttranslationella modifieringar utgör en stor utmaning för studier av struktur och funktion. Den snabba etablering och hög återhämtning från transient transfekterade däggdjurscellinjer behandlar denna barriär och är ett effektivt sätt att uttrycka proteiner som naturligt kanaliseras genom ER och Golgi-medierad sekretoriska vägen. Här är ett protokoll för proteinexpression med användning av humana HEK293F och HEK293S cellinjer transfekterade med en däggdjursexpressionsvektor designad för höga proteinutbyten. Tillämpligheten av detta system demonstreras med användning av tre representativa glykoproteiner som uttryckte med utbyten mellan 95-120 mg renat protein återvinns per liter kultur. Dessa proteiner är den humana FcγRIIIa och råttan α2-6 sialyltransferas, ST6GalI, båda uttryckta med en N-terminal GFP-fusion, såväl som det omodifierade humant immunoglobulin G1-Fc. Denna robusta systemet utilizes ett serumfritt medium som är anpassningsbar för expression av isotopiskt anrikade proteiner och kolhydrater för strukturella studier med användning av masspektrometri och kärnmagnetisk resonansspektroskopi. Vidare kan sammansättningen av den N-glykan avstämmas genom tillsats av en liten molekyl för att förhindra vissa glykan modifieringar på ett sätt som inte minskar utbytet.

Introduction

Producera höga utbyten av lämpligt vikta och posttranslationellt modifierade humana proteiner för detaljerad analys av struktur och funktion är fortfarande en stor utmaning. Ett stort antal uttryckssystem finns tillgängliga som producerar rekombinanta proteiner med nativ-liknande funktion och beteende. Bakteriella expressionssystem, främst Escherichia coli-stammar, representerar de mest tillgängliga och vanligen använda verktyg i forskningsarenan, på grund av enkelheten i dessa expressionssystem, även om jäst, växt-, insekts- och däggdjurssystem är också beskrivna 1-4. Majoriteten av dessa system är oförmögna att lämpliga post-translationell modifiering av målproteinerna. En grundläggande intresse Barb och Moremen laboratorier producerar eukaryota proteiner med lämplig glykosylering. Många humana proteiner kräver lämplig glykosylering för korrekt funktion (se 5).

Den eukaryotaglykosylering maskiner är omfattande och kan ge ett varierat utbud av modifieringar, både asparagin (N) - och serin / treonin (O) -länkade komplexa glykaner 6. Det uppskattas att> 50% av humana proteiner är N-glykosylerade 7. Glykaner är viktiga komponenter i många proteiner, inklusive terapeutiska monoklonala antikroppar, erytropoietin, och blod koagulationsfaktorer som faktor IX, för att nämna några. Även flera metoder finns för att förbereda sig på lämpligt sätt N-glykosylerade proteiner och sträcker sig från rent syntetisk 8-10, att chemoenzymatic 11-14 eller återhämtning från manipulerade rekombinanta system 15-20, inte helt oväntat, har humana expressionssystem som hittills visat sig vara den mest robusta metoder för att generera humana proteiner.

Många terapeutiska mänskliga glykoproteiner produceras i rekombinanta system med däggdjursceller. System att notera är den kinesiska hamsterovarie (CHO), mus myelom (NS0) Baby Hamster Kidney (BHK), humana embryonala njur (HEK-293) och mänskliga näthinnan cellinjer som används i vidhäftning eller suspensionsodling för proteinproduktion 4,21,22. Dock har däggdjursproteinexpressionssystem krävs generering av stabila cellinjer, dyra tillväxtmedier och substrat assisterad transfektion förfaranden 23.

Däggdjurscell transfektion uppnås med hjälp av ett stort antal medel inkluderande kalciumfosfater 24,25, katjoniska polymerer (DEAE-dextran, polybren, polylysin, polyetylimin (PEI)) eller positivt laddade katjoniska liposomer 26-29. PEI är en polykatjonisk, laddad, linjär eller grenad polymer (25 kDa) 26 som bildar ett stabilt komplex med DNA och är endocyteras. Vid försurning av endosomen är PEI tänkt att svälla, vilket leder till bristningar i endosomer och frisättning av DNA i cytoplasman 26,30.

Tills nyligen, transient transfektion i suspensiom kultur utfördes genom tidigare DNA / PEI komplexbildningen följt av tillsats till cellodlingen 29. Men Würm och medarbetare rapporterade en högeffektiv protokoll optimerad för rekombinant proteinproduktion i HEK293-celler som bildade en DNA / PEI-komplexet in situ 31,32. Detta undviks framställning, sterilisering av komplexet, och buffertutbyte i ett odlingsmedium. Ytterligare optimering genom att inkludera uttryck höjande plasmider ledde till betydande ökad avkastning 33. Häri är en metod som bygger på dessa framsteg och är brett tillämpbar. Uttrycks villkor kan också ändras för att påverka N-glykan komposition.

Den HEK293S cellinje med en gen deletion som stannar N-glykan bearbetning vid ett mellansteg, leder till expression av proteiner med enhetliga N-glykaner bestående av 2 N-acetylglukosaminrester plus fem mannosrester (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Dessa cellersaknar den N-acetylglukosaminyltransferas I (GntI) gen som krävs för nedströms N-glykan bearbetning 36,37. Användningen av glykosyltransferasaktiviteter inhibitorer inklusive kifunensine, sialinsyra analoger och fukos analoga och 2-deoxi-2-fluor-fukos har liknande effekter och gränser N-glykan bearbetnings 38-41.

Protokollet redovisas här använder pGEn2 vektorn som visas i figur 1 42,43, PEI assisterad transient transfektion in i däggdjursceller linjer (HEK293F eller HEK293S celler), och återvinning av höga utbyten av lämpligt glykosylerat protein. Detta system är robust och kan anpassas till olika faktorer, inklusive isotopmärkning och glykan teknik för produktion av stora titrar av rekombinanta proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll är tillräckligt för uttryck med antingen HEK293F eller HEK293S celler.

1. Cell Etablering

  1. Kultur Inokulering
    Obs: Alla odlings manipulation procedurer måste transporteras i en BSL-2 anläggning och varje objekt förs in i biosäkerhet skåpet måste steriliseras genom att spraya med en 70% etanol i vattenlösning.
    1. Manövrera inkubatorn skakare vid 135 varv per minut, 80% fuktighet och vid 8,0% CO2 och 37 ° C. Slå "på" UV-lampa biosäkerhet skåpet minst 1 timme före att arbeta. Prewarm de förseglade medium A och material B flaskor i vattenbadet vid 37 ° C under 1 timme.
    2. Sterilisera 125 ml Erlenmeyer tillväxt kolvar med ett ventilerat lock, pipetter, pipetter och förvärmda media flaskor genom att spraya med 70% etanol i vattenlösning. Placera dessa objekt i biosäkerhet skåpet. Obs: Sterilisera endast det yttre plast täcker 125 ml Erlenmeyer odlingskolv, och sedan ta bort endast när det is inuti biosäkerhet skåpet.
    3. För en 30 ml odling, dra tillbaka 26 ml medium A och 3 ml medium B (10% av den slutliga kulturen) och överför till den 125 ml Erlenmeyer-odlingskolv och blanda försiktigt genom skakning (härefter benämnd som färskt odlingsmedium).
    4. Överföring en flaska med celler innehållande HEK293F celler, frysta vid -80 ° C, på is och flytta till odlingsrummet. Obs: HEK293F celler levereras vid en densitet av 1 x 10 7 celler / ml.
    5. Värm flaskan försiktigt i vattenbad vid 37 ° C för att delvis tina cellerna (det tar ungefär en minut och cellerna bör inte helt upptinad). Sterilisera utsidan av flaskan med 70% etanol i vattenlösning och flytta den till biosäkerhet skåpet.
    6. Med hjälp av en ml pipett dra cellsuspensionen (ca 0,7 ml) och överför till 125 ml Erlenmeyerkolv innehållande 29 ml färskt odlingsmedium. Stäng luckan odlingskolven och flytta den till den inkuberade shaker.
    7. Cell Underhåll: Kontrollera celltäthet, livskraft och cellpassager
      1. Kontrollera celler densiteten efter 24 timmar av upptining av kulturen genom att följa protokollet nedan. Obs: Celler odlas under 24 timmar efter upptining för att säkerställa grundläggande celler tillväxt och lönsamhet för> 80%.
      2. Sterilisera odlingskolven med 70% etanol i vattenlösning och flytta den till biosäkerhet skåpet.
      3. Med hjälp av en 1 ml pipett och pipett, långsamt dra tillbaka 100 il suspensionskultur och överföring till en steril 0,5 ml Eppendorf-rör. Stäng och överföra odlingskolven tillbaka in i skakapparat så snart som möjligt.
      4. Blanda 7,5 | il av en lösning av trypanblått med 7,5 | il av celler. Blanda kraftigt med 7,5 pl av cell / Trypan blå blandning och överföra den till räknings bilden.
      5. Slå på automatisk cellräknare och placera räknings glida in i laddningskammaren. Den automatiska läsaren aktiveras och celler räknas automatiskt i enheternaav antalet celler per ml och procent viabilitet
      6. Fastställa omfattningen av donatorkultur som krävs för överföring till ett färskt odlingsmedium vid celler täthet av 0,3 x 10 6 levande celler / ml.
        Obs: Se en beräkning prov i kompletterande material.
      7. Upprepa steg 1.1.2 och 1.1.3 i "1,1 Kultur Inokulering" protokollet ovan för att förbereda material som krävs för färskt odlingsmedium.
      8. Överför Medium A (23 ml) och medium B (3 ml) till ett nytt 125 ml odlingskolv. Ta bort lager flaskor medium A och Medium B från biosäkerhet skåpet.
        Obs: Lagren av media flaskor bör inte hållas i biosäkerhet skåpet samtidigt som HEK 293F cellerna. Detta begränsar möjligheten att förorena aktiemedel flaskor.
      9. Avlägsna HEK293 cellodling från inkubatom och spraya med 70% etanol i vattenlösning. Med hjälp av en ny pipett återkalla delmängd av celler (4 ml, var denna volym bestäms enligt to steg 1.2.6) från kulturen och överföra den till kolven innehållande färskt odlingsmedium.
      10. Överför de båda kulturerna från biosäkerhet skåpet till inkubatorn shaker in enligt 1.1.1. Odla celler till en ungefärlig densitet av 2-3 x 10 6 levande celler / ml.
        Anmärkning: Den ungefärliga fördubblingstid av celler är 32 timmar. Det kommer att ta 3-4 dagar att nå denna densitet. Inkubera cellerna i 3-4 passager för att ha en stabil tillväxt mönster av celler före den första transfektionen.

    2. Förbered Material för transfektion

    1. Förberedelse HEK293-celler (dag 1)
      1. Subkultur celler till en densitet av 1 x 10 6 celler / ml i färskt medium B 24 h före transfektion enligt steg 1,2.
        Notera: volymen av transfektion kulturen kommer att bero på antalet celler. Större transfektion volymer (> 20 ml) kommer att kräva en större volym av kultur i det här skedet.
    2. Framställning St.ocks Material
      1. Bered stamlösning av linjär Polyetylenimin (PEI) i en koncentration av 1 mg / ml i en buffert innehållande 25 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) och 150 mM NaCl (pH 7,5). Lös PEI helt; detta kan ta från 30 till 60 min vid RT. Sterilisera genom 0,22 ìm spruta filter och förvara vid -20 ° C för långvarig användning.
      2. Förbered steril plasmid-DNA (enligt stegen 2.2.2.1-2.2.2.4). Plasmidkonstruktionsstrategin förfarande beskrivs på annat håll 42. En kort procedur för DNA-beredning förklaras här:
        1. Odla en kultur av kemiskt kompetenta Escherichia coli-celler transformerade med pGEn2 vektorn i en liter LB-medium (Tryptone- 10 g / L, jäst utvinna 5 g / I och natrium klorid 10 g / I) med tillsats av 100 | j, g / ml ampicillin. E. coli odlas vid 37 ° C i en icke-befuktad, skakinkubator.
        2. Rena den pGEn2 vektor som kodar mål-plasmid-DNA enligt den manukarens DNA-reningsprotokoll.
        3. För att säkerställa fullständig sterilitet av plasmid-DNA, utföra de slutliga isopropanolutfällning och återsuspension stegen i DNA-extraktion inuti biosäkerhet skåpet.
        4. Tillsätt volym isopropanol (specificerade i plasmidberedningen satsen) till den eluerade DNA och centrifugera vid 10000 x g under 10 minuter. Sterilisera utsidan av DNA-behållare med 70% etanol i vattenlösning och överföra den inuti biosäkerhet skåpet. Kassera isopropanol supernatanten med hjälp av en pipett och lufttorka DNA-pelleten. När torr, suspendera pelleten i steril 10 mM Tris-buffert, pH 8,0.
      3. Bered stamlösning av 220 mM valproinsyra (VPA) syra i vatten och sterilisera genom passage genom ett sterilt 0,22 pm filter. Förvara lösningen vid -20 ° C tills vidare användning.

    3. Upprättande av en Transient transfektion

    1. Transfektion (Dag 0)
      1. Kontrollera celltätheten genom att följa stegen 1.2.2 till 1.2.5 av "1.2. Cell underhåll" ovan. Bestäm mängden celler för transfektion (2,5-3,0 x 10 6 levande celler / ml med viabiliteten> 95%). Se en beräkning prov i kompletterande material.
      2. Överför volymen av suspensionsodlingsceller som beräknats i föregående steg (här 67 ml) till en 250 ml centrifugrör med användning av en steril serologisk pipett. Samla cellerna genom centrifugering under 5 min vid 100 x g.
      3. Under tiden förbereder en ny transfektion odlingsmedium efter steg 1.1.3 enligt "1.1. Culture Inokulering" ovan. Se kompletterande material för en räkneexempel. Dessutom, överföring 5 ml färskt odlingsmedium till en steril 15 ml rör och ställ åt sidan.
      4. Överför rör innehållande de pelleterade cellerna i biosäkerhet skåpet efter sterilisering av utsidan av rören med 70% etanol i vatten-lösning och använda en steril pipett för dekantering the supernatant bestående av använt odlingsmedium.
      5. Med kraft resuspendera pelleterade cellerna genom pipettering upp och ned med hjälp av 10 ml färskt odlingsmedium och överföring till kolven med färskt transfektion odlingsmedium (framställt i steg 3.1.3 ovan). Skruva på locket på den ventilerade cellodlingskolv och flytta kolven till inkubatorn (enligt 1.1.1) under 15 min-1 timme med skakning.
      6. Under denna tid, späd plasmid-DNA och PEI lager som använder färskt odlingsmedium (med användning av 5 ml volym ut från steg 3.1.3 ovan) till en slutkoncentration av 0,5 ug / ul. Se räkneexempel i kompletterande material för att bestämma mängden DNA och PEI. Överför odlingskolven med spridda celler i biosäkerhet skåpet.
      7. Lägg till plasmid-DNA (300 pl av 0,5 mikrogram / l) till odlingen med hjälp av mikro-pipett och blanda genom försiktig manuell skakning. Lägg PEI (900 pl av 0,5 pg / pl) till odlingen, blanda genom att försiktigt skaka. Lägg 3,8 ml färskt Culratur medium, från steg 3.1.3, ovan och överföringskolven till inkubatorn skakapparat under 24 timmar.
      8. Rengör biosäkerhet skåpet enligt steg 1.1.
    2. Utspädning (Dag 1) (För en 50 ml transfektion volym)
      1. Inkubera den transfekterade kulturen för 24 timmar.
      2. Dra 1 ml förvärmd 220 mM Valproic Acid (VPA, framställd enligt steg 2.2.3.) Med hjälp av en steril 1 ml serologisk pipett och överföra den till ett sterilt 50 ml rör.
      3. Uttag 5,0 ml förvärmd medium B och 44 ml förvärmd medium A och tillsätt detta till VPA lösningen med användning av en steril serologisk pipett för att framställa 50 ml av färskt odlingsmedium med en slutlig koncentration av 4,4 mM av VPA.
      4. Flytta den transfekterade kulturen i biosäkerhet skåpet efter sterilisering det yttre av kolven med en 70% etanol i vattenlösning, tillsätt den preparerade utspädningsmediet och överföra kolven tillbaka till den inkuberade skak.
    3. Expression och Harvest (dagar 2-6)
      1. Inkubera cellerna i ytterligare 4-5 dagar (5-6 dagar totalt sedan transfektion).
      2. Dra alikvoter av odlingsmedium efter steg 1.2.2. till 1.2.5. beskrivs i "1.2. Cell Underhåll" ovan med en steril 1 ml serologisk pipett, att övervaka celler livskraft och spara portioner för att analysera proteinuttryck på varje dag med SDS-PAGE (se avsnitt 5 nedan).
      3. Harvest celler efter 5-6 dagar genom centrifugering av celler plus medium vid 1000 g under 5 min. Dessutom, skörda supernatanten om cellviabiliteten understiger 50% (se steg 1.2.2-1.2.5).
      4. Häll av vätskan som ska innehålla utsöndrat protein. Tillsätt 5 ml av en 10% blekmedel till HEK cellpelleten och kassera som biologiskt.

    4. Proteinrening

    1. Bered en kolonn med 5 ml Protein-A-Sepharose. Jämvikta kolonnen med 5 kolonnvolymer av buffert A (20 mM 3- (N-morfolino) propansulfonsyra (MOPS), pH 7,4, 100 mM NAcl).
    2. Centrifugera den uppsamlade supernatanten med uttryckt protein med hög hastighet (14 tusen g under 10 min) för att avlägsna eventuellt kvarvarande cellrester. Samla genom dekantering till ett nytt rör. Kasta pelleten som biologiskt.
    3. Samla en 10 ul alikvot av supernatanten och dessutom samla ett litet prov på varje proteinreningssteg för att analysera provet med SDS-PAGE (beskrivs i avsnitt 5). Ladda den klarnade supernatanten och samla flödet genom.
    4. Tvätta kolonnen med 3 kolonnvolymer av buffert A och eluera proteinet med 5-kolonnvolymer av 100 mM glycin, pH 3,0. Samla upp eluatet i rör innehållande en-halv volym av 1 M Tris-buffert, pH-värde av 8,0 för att snabbt neutralisera pH-värdet.
    5. Tvätta kolonnen med 10 kolonnvolymer av buffert A och lagra för framtida bruk.
    6. Buffert utbyta det eluerade proteinet med åtminstone en 10-faldigt överskott av buffert A med 10 kDa molekylviktsgräns centrifugalfilter. Obs! Ta inte koncentrera eluerade provet tillen mycket låg volym (<2 ml) i den eluerade bufferten. Använd centrifugalfilter för att byta ut bufferten med buffert A.
    7. Butiks renat protein vid 4 ° C tills nästa användning.
      Obs: Protein uttryckt i supernatanten kan renas genom affinitetskolonner som valts ut på basis av proteinets egenskaper eller användning av affinitetsmarkörer. För en typisk reningsförfarande, protein A-kolonn kan användas för IgG eller Fc-fragment eller nickelkolonn kan användas för proteiner som uttrycks med en poly-histidinmarkör. Här är en beskrivning av reningsstegen för IgG1-Fc-med användning av en protein A-kolonn.

    5. Analys av protein genom SDS-PAGE

    1. Späd alikvoter (7,5 | il) av varje prov med en lika stor volym av 2x laddningsbuffert (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-merkaptoetanol, 20% glycerol och 0,01% bromfenolblått).
    2. Koka blandningen vid 90 ° C under 5 min med användning av ett värmeblock eller vattenbad. Centrifugera proverna vid 10.000 g for 1 minut. Ladda beredda gelén med 5 pl av markörprotein och 14 pl av prover för analys med hjälp av en 20 l pipett med en engångsspets.
    3. Kör en gel på 25 milliampere under 60 min. När elektroforessteget är fullständigt, överföra gelén till en behållare med en liter vatten och mikrovågsugn i 5 min.
    4. Fläck gelén med färglösningen (40% etanol, 10% ättiksyra och 0,1% Coomassie Brilliant Blue) för 2 timmar och avfärgning i vatten.

    6. glykanema Analys med masspektrometri

    1. Analysera glykaner som beskrivits tidigare 44. I korthet var 75 pg av IgG1-Fc trypsin, behandlades därefter av PNGasF för frisläppandet av glykaner 45. Frigjorda glykanerna permetylerad och analyserades genom användning av matris-assisterad laser-desorptions jonisering time-of-flight-masspektrometri (MALDI-TOFMS).

    7. Protokoll Justeringar för särskilda scenarier

    1. Märkning av proteiner med 15 N-märkt aminosyror (för en 50 ml transfektion volym)
      1. Dispensera 5 mg av varje aminosyra till en enda steril glasflaska. Resuspendera med 4 ml autoklaveras vatten (observera Tyr inte helt lösa, till skillnad från Lys och Phe). Sterilisera lösningen genom autoklavering vid 121 ° C under 15 minuter. Låt lösningen svalna approximativt till 50-60 ° C.
      2. För en 50 ml transfektion volym, följ steg 3.1.3 enligt "3.1 Upprättande av en transient transfektion". Se kompletterande material sektionen för ett exempel med lämpliga volymer.
      3. För transfektion, följa stegen i "3. Upprättande av en transient transfektion" med färskt odlingsmedium ersättas med märkta aminosyrarester som framställts ovan.
      4. Efter 24 h av transfektion, på dagen för odlingsutspädning, återkalla 5,0 ml förvärmd medium B, 40 ml förvärmt medium A och en nyligen autoklaveras 4 ml alikvot av aminosyrablandningen (framställd såsom i steg 7.1.1. Ovan) och tillsätt enml förvärmd stamlösning av VPA-lösning för framställning av 50 ml färskt utspädningsodlingsmedium med en slutlig koncentration av 4,4 mM av VPA. Lägg till detta medium till transfektion kulturen med en steril serologisk pipett.
      5. Överför den transfekterade kulturen i biosäkerhet skåpet efter sterilisering det yttre av kolven med en 70% etanol i vattenlösning, tillsätt den preparerade utspädningsmediet och överföra kolven tillbaka till den inkuberade skak.
        Anm: Medium A är ett kemiskt definierat, serumfritt medium. Sålunda är det möjligt att framställa en annan formulering. Kontakta leverantören för att få en anpassad Medium Ett preparat som saknar vissa aminosyror. Det är möjligt att ha alla aminosyror lämnas ut, men vi föredrar att använda medium som saknar endast fåtal utvalda rester eftersom en komplett dropout mediet skulle kräva justering av osmolaritet efter tillskott. Vi valde en Lys-Tyr-Phe bortfall medium som kan kompletteras och kräver inte osmolaritet justering. Furthermore, Medium En leverantör inte fritt dela koncentrationerna av mediumkomponenter; vi använde 100 mg / L vardera för Lys, Tyr och Phe med framgång. Volymer av transfektion och uttryck mediet måste justeras för att redogöra för de tillsatta aminosyror. Här är de justeringar av protokollet ovan för isotopmärkning
    2. Komplettera Transfektion med en liten molekyl
      1. Bered 100 mM stamlösning av 2-deoxi-2-fluor-l-fukos användning autoklaveras vatten och sterilisera denna lösning med användning av ett 0,22 pm filter.
      2. För en 50 ml kultur, tillsätt 125 pl (vid 250 iM) av fukos analog lösning på transfektion och utspädnings media. Observera: Vi försummat att utföra någon ytterligare justering volymen eftersom tillsats substituenten vid denna koncentration utgör endast 0,25% av den totala odlingsvolymen .Det är möjligt att modifiera uttrycket med hjälp av små molekylinhibitorer av glykan bearbetning. Här beskriver vi förutsättningar för att inkludera 2-deoxi-2-fluor-l-fukos, en inhibitor av glykan fukosylering. Vi fann> 90% reduktion i fukosylering genom tillsats av fukos analogen vid en koncentration av 250 pM i transfektionen och utspädningsmedia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hög nivå proteinuttryck och renhet

Detta optimerade expressionssystem genereras ett högt utbyte av glykosylerade proteiner. Ett typiskt mönster är visad i uttrycket av lgG1-Fc (Figur 1). I detta fall är Dag 0 transfektion dag följt av dag 1 (spädning) och efterföljande odlingsdagar till och med dag 5. Proteinexpression analyseras med användning av löslig uttryckning fraktionen i råmediet. En mycket liten mängd protein uttryckning observerades i dag en som odlings alikvot uttogs 3 h efter odling utspädning. Detta är lättare att visualisera med GFP-märkta proteiner som uppvisar en distinkt grön färg i odlingsmediet. En sådan ökning observerades i uttrycket av GFP-FcγRIIIa och GFP-ST6GalI från dag 2 till dag 5. Ingen signifikant ökning i uttrycket observerades mellan dag 4 och dag 5. På dag 5, cellerna var <50%livskraftig och därmed kultur skördades att begränsa proteolys. Affinitetsrening med användning av en protein A-kolonn för IgG1 Fc eller nickelkolonn för GFP-FcγRIIIa gav proteiner med hög renhet (> 99%; Figur 2), utbyte (tabell 1) och fullständig glykosylering (data ej visade).

15 N eller 13 C isotopmärkning av proteiner och glykaner

Detta system effektivt uttryckt isotopberikade IgG1 Fc enligt den beskrivna protokollet. Även om en liten minskning av proteinutbytet observerades (25-50%), var väl spridda signalerna ses i en 2d NMR-spektrum som korrelerar resonansfrekvensen 1 H-atomer och direkt bundna amiden 15 N-atomer (Figur 3). Denna uttrycksnivå medger effektiv produktion protein på den omfattning som krävs för strukturbaserade studier (typiskt 2-20mg protein) och illustrerar den framgångsrika inkorporeringen av de märkta isotoper i proteinet. Den höga graden av likhet mellan detta spektrum och publicerade spektra indikerar en hög grad av proteinmärkning inträffade med minimal kodning av de 15 N etiketterna 43.

Producerar proteiner med olika N-glykaner

Olika glykoformer producerades med HEK293F och HEK293S celler. Matris-assisterad laserdesorptionsjonisering masspektrometri (MALDI-MS) analyser av de enzymatiskt frigjorda N-glykaner visade de förväntade glykoformer (Figur 4). Proteiner uttryckta från HEK293S celler hyste N-glykaner som var Människans 5 GlcNAc 2 formulär och innehöll ingen fukos (Figur 4). Glykaner från HEK293F uttryckt material var komplext-typ, biantennary former med kärn fukos och oftast med terminalN-acetylglukosamin (GlcNAc) eller liten andel av mono- eller di-galaktosylerade (Gal) former. Även om det inte är känt vad infödda N-glykaner av ST6GalI och FcγRIIIa är, glykanen profil för IgG1 Fc mycket lik IgG1 Fc renas från humant serum 46. De stora skillnaderna bland annat graden av modifiering; IgG1 Fc från humant serum visar en högre grad av galaktosylering än vad som observerats för HEK293F uttryckning. Tillsats av 2-deoxi-2-fluor-l-fukos, en inhibitor av glykanen fukosylering, till en uttrycks utförts med hjälp av HEK293F cellinjen uppvisade en dramatisk> 90% minskning av fukos inkorporering (Figur 4).

Figur 1
Figur 1: höga utbyten av rekombinanta proteiner utvinnes genom att uttrycka från pGEn2 vektorn. (A - B) Två uttryck vectors användes i denna studie alstrades från en pIBI30 plasmid som innehåller en amp ^ kassett och en E. coli-replikationsursprung. (C) expressionsnivån av det utsöndrade lgG1 Fc-protein efter transient transfektion av HEK293F celler. SDS-PAGE-analys visar ackumuleringen av uttryckta proteiner från dag 0 till dag 5 och indikeras med pilen. Klicka här för en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Återvinning av uttryckt protein från odlingsmediet. (A) IgG1-Fc, (B) GFP-FcγRIIIa. "Medium" hänvisar till odlingsmedium efter centrifugering; FT = flödet genom fraktionen från kolonnen rening. SDS-PAGE-prover är pr epared i icke-reducerande betingelser utan β-merkaptoetanol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Aminosyra selektiv märkning av IgG1 Fc 1 H- 15 N hetero enda kvantkoherens spektrum av [15 N-Tyr, 15 N-Lys] -märkt IgG1 Fc uttryckas med HEK293F celler i anpassade Medium A kompletterat med (15 N ) märkt L-Tyr och L-Lys. Crosspeaks tilldelades baserat på tidigare rapporter 43,47. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

_upload / 53568 / 53568fig4.jpg "/>
Figur 4:. Proteinexpression i närvaro av småmolekylära modulatorer av glykan komposition N-glycan profiler av IgG1 Fc uttrycktes i HEK293-celler med användning av olika odlingsbetingelser. Den översta spektrat framställdes med användning glykaner isolerade från IgG1 Fc uttryckt i HEK293S celler. Mitt spektrumet avslöjar lgG1 Fc glykoformer från material uttryckt i HEK293F celler och botten spektrum framställdes på liknande sätt förvänta celler odlades i närvaro av en inhibitor av BNP-fukos biosyntes, 2-deoxi-2-fluor-l-fukos. N-glykaner presenteras som tecknade diagram efter CFG konventionen 5: N acetylglukosamin (GlcNAc), blå rutor; Mannos (Man), gröna cirklar; Fukos (Fuc) röda trianglar; Galaktos (Gal), gula cirklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

<tbody>
Protein Utbyte (mg / I)
IgG1 Fc 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

Tabell 1: Utbyte av olika proteiner uttryckta i HEK293F celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll illustrerar proteinexpression via transient transfektion av HEK293F eller S-celler. De optimala transfektion villkoren i Barb och Moremen Labs anställa en kritisk kombination av celltäthet och reagenskoncentrationer för att uppnå hög effektivitet transfektion. Kritiska överväganden vid genomförandet av detta protokoll inkluderar: att upprätthålla en stabil kultur före transfektion (med konsekvent kultur fördubbling gånger); transfektion av aktivt växande celler (till följd av utspädning celler till 1 x 10 6 celler / ml 24 h före transfektion) med cellviabilitet större än 95%; celltäthet vid transfektion bör vara mellan 2,5 till 3,0 x 10 6 levande celler / ml med en viabilitet> 95% (transfektion densiteten) i en odling innehållande 90% medium A och 10% medium B; och med tillägget DNA före PEI tillsats vid 3 | ig / ml och 9 ^ g / ml, respektive 31; vid 24 h efter transfektion odlingen späds 1: 1 i medium containing 4,4 mM valproinsyra för att resultera i en koncentration av 2,2 mM valprioc syra i den utspädda kulturen; produktionsfasen tillväxten fortsätter sedan i en fuktad skakkolv vid 37 ° C och 8% CO2 under ytterligare 4-5 dagar. Vektorn som beskrivs här är optimerad och ett viktigt särdrag hos det lösliga proteinexpressionssystemet 32,42.

Om ett målprotein misslyckas med att uttrycka, i tillägg till de faktorer som anges ovan, kan flera andra variabler bidra till låga utbyten. Se till att proteinkodande DNA-sekvensen innehåller kodon optimerade för mänskliga celler. Detta kan bedömas med flera online-resurser. Sterilitet under hela förfarandet är av största vikt. En aktivt växande och ren kultur av HEK293F celler ska visas något kornig för blotta ögat, och mediet bör vara mestadels klart (i synnerhet vid celldensiteter <1,0 x 10 6 celler / ml).

Kulturer kontaminerade med bakterier eller svamp böromedelbart bort för att förhindra spridning. Är det viktigt att upprätthålla en hälsosam stamkultur. Detta uppnås genom att ympa dessa kulturer vid ett celler densitet av 0,3 x 10 6 celler / ml. Lägre ympning tätheter kan bromsa tillväxten genom att begränsa utbudet av olika tillväxtfaktorer som krävs för celltillväxt och delning 48. Som kulturer har passe för mer än 25 eller 30 gånger, observerades en minskning i uttryck observerats. Av denna anledning, passe kulturer mer än 30 gånger kastas.

Det är möjligt proteinet försämras i expressionsmedium, eller uttrycket tidsram är för lång, vilket leder till proteinnedbrytning. Av dessa skäl är det rekommenderar att övervaka kultur livskraft och proteinuttryck vid varje dag för att bestämma en optimal expression tidsram. Det är viktigt att rena proteiner så snabbt som möjligt efter skörd mediet. För vissa proteiner, är det bra att ta med proteashämmare During rening. Totalt har dessa justeringar förbättrat utvinning av proteiner i Barb och Moremen labs 42,43.

Den övergående transfektion av HEK293-celler har visat stor nytta för att producera lösliga proteiner och proteindomäner som är naturligt inriktade på den sekretoriska vägen. Det är troligt att produktion av cytoplasmatiska eller integralmembranproteiner kommer att kräva ytterligare optimering. En primär fördel med detta system är de infödda substrat och maskiner för proteinproduktion är närvarande och tillgänglig i HEK293-celler 49. Detta står i stor utsträckning till dess fördelar jämfört med andra rekombinanta proteinproduktionsmetoder såsom bakterier med ingen eller begränsad post-translationella modifieringar, eller jäst och bakulovirussystem med korrekt veckat men olika N-glycoforms inkorporerade 1,50,51.

Dessutom det protokoll som beskrivs här visar den extra förmåga att inkludera lågmolekylära compounds såsom märkta aminosyror, märkt glukos eller små molekyler som syftar till att modifiera N-glykan komposition. De HEK293-celler visar också skickliga på uttryck av icke-däggdjursproteiner, inklusive växtenzymer och stöder samuttryck av flera polypeptider för återvinning av proteinkomplex (data visas ej).

Den strukturella och funktionella karakterisering av glykoproteiner ofta hindras av provproduktionsutmaningar. Proteinexpressionssystemet som beskrivs här surmounts denna nackdel genom att utföra posttranslationella modifieringar med användning av naturligt komplement av sofistikerade intracellulära glykan bearbetningsenzymer 6. Denna robusta och enkelt protokoll är bevisat för övergående transfektion av fjädring humana HEK293-celler. Denna metod visade signifikant glykoprotein utbyte (> 95 mg / L) med tre N-glykosylerade proteiner och rymmer kosttillskott såsom märkta aminosyrarester eller små molekyler kemiska inhibitor 2-deoxi-2-fluor-l-fukos. De uttryckta glykoproteiner kan nyskapad ytterligare efter rening för att framställa ett brett spektrum av definierade glykoformer 52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöds ekonomiskt av bidragen K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) och P01GM107012 (KWM) från National Institutes of Health, och genom medel från Roy J. Carver Institutionen för biokemi, biofysik och molekylärbiologi vid Iowa State University . Innehållet i detta arbete är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Tags

Cellbiologi glykoprotein immunglobulin G Fc receptor rekombinanta proteiner mänsklig HEK293F och HEK293S celler

Erratum

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Hög Utbyte Expression av rekombinanta humana proteiner med transient transfektion av HEK293 celler i suspension
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter