Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

High Yield Expression av rekombinant humant Proteiner med Transient Transfeksjon av HEK293 Celler i Suspension

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

Kunsten å produsere rekombinante proteiner med komplekse post-translasjonelle modifikasjoner er en stor utfordring for studier av struktur og funksjon. Den raske etableringen og høy utvinning fra forbigående-transfekterte pattedyrcellelinjer løser denne barrieren, og er et effektivt middel for å uttrykke proteiner som er naturlig kanaliseres gjennom ER og Golgi-mediert sekresjonsveien. Her er en protokoll for protein uttrykk ved hjelp av menneskelig HEK293F og HEK293S cellelinjer transfektert med en pattedyrekspresjonsvektor designet for høye proteinutbytter. Anvendeligheten av dette systemet er vist ved bruk av tre representative glykoproteiner som uttrykt med utbytter mellom 95 til 120 mg av renset protein utvunnet pr liter kultur. Disse proteinene er den humane FcγRIIIa og rotte α2-6 sialyltransferase, ST6GalI, begge uttrykt med et N-terminalt fusjons GFP, samt umodifiserte humant immunglobulin Fc G1. Denne robuste system utilizes et serumfritt medium som kan tilpasses for ekspresjon av isotopisk anrikede proteiner og karbohydrater for strukturelle studier ved hjelp av massespektrometri og kjernemagnetisk resonansspektroskopi. Videre kan sammensetningen av N-glykan være innstilt ved tilsetning av et lite molekyl for å hindre at visse sukker modifikasjoner på en måte som ikke reduserer utbyttet.

Introduction

Produsere høy avkastning av riktig brettet og post-translasjonelt modifiserte humane proteiner for detaljert analyse av struktur og funksjon er fortsatt en betydelig utfordring. Et stort antall ekspresjonssystemer er tilgjengelige som produserer rekombinante proteiner med naturlig-lignende funksjon og virkemåte. Bakterielle ekspresjonssystemer, hovedsakelig Escherichia coli-stammer, representerer de mest tilgjengelige og vanlige verktøy i forskning arenaen, på grunn av enkelheten i slike ekspresjonssystemer, skjønt gjær, planter, insekter og pattedyrsystemer er også beskrevet 1-4. Men de fleste av disse systemene er i stand til hensiktsmessige post-translasjonell modifikasjon av målproteinene. En grunnleggende interesse av Barb og Moremen laboratorier produserer eukaryote proteiner med passende glykosylering. Mange menneskelige proteiner kreve egnet glykosylering for riktig funksjon (se 5).

Den eukaryoteglykosylering maskiner er omfattende og i stand til å lage et variert utvalg av modifikasjoner, inkludert både asparagin (N) - og serin / treonin (O) -bundne komplekse glykaner 6. Det er anslått at> 50% av humane proteiner er N-glykosylert 7. Glykaner er essensielle komponenter av mange proteiner inkludert terapeutiske monoklonale antistoffer, erytropoietin og blodkoaguleringsfaktorer som faktor IX, for å nevne noen. Selv om flere metoder finnes for å forberede hensiktsmessig N-glykosylert proteiner og spenner fra rent syntetisk 8-10, til chemoenzymatic 11-14 eller utvinning fra konstruerte rekombinante systemer 15-20, ikke overraskende, har menneske ekspresjonssystemer så langt vist seg å være den mest robuste metoder for å generere humane proteiner.

Mange terapeutiske humane glykoproteiner produsert i rekombinante systemer ved bruk av pattedyrceller. Systemer av notatet er den kinesiske hamsterovarium (CHO), mus myelom (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), Human Embryonic Nyre (HEK-293) og menneske retinal cellelinjer som er ansatt i adhesjon eller suspensjon kultur for proteinproduksjon 4,21,22. Imidlertid har pattedyrprotein ekspresjonssystemer nødvendig å generere stabile cellelinjer, dyre vekstmedier og underlaget assistert transfeksjonsmidler prosedyrer 23.

Transfeksjon i pattedyrceller blir oppnådd ved hjelp av en rekke midler som omfatter kalsiumfosfater 24,25, kationiske polymerer (DEAE-dekstran, polybren, polylysin, polyethylimine (PEI)) eller positivt ladede kationiske liposomer 26-29. PEI er en polykationisk, ladet, lineær eller forgrenet polymer (25 kDa) 26 som danner et stabilt kompleks med DNA og endocytose. Ved surgjøring av endosomet, PEI er antatt å svelle, som fører til brudd av endosomer og frigjøring av DNA inn i cytoplasma 26,30.

Inntil nylig, transient transfeksjon i opphengningsi kultur ble utført ved forhånds DNA / PEI-kompleksdannelse, etterfulgt av tilsetning til cellekulturen 29. Men Würm og medarbeidere rapporterte en svært effektiv protokoll optimalisert for rekombinant proteinproduksjon i HEK293 celler som dannes en DNA / PEI kompleks in situ 31,32. Dette unngås fremstillingen, sterilisering av komplekset, og bufferbytte i et kulturmedium. Ytterligere optimalisering av blant annet uttrykk fremmende plasmider førte til betydelig avkastning øker 33. Heri er en metode som bygger på disse fremskrittene, og er bredt anvendelig. Expression forhold kan også endres for å påvirke N-glykan sammensetning.

Den HEK293S cellelinjen med et gen delesjon som stopper N-glykan prosessering på et mellomliggende trinn, fører til ekspresjon av proteiner med uniform N-glykaner som består av 2-N-acetylglucosaminrester pluss fem mannoserester (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Disse cellenemangler den N-acetylglucosaminyl transferase I (GntI) genet som er nødvendig for nedstrøms N-glykan prosessering 36,37. Bruken av glykosyltransferase-inhibitorer, inkludert kifunensine, sialinsyre-analoger og fucose analog og 2-deoksy-2-fluor-fukose har lignende virkninger og begrensninger N-glykan prosesserings 38-41.

Av protokollen angitt her benytter pGEn2 vektoren som vist i figur 1 42,43, PEI assistert forbigående transfeksjon inn i pattedyrcellelinjer (HEK293F eller HEK293S celler), og gjenvinning av høye utbytter av korrekt glykosylert protein. Dette systemet er robust og kan romme ulike faktorer, inkludert isotop merking og glykan teknikk for fremstilling av store titere av rekombinante proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen er tilstrekkelig for uttrykk ved hjelp av enten HEK293F eller HEK293S celler.

1. Cell Establishment

  1. Kultur Inoculation
    Merk: Alle kultur manipulasjon prosedyrer må utføres i en BSL-2 anlegg og hvert element bringes inn i biosikkerhet kabinettet må steriliseres ved sprøyting med 70% etanol i vann.
    1. Betjene risteinkubator ved 135 rpm, 80% fuktighet og 8,0% CO2 og 37 ° C. Slå "på" UV-lampen av biosikkerhet kabinettet minst en time før du arbeider. Prewarm de forseglede medium A og medium B flasker i vannbad ved 37 ° C i 1 time.
    2. Sterilisere 125 ml erlenmeyerkolbe vekst kolber med en ventilert cap, pipetter, pipetter, og forvarmet Media flasker ved sprøyting med 70% etanol i vann. Plassere disse elementene i biosikkerhet kabinettet. Merk: Steril bare den ytre plast dekker 125 ml erlenmeyerkolbe kultur kolbe, og deretter tar du bare når det jegs inne i biosikkerhet kabinettet.
    3. For en 30 ml kultur, ta ut 26 ml av medium A og 3 ml av Medium B (10% av den endelige kulturen) og overføre inn i 125 ml Erlenmeyer-kolbe og kulturen forsiktig blandes ved å riste (heretter betegnet som ferskt kulturmedium).
    4. Overføring ett hetteglass med celler som inneholder HEK293F celler, frosset ved -80 ° C, på is og gå til kultur rommet. Merk: HEK293F celler blir tilført ved en tetthet på 1 x 10 7 celler / ml.
    5. Varm hetteglasset forsiktig i vannbad ved 37 ° C for delvis å tine-celler (det tar omtrent ett minutt, og cellene bør ikke være helt tint). Steril utsiden av glasset med 70% etanol i vannløsning og flytte den inn i biosikkerhet kabinettet.
    6. Ved hjelp av en pipette ml, trekk cellesuspensjonen (ca. 0,7 ml) og overføre inn i 125 ml Erlenmeyer kolbe inneholdende 29 ml friskt kulturmedium. Lukk dekselet av kulturen kolbe og flytte den inn i inkuberes shaker.
    7. Cell Vedlikehold: Sjekk celletetthet, Livskraftig og Cell Passages
      1. Kontroller celler densitet etter 24 timers tining av kulturen ved å følge protokollen nedenfor. Note: Cellene dyrkes i 24 timer etter opptining for å sikre vesentlige celler vekst og levedyktighet på> 80%.
      2. Sterilisere kulturflaske med 70% etanol i vannløsning og flytte den inn i biosikkerhet kabinettet.
      3. Ved hjelp av en 1 ml pipette og pipetten, langsomt trekke tilbake 100 mL av suspensjonskultur og overføring til et sterilt 0,5 ml Eppendorf rør. Lukk og overføre kulturflaske tilbake i shaker så snart som mulig.
      4. Bland 7,5 pl av en trypanblått løsning med 7,5 ul celler. Det blandes kraftig med 7,5 pl av celle / Trypan blå blanding og overføre den til telle lysbildet.
      5. Slå på automatisk celleteller og plasser telling lysbilde i lasterommet. Den automatiske leseren er aktivert og cellene telles automatisk i enheteneav antall celler pr ml og levedyktighet prosent
      6. Bestemme volumet av donorkultur som kreves for overføring til et friskt kulturmedium på cellene tetthet på 0,3 x 10 6 levende celler / ml.
        Merk: Se et eksempel beregning i supplerende materialer.
      7. Gjenta trinn 1.1.2 og 1.1.3 av "1,1 Kultur Inoculation" protokoll over for å forberede materialer som kreves for fersk kulturmedium.
      8. Overfør Medium A (23 ml) og Medium B (3 ml) til en frisk 125 ml kulturflaske. Fjern aksje flasker Medium A og Middels B fra biosikkerhet kabinettet.
        Merk: Beholdning av medie flasker bør ikke oppbevares i biosikkerhet kabinettet samtidig som HEK 293F celler. Dette begrenser muligheten for forurensende aksjemellom flasker.
      9. Fjern det HEK293 cellekultur fra inkubatoren og spray med 70% etanol i vann. Ved hjelp av en ny pipette, trekke delmengde av celler (4 ml, ble dette volumet bestemmes i henhold to trinn 1.2.6) fra kulturen og overføre den til den kolbe som inneholdt friskt kulturmedium.
      10. Overfør begge kulturene fra biosikkerhet kabinett til inkubatoren shaker angitt i henhold til 1.1.1. Dyrke cellene til en tilnærmet tetthet på 2-3 x 10 6 levende celler / ml.
        Merk: En omtrentlig dobling tiden av cellene er 32 hr. Det tar 3-4 dager for å nå denne tetthet. Cellene inkuberes i 3-4 passeringer for å ha stabil vekstmønster av celler før den første transfeksjon.

    2. Forbered Materialer for Transfeksjon

    1. Forbereder HEK293 Cells (dag 1)
      1. Subkultur celler til en tetthet på 1 x 10 6 celler / ml i friskt medium B 24 timer før transfeksjon ifølge trinn 1.2.
        Merk: volumet av transfeksjon kultur vil være avhengig av antall celler. Større transfeksjon volumer (> 20 ml) vil kreve et større volum av kulturen på dette stadiet.
    2. Forbereder Stocks av Materials
      1. Forbered stamløsning av lineær polyetylenimin (PEI) ved en konsentrasjon på 1 mg / ml i en buffer inneholdende 25 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), og 150 mM NaCl (pH 7,5). Oppløse PEI helt; dette kan ta 30-60 minutter ved RT. Steriliser gjennom 0,22 mikrometer sprøyte filter og oppbevares ved -20 ° C for langsiktig bruk.
      2. Forbered sterile plasmid DNA (i henhold til trinn 2.2.2.1-2.2.2.4). Plasmidet konstruksjonen Fremgangsmåten er beskrevet andre steder 42. En kort prosedyre for DNA forberedelse er forklart her:
        1. Dyrke en kultur av kjemisk-kompetente Escherichia coli-celler transformert med vektoren pGEn2 i 1 liter LB-medium (Tryptone- 10 g / l, gjær utvinnes 5 g / l og natrium-klorid- 10 g / l) supplert med 100 ug / ml ampicillin. E. coli er dyrket ved 37 ° C i en ikke-fuktet, risteinkubator.
        2. Rens pGEn2 vektoren som koder for mål-DNA-plasmid i henhold til manufacturer DNA rensing protokollen.
        3. For å sikre fullstendig sterilitet plasmid DNA, utføre den endelige isopropanol nedbør og resuspensjon trinnene av DNA ekstraksjonsprosedyrer inne i biosikkerhet kabinettet.
        4. Legg volumet av isopropanol (spesifisert i plasmidet fremstillingen kit) til det eluerte DNA og sentrifuger ved 10.000 x g i 10 min. Steril utsiden av DNA beholderen med 70% ethanol i vannoppløsning og overføre det på innsiden av biosikkerhet skapet. Kast isopropanol supernatanten ved hjelp av en pipette og luft-tørke DNA pelleten. Når det er tørt, resuspender pelleten i sterilt 10 mM Tris-buffer, pH 8,0.
      3. Forbered stamløsning av 220 mM valproic (VPA) syre i vann og sterilisere ved passasje gjennom et sterilt 0,22 um filter. Oppbevar løsningen ved -20 ° C inntil videre anvendelse.

    3. Etablering av en Transient Transfeksjon

    1. Transfeksjon (dag 0)
      1. Kontroller mobiltettheten ved å følge trinn 1.2.2 via 1.2.5 av "1.2. Cell Vedlikehold" ovenfor. Bestemme mengden av celler for transfeksjon (2,5-3,0 x 10 6 levende celler / ml med levedyktighet> 95%). Se et eksempel beregning i supplerende materialer.
      2. Overfør volumet av suspensjonskulturceller beregnet i foregående trinn (her 67 ml) i et 250 ml sentrifugerør med en steril serologisk pipette. Samle celler ved sentrifugering i 5 min ved 100 x g.
      3. I mellomtiden forbereder en frisk transfeksjon dyrkingsmedium følgende trinn 1.1.3 i henhold til "1.1. Kultur Inoculation" ovenfor. Se Utfyllende materialer for en prøveberegning. Også overføring 5 ml friskt kulturmedium til et sterilt 15 ml rør og satt til side.
      4. Overføringsrørene som inneholder de pelleterte celler i biosikkerhet skapet etter sterilisering utsiden av rørene med 70% etanol i vann oppløsning, og bruk av en steril pipette til dekanter the supernatant bestående av brukt dyrkningsmedium.
      5. Kraftig resuspender de pelleterte cellene ved å pipettere opp og ned ved hjelp av 10 ml friskt kulturmedium, og overføring til kolben med friskt transfeksjon kulturmedium (fremstilt i trinn 3.1.3 over). Skru hetten på den ventilerte cellekulturkolbe og flytte kolben til inkubatoren (som beskrevet i 1.1.1) i 15 min-1 time med risting.
      6. I løpet av denne tid fortynnes plasmid DNA og PEI bestander med friskt kulturmedium (ved bruk av 5 ml volum trukket fra trinn 3.1.3 over) til en endelig konsentrasjon på 0,5 ug / ul. Se eksempelberegninger i supplerende materiale for å bestemme mengden av DNA og PEI. Overfør kulturflaske med de dispergerte celler i biosikkerhet kabinettet.
      7. Legg plasmid DNA (300 ul 0,5 ug / ul) til kulturen ved hjelp av mikro-pipette og bland ved forsiktig manuell risting. Legg PEI (900 ul av 0,5 mikrogram / mikroliter) til kulturen, bland ved forsiktig risting. Legg 3,8 ml frisk Culture medium, fra trinn 3.1.3, ovenfor, og overføre kolbe til inkubatoren risteapparat i 24 timer.
      8. Rengjør biosikkerhet skapet i henhold til punkt 1.1.
    2. Fortynning (Dag 1) (For en 50 ml transfeksjon volum)
      1. Inkuber den transfekterte kultur i 24 timer.
      2. Uttak 1 ml forvarmet 220 mM valproinsyre (VPA, fremstilt i henhold til trinn 2.2.3.) Med en steril 1 ml serologisk pipette og overføre den til et sterilt 50 ml rør.
      3. Uttak 5,0 ml forvarmet medium B og 44 ml forvarmet medium A og tilsett dette til VPA løsning ved hjelp av en steril pipette serologisk å fremstille 50 ml friskt kulturmedium med en sluttkonsentrasjon på 4,4 mM av VPA.
      4. Flytt transfektert kultur i biosikkerhet skapet etter sterilisering utsiden av kolben med en 70% etanolløsning i vann, tilsett den fremstilte fortynning mediet og overføre kolben tilbake til inkubert shaker.
    3. Uttrykk og Harvests (dager 2-6)
      1. Cellene inkuberes i ytterligere 4-5 dager (5-6 dager totalt etter transfeksjon).
      2. Trekk porsjoner av dyrkingsmedium følgende trinn 1.2.2. til 1.2.5. beskrevet i "1.2. Cell Maintenance" ovenfor med en steril 1 ml serologisk pipette, å overvåke celler levedyktighet og lagre porsjoner for å analysere protein uttrykk på hver dag ved SDS-PAGE (se § 5 nedenfor).
      3. Høste celler etter 5-6 dager ved sentrifugering av cellene pluss medium ved 1000 g i 5 min. I tillegg høste supernatanten hvis cellelevedyktigheten faller under 50% (se trinn 1.2.2-1.2.5).
      4. Hell av supernatanten som skal inneholde utskilt protein. Tilsett 5 ml av en 10% blekemiddel til HEK cellepellet og kast som en biologisk.

    4. Protein Purification

    1. Forbered en kolonne med 5 ml Protein-A sefarose. Ekvilibrer kolonnen med 5 kolonnevolumer av buffer A (20 mM 3- (N-morfolino) propansulfonsyre (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCll).
    2. Sentrifuger samles supernatanten med uttrykte proteiner ved høy hastighet (14.000 g i 10 min) for å fjerne eventuelle gjenværende cellerester. Samle ved dekantering inn et nytt rør. Kast pelleten som en biologisk.
    3. Samle en 10 ul alikvot av supernatanten og i tillegg samle en liten prøve på hvert proteinrensetrinn for å analysere prøven ved SDS-PAGE (beskrevet i avsnitt 5). Laster den klarede supernatant og samle strømningen gjennom.
    4. Vask kolonnen med 3 kolonnevolumer av buffer A og elueres proteinet med 5 kolonnevolumer av 100 mM glycin, pH 3,0. Samle eluatet i rør som inneholdt et halvt volum av 1 M Tris-buffer, pH-verdi på 8,0 for raskt å nøytralisere pH.
    5. Vask kolonnen med 10 kolonnevolumer av buffer A og lager for fremtidig bruk.
    6. Buffer bytte det eluerte protein med i det minste en 10-gangers overskudd av buffer A ved bruk av 10 kDa molekylvekt cut-off sentrifugal-filtere. Merk: Ikke konsentrere elueres prøven tilet meget lite volum (<2 ml) i den eluerte buffer. Bruk sentrifugale filtrene for å utveksle bufferen med buffer A.
    7. Lagres renset protein ved 4 ° C inntil neste gangs bruk.
      Merk: Protein uttrykt i supernatanten kan renses ved affinitetskolonner utvalgt på basis av protein-egenskaper eller bruk av affinitet koder. For en typisk renseprosedyre, Protein A kolonne kan brukes for IgG eller Fc fragmenter eller nikkel kolonne kan brukes til proteinene uttrykt med en poly-histidin merkelappen. Her er en beskrivelse av rensetrinnene for IgG1-Fc ved anvendelse av en protein A-kolonne.

    5. Analyse av protein ved hjelp av SDS-PAGE

    1. Fortynn de alikvoter (7,5 pl) av hver prøve med et likt volum av 2x ladningsbuffer (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-merkaptoetanol, 20% glyserol og 0,01% bromfenolblått).
    2. Kok blandingen ved 90 ° C i 5 min ved anvendelse av en varmeblokk eller vannbad. Sentrifuger prøver ved 10 000 g for 1 min. Laste forberedt gel med 5 mL av markør protein og 14 mL av prøver for analyser ved hjelp av en 20 mL pipette med en disponibel tips.
    3. Kjør én gel 25 milliampere i 60 min. Når elektroforese trinnet er fullført, overføres gelen til en beholder med en liter vann og mikrobølgeovn i 5 minutter.
    4. Flekk gelen med fargeløsning (40% etanol, 10% eddiksyre og 0,1% Coomassie brilliant blue) i 2 timer og destain i vann.

    6. Glykaner Analyse ved massespektrometri

    1. Analyser glykaner som tidligere beskrevet 44. I korthet, ble 75 ug av IgG1-Fc trypsinert, deretter behandlet ved PNGaseF for frigjøring av glykaner 45. Utgitt glykaner ble permethylated og analysert ved hjelp av matriks-assistert laser desorpsjons-ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOFMS).

    7. Protokoll Justering for Spesielle Scenarier

    1. Merking Proteiner med 15 N-merkede aminosyrer (for et 50 ml volum transfeksjon)
      1. Dispensere 5 mg av hver aminosyre i en enkelt sterile hetteglass. Suspender med 4 ml autoklaveres vann (merk Tyr ikke helt oppløse, i motsetning Lys og Phe). Steriliser oppløsningen ved autoklavering ved 121 ° C i 15 min. Tillat løsningen å avkjøles til omtrent 50-60 ° C.
      2. For en 50 ml transfeksjon volum, følg trinn 3.1.3 i henhold til "3.1 Etablering av en transient transfeksjon". Se Utfyllende Materialer seksjon for eksempel med passende volumer.
      3. For transfeksjon, følg trinnene i "3. Etablering av en transient transfeksjon" med ferske kulturmedium byttet ut med merkede aminosyreenheter som fremstilt ovenfor.
      4. Etter 24 timers transfeksjon av, på dagen for kultur fortynning, trekke tilbake 5,0 ml forvarmet medium B, 40 ml forvarmet medium A, og en fersk autoklavert 4 ml alikvot av aminosyreblandingen (fremstilt som i trinn 7.1.1. Ovenfor) og tilsett 1ml forvarmet stamløsning av VPA-løsning for å fremstille 50 ml friskt fortynning kulturmedium med en sluttkonsentrasjon på 4,4 mM av VPA. Legg dette mediet til kulturen transfeksjon ved hjelp av en steril serologisk pipette.
      5. Overfør den transfekterte kultur i biosikkerhet skapet etter sterilisering utsiden av kolben med en 70% etanolløsning i vann, tilsett den fremstilte fortynning mediet og overføre kolben tilbake til inkubert shaker.
        Merk: Medium A er en kjemisk definerte, serumfritt medium. Det er således mulig å fremstille en annen formulering. Kontakte leverandøren for å få en tilpasset Medium Et preparat som mangler visse aminosyrer. Det er mulig å ha alle aminosyrer utelatt, men vi foretrekker å bruke medium som mangler bare noen få utvalgte rester fordi en komplett dropout medium ville kreve justering av osmolaritet etter tilskudd. Vi valgte en Lys-Tyr-Phe frafall medium som kan bli supplementert og krever ikke justering av osmolaritet. FuVidere gir den Medium A leverandøren ikke fritt deler av konsentrasjonene av mellom komponenter; Vi brukte 100 mg / l for hver Lys, Tyr og Phe med suksess. Volumer av transfeksjon og ekspresjon medium må justeres for å ta hensyn til de tilsatte aminosyrer. Her er de justeringer av protokollen ovenfor for isotop merking
    2. Supplere Transfeksjon med et lite molekyl
      1. Forbered 100 mM stamløsning av 2-deoksy-2-fluor-l-fukose autoklaveres ved hjelp av vann og steriliseres oppløsningen ved hjelp av et 0,22 pM filter.
      2. For en 50 ml kultur, tilsett 125 ul (250 uM) av fucose analog løsning på transfeksjon og fortynning media. Merk: Vi forsømmer å utføre noen ytterligere volumjustering fordi tilsetning av substituenten ved denne konsentrasjonen utgjør bare 0,25% av det totale kulturvolum .Det er mulig å modifisere ekspresjon ved hjelp av lavmolekylære inhibitorer av glykan behandling. Her beskriver vi betingelsene for å inkludere to-deoxy-2-fluor-l-fukose, en inhibitor for glycan fucosylation. Vi fant> 90% reduksjon i fucosylation ved å tilsette fucose analog i en konsentrasjon på 250 uM i transfeksjonen og fortynning media.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Høy-nivå protein ekspresjon og renhet

Denne optimaliserte ekspresjonssystemet ga et høyt utbytte av glykosylerte proteiner. Et typisk mønster er vist i uttrykket av IgG1-Fc (Figur 1). I dette tilfellet, dag 0 er transfeksjon dag, etterfulgt av en dag (fortynning) og etterfølgende kultur dager opp til dag 5. Protein ekspresjon ble analysert ved hjelp av den oppløselige fraksjon uttrykket i råoljen medium. En svært liten mengde av protein-ekspresjon ble observert i dag 1 som kulturen prøve ble tatt ut etter 3 timers kultur fortynning. Dette er lettere å visualisere med GFP-merket protein som viser en tydelig grønn farge i kulturmediet. En slik økning ble observert etter i ekspresjon av GFP-FcγRIIIa og GFP-ST6GalI fra dag 2 til dag 5. Ingen signifikant økning i ekspresjonen ble observert mellom dag 4 og dag 5. På dag 5 ble cellene <50%levedyktig og dermed kultur ble høstet for å begrense proteolyse. Affinitetsrensing ved anvendelse av en protein A kolonne for lgG1 Fc eller nikkel kolonnen for GFP-FcγRIIIa resulterte i proteiner med høy renhet (> 99%; Figur 2), utbytte (tabell 1) og fullstendig glykosylering (data ikke vist).

15 N, eller 13 C-isotop merking av proteiner og glykaner

Dette systemet effektivt uttrykt isotopisk beriket IgG1 Fc ifølge den beskrevne protokollen. Selv en liten reduksjon i proteinutbytte ble observert (25-50%), var godt dispergert signaler sett i et 2D-NMR-spektrum som korrelerer resonansfrekvensen av 1 H-atomer, og er direkte bundet amid 15 N-atomer (figur 3). Dette nivået av uttrykk tillater effektiv proteinproduksjon på skalaen som kreves for strukturbaserte studier (typisk 2-20mg protein) og illustrerer en vellykket inkorporering av de merkede isotoper til proteinet. Den høye graden av likhet mellom dette spekteret og publiserte spektra indikerer en høy grad av protein merking skjedde med minimal scrambling av de 15 N etikettene 43.

Produserer proteiner med forskjellige N-glykaner

Ulike glykoformer ble produsert med HEK293F og HEK293S celler. Matriks-assistert laserdesorpsjon ionisering massespektrometri (MALDI-MS) analyser av enzymatisk utgitt N-glykaner viste de forventede glykoformene (figur 4). Proteiner uttrykt fra HEK293S celler næret N-glykaner som var av den Man 5 GlcNAc 2 skjema og inneholdt ingen fukose (figur 4). Glykaner fra HEK293F-uttrykt materialet var komplekse-type, dobbeltantenneformede former med kjerne fukose og stort sett å ha terminalN-acetylglukosamin (GlcNAc) eller liten andel av mono- eller galactosylerte (Gal) former. Selv om det ikke vet hva de innfødte N-glykaner av ST6GalI og FcγRIIIa er, er glykan profil for IgG1 Fc svært lik IgG1 Fc renset fra human serum 46. De største forskjellene inkluderer graden av modifisering; IgG1 Fc fra humant serum viser en høyere grad av galactosylering enn observert for HEK293F uttrykket. Tilsetning av 2-deoksy-2-fluor-l-fukose, en inhibitor for glykan fucosylation, til et uttrykk utført under anvendelse av HEK293F cellelinjen viste en dramatisk> 90% reduksjon i fucose inkorporering (figur 4).

Figur 1
Figur 1: Høye utbytter av rekombinante proteiner blir gjenvunnet ved å uttrykke fra pGEn2 vektoren. (A - B) To uttrykk vectors brukt i denne studien ble samlet inn en pIBI30 plasmid som inneholder en forsterker R kassett og en E. coli replikering opprinnelse. (C) Ekspresjon nivået av det utskilte IgG1 Fc protein etter transient transfeksjon av HEK293F celler. SDS-PAGE analyse viser opphopning av uttrykte proteiner fra dag 0 til dag 5 og indikeres av pilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Gjenoppretting av uttrykte protein fra kulturmediet. (A) IgG1-Fc, (B) GFP-FcγRIIIa. "Medium" refererer til kulturmediet etter sentrifugering; FT = strømnings gjennom fraksjonen fra rensekolonnen. SDS-PAGE-prøvene er pr epared i ikke-reduserende betingelser uten β-mercaptoetanol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Aminosyre selektiv merking av IgG1 Fc en H- 15 N heteronuclear enkelt quantum sammenheng spekter av [15 N-Tyr, 15 N-Lys] -merket IgG1 Fc uttrykkes ved hjelp HEK293F celler i tilpasset Medium A supplert med (15 N ) merket L-Tyr og L-Lys. Crosspeaks ble tildelt basert på tidligere rapporter 43,47. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

_upload / 53568 / 53568fig4.jpg "/>
Fig. 4: Protein-ekspresjon i nærvær av lavmolekylære modulatorer av glykan preparat N-glykan profiler av IgG1 Fc uttrykt i HEK293-celler ved hjelp av forskjellige dyrkningsbetingelser. Den øverste spekteret ble fremstilt ved bruk glykaner isolert fra IgG1 Fc uttrykt i HEK293S celler. Senteret spektrum viser de IgG1 Fc glykoformene fra materiale uttrykt i HEK293F celler og bunnen spektrum ble fremstilt på lignende måte forvente celler ble dyrket i nærvær av en inhibitor av GDP-fukose biosyntese, 2-deoksy-2-fluor-l-fukose. N-glykaner presenteres som tegneserie diagrammer følgende CFG konvensjonen 5: N- acetylglucosamine (GlcNAc), blå firkanter; Mannose (Man), grønne sirkler; Fukose (Fuc) røde trekanter; Galaktose (Gal), gule sirkler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

<tbody>
Protein Yield (mg / L)
IgG1 Fc 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

Tabell 1: Utbytte av forskjellige proteiner uttrykt i HEK293F celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen illustrerer protein uttrykk via transient transfeksjon av HEK293F eller S-celler. De optimale transfeksjonsmidler vilkårene fastsatt i Barb og Moremen labs ansette en kritisk kombinasjon av celletetthet og reagenskonsentrasjoner å oppnå høy effektivitet transfeksjon. Kritiske betraktninger når denne protokollen er: å opprettholde en stabil kultur før transfeksjon (med enhetlig kultur dobling ganger); transfeksjon av aktivt voksende celler (oppnådd ved fortynning av cellene til 1 x 10 6 celler / ml 24 time før transfeksjon) med cellenes levedyktighet større enn 95%; celletetthet ved transfeksjon bør være mellom 2,5 til 3,0 x 10 6 levende celler / ml med en levedyktighet> 95% (transfeksjon tetthet) i en kultur inneholdende 90% Medium A og 10% Medium B; og, tilsette DNA før PEI tilsetning på 3 ug / ml og 9 ug / ml, henholdsvis 31; ved 24 timer etter transfeksjon kulturen fortynnet 1: 1 i medium containing 4.4 mM valproinsyre å resultere i en konsentrasjon på 2,2 mM valprioc syre i den fortynnede kultur; produksjonsfasen veksten fortsetter deretter i en fuktig ristekolbe ved 37 ° C og 8% CO2 i ytterligere 4-5 dager. Vektoren som er beskrevet her er optimalisert, og et viktig trekk ved det løselige protein-ekspresjonssystem 32,42.

Hvis et målprotein unnlater å uttrykke, i tillegg til de faktorer som er nevnt ovenfor, kan flere andre variable bidrar til lave utbytter. Sikre proteinkodende DNA sekvens inneholder kodonene optimalisert for humane celler. Dette kan vurderes med flere elektroniske ressurser. Sterilitet hele prosedyren er det viktigste. En aktivt voksende og ren kultur av HEK293F cellene skal vises litt kornete for det blotte øye, og mediet skal være det meste klart (spesielt på celletettheter <1,0 × 10 6 celler / ml).

Kulturer som er kontaminert med bakterier eller sopp skalfjernes umiddelbart for å hindre spredning. Er det viktig å opprettholde en sunn lager kultur. Dette oppnås ved inokulering av disse kulturene ved et celler tetthet på 0,3 x 10 6 celler / ml. Lavere densiteter kan bremse inokulerings veksthastigheten ved å begrense tilførselen av forskjellige vekstfaktorer som er nødvendige for cellevekst og deling 48. Som kulturer har blitt dyrket i mer enn 25 eller 30 ganger, ble en nedgang i uttrykk observert. Av denne grunn kulturer passert mer enn 30 ganger kastes.

Det er mulig at proteinet blir degradert i uttrykket medium, eller uttrykket tidsramme er for lang, noe som fører til proteinnedbrytingen. Av disse grunner er det anbefalt å overvåke kultur levedyktighet og protein ekspresjon ved hver dag for å bestemme en optimal ekspresjon tidsramme. Det er viktig å rense proteiner så raskt som mulig etter høsting mediet. For noen proteiner, er det nyttig å ta med proteasehemmere During rensing. Totalt har disse justeringene økt utvinning av proteiner i Barb og Moremen laboratorier 42,43.

Transient transfeksjon av HEK293 celler har vist stor nytte for å produsere løselige proteiner og proteindomener som er naturlig rettet mot sekresjonsveien. Det er sannsynlig at produksjon av cytoplasmatiske eller integrerte membranproteiner vil kreve ytterligere optimalisering. Den viktigste fordelen med dette systemet er de innfødte underlag og maskiner for proteinproduksjon er til stede og tilgjengelig i HEK293 celler 49. Dette forklarer i stor grad til dens fordeler over andre produksjonsmetoder, rekombinant protein som bakterier uten eller med begrenset post-translasjonelle modifikasjoner, eller gjær og baculovirus-systemer med korrekt foldet, men forskjellige N-glykoformene innlemmet 1,50,51.

Videre protokollen beskrevet her viser dessuten mulighet til å inkludere lav molekylvekt compounds som merkede aminosyrer, merket glukose eller små molekyler som er utformet for å modifisere den N-glykan komposisjon. De HEK293-celler også vise seg dyktig til ekspresjon av ikke-pattedyrproteiner, blant annet plante enzymer, og støtter ko-ekspresjon av multiple polypeptider til gjenvinning av protein komplekser (data ikke vist).

Den strukturell og funksjonell karakterisering av glykoproteiner blir ofte hemmet av prøven produksjons utfordringer. Proteinet ekspresjonssystem er beskrevet her overvinner denne ulempe ved å utføre post-translasjonelle modifiseringer ved hjelp av naturlig supplement av sofistikerte intracellulære glykan prosesseringsenzymer 6. Dette robust og enkel protokoll er påvist for transient transfeksjon av henge menneskelige HEK293 celler. Denne metoden vist stort glykoprotein utbytte (> 95 mg / L) med tre N-glykosylerte proteiner og som har plass til kosttilskudd som er merket aminosyre-rester eller småmolekyl kjemiske inhibitor 2-deoksy-2-fluor-l-fukose. De uttrykte glykoproteiner kan bli ytterligere ombygd post-rensing for å forberede et bredt spekter av definerte glykoformer 52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansielt støttet av tilskuddene K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) og P01GM107012 (KWM) fra National Institutes of Health, og ved midler fra Roy J. Carver Avdeling for biokjemi, biofysikk og molekylær biologi ved Iowa State University . Innholdet i dette arbeidet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Tags

Cellular Biology glykoprotein immunoglobulin G Fc reseptor rekombinante proteiner human HEK293F og HEK293S celler

Erratum

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

High Yield Expression av rekombinant humant Proteiner med Transient Transfeksjon av HEK293 Celler i Suspension
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter