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Biology

निलंबन में HEK293 कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक के साथ पुनः संयोजक मानव प्रोटीन की उच्च उपज अभिव्यक्ति

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

जटिल बाद translational संशोधनों के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन की कला संरचना और समारोह के अध्ययन के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट स्तनधारी सेल लाइनों से तेजी से स्थापना और उच्च वसूली स्वाभाविक रूप से ईआर और गॉल्जी की मध्यस्थता स्रावी मार्ग के माध्यम से मोड़ा जाता है कि प्रोटीन व्यक्त करने का एक प्रभावी साधन इस बाधा के पते और है। यहां मानव HEK293F और उच्च प्रोटीन की पैदावार के लिए बनाया गया एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK293S सेल लाइनों का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल है। इस प्रणाली के लागू संस्कृति के प्रति लीटर बरामद शुद्ध प्रोटीन की 95-120 मिलीग्राम के बीच पैदावार के साथ व्यक्त की है कि तीन प्रतिनिधि ग्लाइकोप्रोटीन का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया है। ये प्रोटीन मानव FcγRIIIa और चूहे α2-6 sialyltransferase, ST6GalI, दोनों एक एन टर्मिनल GFP संलयन के साथ व्यक्त किया, साथ ही असंशोधित मानव इम्युनोग्लोबुलिन G1 एफसी हैं। इस मजबूत प्रणाली यूटीआईisotopically समृद्ध प्रोटीन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग संरचनात्मक अध्ययन के लिए कार्बोहाइड्रेट की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलनीय है कि एक सीरम मुक्त मध्यम lizes। इसके अलावा, एन glycan की रचना उपज को कम नहीं करता है एक तरह से निश्चित glycan संशोधनों को रोकने के लिए एक छोटा सा अणु जोड़कर देखते जा सकता है।

Introduction

संरचना और समारोह के विस्तृत विश्लेषण के लिए उचित रूप से मुड़ा और बाद translationally संशोधित मानव प्रोटीन की उच्च पैदावार उत्पादन एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है। अभिव्यक्ति प्रणाली की एक बड़ी संख्या में देशी की तरह कार्य और व्यवहार के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन है कि उपलब्ध हैं। खमीर, पौधे, कीट और स्तनधारी सिस्टम भी हैं 1-4 वर्णित हालांकि बैक्टीरियल अभिव्यक्ति की व्यवस्था, मुख्य रूप से कोलाई उपभेदों की वजह से इन अभिव्यक्ति प्रणालियों की सादगी के लिए, अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे सुलभ और आमतौर पर इस्तेमाल उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों के बहुमत लक्ष्य प्रोटीन की उचित बाद translational संशोधन के काबिल नहीं हैं। कंटिया और Moremen प्रयोगशालाओं की एक मौलिक ब्याज उचित ग्लाइकोसिलेशन साथ यूकेरियोटिक प्रोटीन का उत्पादन होता है। कई मानव प्रोटीन (5) के समुचित कार्य के लिए उचित ग्लाइकोसिलेशन की आवश्यकता होती है।

यूकेरियोटिकग्लाइकोसिलेशन मशीनरी व्यापक और दोनों asparagine (एन) सहित संशोधनों की एक विविध रेंज बनाने में सक्षम है - और सेरीन / threonine (ओ) जटिल ग्लाइकान 6 -linked। यह मानव प्रोटीन के> 50% 7 एन ग्लाइकोसिलेटेड हैं कि अनुमान है। ग्लाइकान कुछ ही नाम के कारक नौवीं की तरह चिकित्सकीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, erythropoietin, और रक्त के थक्के कारकों सहित कई प्रोटीन के आवश्यक घटक हैं। कई तरीकों को उचित एन ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन तैयार करने के लिए मौजूद हैं और 8-10 विशुद्ध रूप से सिंथेटिक से लेकर हालांकि, सबसे मजबूत होने के लिए आश्चर्यजनक रूप से, मानव अभिव्यक्ति प्रणालियों इस प्रकार अब तक सिद्ध कर दिया है नहीं इंजीनियर पुनः संयोजक सिस्टम 15-20, 11-14 से या वसूली chemoenzymatic को मानव प्रोटीन पैदा करने के लिए तरीके।

कई चिकित्सीय मानव ग्लाइकोप्रोटीन स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग कर पुनः संयोजक प्रणालियों में उत्पादित कर रहे हैं। नोट के सिस्टम चीनी हैम्स्टर अंडाशय (चो), माउस मायलोमा (NS0), बेबी हम्सटर kidne हैंवाई (बीएचके), मानव भ्रूण गुर्दे (HEK-293) और प्रोटीन के उत्पादन 4,21,22 के लिए आसंजन या निलंबन संस्कृति में कार्यरत हैं कि मानव रेटिना सेल लाइनों। हालांकि, स्तनधारी प्रोटीन अभिव्यक्ति सिस्टम स्थिर सेल लाइनों, महंगी विकास मीडिया और सब्सट्रेट सहायता प्रदान की अभिकर्मक प्रक्रियाओं 23 की पीढ़ी के लिए आवश्यक है।

स्तनधारी सेल अभिकर्मक कैल्शियम फॉस्फेट 24,25, cationic पॉलिमर (DEAE-dextran, polybrene, polylysine, polyethylimine (पी)) या सकारात्मक आरोप लगाया धनायनित लिपिड 26-29 सहित कई एजेंटों की सहायता से हासिल की है। पी एक polycationic का आरोप लगाया, रेखीय या डीएनए के साथ एक स्थिर जटिल रूपों और endocytosed है कि branched बहुलक (25 केडीए) 26 है। इंडो सोम की अम्लीकरण पर, पी कोशिका द्रव्य 26,30 में endosomes और डीएनए की रिहाई के संबंध विच्छेद करने के लिए अग्रणी, प्रफुल्लित करने के लिए सोचा है।

Suspensi में अभी हाल तक, क्षणिक अभिकर्मकसंस्कृति पर सेल संस्कृति 29 के अलावा द्वारा पीछा से पहले डीएनए / पी जटिल गठन के द्वारा किया गया था। हालांकि, wurm और सहकर्मियों सीटू 31,32 में एक डीएनए / पी जटिल है कि गठन के HEK293 कोशिकाओं में पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुकूलित एक अत्यधिक कुशल प्रोटोकॉल की सूचना दी। यह एक संस्कृति माध्यम में तैयार करने, परिसर की नसबंदी, और बफर विनिमय बचा। महत्वपूर्ण पैदावार बढ़ जाती है 33 करने के लिए नेतृत्व अभिव्यक्ति को बढ़ाने प्लास्मिडों शामिल करके आगे अनुकूलन। इस के साथ साथ इन अग्रिमों पर बनाता है और मोटे तौर पर लागू है कि एक विधि है। अभिव्यक्ति की स्थिति भी एन glycan संरचना को प्रभावित करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है।

एक मध्यवर्ती चरण में एन-glycan प्रसंस्करण रुकती है कि एक जीन विलोपन के साथ HEK293S सेल लाइन,,, (GlcNAc 2 आदमी 5) 34 2 एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन अवशेषों के अलावा पांच mannose अवशेषों से मिलकर वर्दी एन ग्लाइकान के साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए सुराग 35। इन कोशिकाओंएन acetylglucosaminyl ट्रांस्फ़्रेज़ मैं (GntI) नीचे की ओर एन glycan प्रसंस्करण 36,37 के लिए आवश्यक है, जो जीन की कमी है। kifunensine, सियालिक एसिड एनालॉगों और fucose एनालॉग और 2-Deoxy-2-फ्लोरो fucose सहित glycosyltransferase अवरोधकों का उपयोग इसी तरह के प्रभावों और एन glycan प्रसंस्करण 38-41 सीमा होती है।

प्रोटोकॉल यहां बताया चित्रा 1 42,43 के रूप में दिखाया pGEn2 वेक्टर का उपयोग करता है, पी सहायता प्रदान की क्षणिक स्तनधारी कोशिकाओं लाइनों (HEK293F या HEK293S कोशिकाओं) में अभिकर्मक, और उचित ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन की उच्च पैदावार की वसूली। इस प्रणाली को मजबूत है और पुनः संयोजक प्रोटीन की बड़ी titers के उत्पादन के लिए आइसोटोप लेबलिंग और glycan इंजीनियरिंग सहित विभिन्न कारकों को समायोजित कर सकते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल HEK293F या HEK293S कोशिकाओं या तो उपयोग अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त है।

1. सेल की स्थापना

  1. संस्कृति टीका
    नोट: सभी संस्कृति हेरफेर प्रक्रियाओं एक बीएसएल -2 सुविधा में किया जाना चाहिए और प्रत्येक आइटम पानी के घोल में एक 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा निष्फल होना चाहिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में लाया।
    1. 135 आरपीएम, 80% आर्द्रता पर इनक्यूबेटर प्रकार के बरतन प्रचालन और 8.0% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर। काम करने के लिए कम से कम 1 घंटे से पहले जैव सुरक्षा कैबिनेट की यूवी दीपक "" पर मुड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में सील मध्यम एक और मझौले बी बोतलें prewarm।
    2. पानी के घोल में 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा एक दिए टोपी, pipettes, pipettors, और prewarmed मीडिया की बोतलों के साथ 125 मिलीलीटर Erlenmeyer विकास बोतल जीवाणुरहित। जैव सुरक्षा कैबिनेट में इन वस्तुओं रखें। नोट: 125 मिलीलीटर Erlenmeyer संस्कृति कुप्पी को कवर केवल बाहरी प्लास्टिक जीवाणुरहित, और जब यह मैं तो केवल हटानेजैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर है।
    3. झटकों से मिश्रण (इसके बाद ताजा संस्कृति के माध्यम के रूप में कहा जाता है) धीरे से एक 30 मिलीलीटर संस्कृति के लिए, 26 मध्यम एक मिलीलीटर और मझौले बी के 3 मिलीलीटर (अंतिम संस्कृति का 10%) को वापस लेने और 125 मिलीलीटर Erlenmeyer संस्कृति फ्लास्क में हस्तांतरण और।
    4. बर्फ पर और संस्कृति कमरे में ले जाने -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए HEK293F कोशिकाओं, युक्त कोशिकाओं का स्थानांतरण एक शीशी। नोट: HEK293F कोशिकाओं 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर आपूर्ति की जाती है।
    5. (यह लगभग एक मिनट लगते हैं और कोशिकाओं को पूरी तरह thawed नहीं किया जाना चाहिए) को आंशिक रूप से कोशिकाओं पिघलना करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में धीरे शीशी को गर्म। पानी के घोल में 70% इथेनॉल के साथ शीशी के बाहर जीवाणुरहित और जैव सुरक्षा कैबिनेट में चलते हैं।
    6. 1 एमएल पिपेट का उपयोग, सेल निलंबन (लगभग 0.7 मिलीलीटर) को वापस लेने और ताजा संस्कृति के माध्यम से 29 मिलीग्राम से युक्त 125 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में हस्तांतरण। संस्कृति कुप्पी के कवर बंद और incubated प्रकार के बरतन में चलते हैं।
    7. सेल रखरखाव: सेल घनत्व, व्यवहार्यता और सेल मार्ग चेक
      1. नीचे प्रोटोकॉल का पालन करते हुए संस्कृति का विगलन के 24 घंटे के बाद कोशिकाओं घनत्व की जाँच करें। नोट: प्रकोष्ठों> 80% की आवश्यक कोशिकाओं के विकास और व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के विगलन के बाद 24 घंटे के लिए बड़े हो रहे हैं।
      2. पानी के घोल में 70% इथेनॉल के साथ संस्कृति कुप्पी जीवाणुरहित और जैव सुरक्षा कैबिनेट में चलते हैं।
      3. 1 मिलीलीटर पिपेट और pipettor का उपयोग, धीरे-धीरे एक बाँझ 0.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में निलंबन संस्कृति और हस्तांतरण के 100 μl वापस ले लें। बंद और जितनी जल्दी हो सके प्रकार के बरतन में वापस संस्कृति कुप्पी हस्तांतरण।
      4. कोशिकाओं के 7.5 μl के साथ एक Trypan ब्लू समाधान के 7.5 μl मिलाएं। सेल / Trypan नीले रंग के मिश्रण के 7.5 μl के साथ सख्ती मिश्रण और उनकी गिनती स्लाइड को हस्तांतरण।
      5. स्वचालित सेल काउंटर पर मुड़ें और लदान के चेंबर में गिनती स्लाइड जगह। ऑटो पाठक सक्रिय हो जाता है और कोशिकाओं इकाइयों में स्वचालित रूप से गिने जाते हैंमिलीलीटर और प्रतिशत व्यवहार्यता प्रति कोशिकाओं की संख्या की
      6. 0.3 एक्स 10 6 जीवित कोशिकाओं / एमएल की कोशिकाओं घनत्व में एक ताजा संस्कृति के माध्यम से हस्तांतरण के लिए आवश्यक दाता संस्कृति की मात्रा का निर्धारण करें।
        नोट: पूरक सामग्री में एक नमूना गणना देखें।
      7. दोहराएँ कदम 1.1.2 और बाद के संस्करण "1.1 संस्कृति टीका" प्रोटोकॉल के 1.1.3 ताजा संस्कृति के माध्यम के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करने के लिए।
      8. एक ताजा 125 मिलीलीटर संस्कृति फ्लास्क मध्यम एक (23 एमएल) और मझौले बी (3 एमएल) के स्थानांतरण। जैव सुरक्षा कैबिनेट से मध्यम एक और मझौले बी के शेयर बोतलें निकालें।
        नोट: मीडिया की बोतलों के स्टॉक्स HEK 293F कोशिकाओं के रूप में एक ही समय में जैव सुरक्षा कैबिनेट में नहीं रखा जाना चाहिए। यह शेयर मध्यम बोतलों को दूषित करने की संभावना को सीमित करता है।
      9. इनक्यूबेटर से HEK293 सेल संस्कृति निकालें और पानी के घोल में 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे। (4 मिलीलीटर कोशिकाओं के विभाज्य वापस लेने, एक नया पिपेट का उपयोग करना, इस मात्रा के अनुसार टी निर्धारित किया गया थाओ संस्कृति से कदम 1.2.6) और ताजा संस्कृति के माध्यम से युक्त कुप्पी को हस्तांतरण।
      10. 1.1.1 के अनुसार सेट इनक्यूबेटर प्रकार के बरतन करने के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट से संस्कृतियों दोनों स्थानांतरण। 2-3 एक्स 10 6 जीवित कोशिकाओं / एमएल की एक अनुमानित घनत्व के लिए कोशिकाओं को विकसित।
        नोट: कोशिकाओं की अनुमानित दुगनी समय 32 घंटा है। यह इस घनत्व तक पहुंचने के लिए 3-4 दिन का समय लगेगा। पहले अभिकर्मक करने से पहले कोशिकाओं के स्थिर विकास पैटर्न है करने के लिए 3-4 मार्ग के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।

    2. अभिकर्मक के लिए सामग्री तैयार

    1. HEK293 कोशिकाओं तैयारी दिवस (1)
      1. प्रायर अभिकर्मक के लिए ताजा माध्यम बी 24 घंटे में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व के उपसंस्कृति कोशिकाओं 1.2 कदम के अनुसार।
        नोट: अभिकर्मक संस्कृति की मात्रा कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर हो जाएगा। बड़ी अभिकर्मक संस्करणों (> 20 एमएल) के इस स्तर पर संस्कृति की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होगी।
    2. सेंट तैयारीसामग्री की ocks
      1. 25 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) और 150 मिमी NaCl (7.5 पीएच) युक्त एक बफर में 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में रेखीय पॉलीएथिलएमीन (पी) के शेयर समाधान तैयार है। पूरी तरह से पी भंग; इस आरटी पर 30-60 मिनट लग सकते हैं। लंबे समय तक इस्तेमाल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर और दुकान के माध्यम से जीवाणुरहित।
      2. (2.2.2.1-2.2.2.4 चरणों के अनुसार) बाँझ प्लास्मिड डीएनए तैयार करें। प्लाज्मिड निर्माण प्रक्रिया कहीं और 42 में वर्णित है। डीएनए की तैयारी के लिए एक संक्षिप्त प्रक्रिया यहाँ समझाया गया है:
        1. लेग माध्यम (Tryptone- 10 जी / एल, extract- 5 ग्राम / एल और सोडियम chloride- 10 जी / एल खमीर) के साथ पूरक 100 माइक्रोग्राम / का 1 एल में pGEn2 वेक्टर के साथ बदल रासायनिक सक्षम कोलाई कोशिकाओं की एक संस्कृति विकसित मिलीलीटर एम्पीसिलीन ई। कोलाई एक गैर humidified, मिलाते इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता है।
        2. मनु के अनुसार pGEn2 वेक्टर एन्कोडिंग लक्ष्य प्लाज्मिड डीएनए शुद्धfacturer के डीएनए शुद्धि प्रोटोकॉल।
        3. प्लास्मिड डीएनए की पूरी बाँझपन को सुनिश्चित करने के लिए, जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर डीएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं के अंतिम isopropanol वर्षा और मेजबान चरणों का प्रदर्शन।
        4. 10,000 एक्स पर eluted डीएनए और अपकेंद्रित्र (प्लाज्मिड तैयारी किट में निर्दिष्ट) isopropanol की मात्रा जोड़ें 10 मिनट के लिए जी। पानी के घोल में 70% इथेनॉल के साथ डीएनए कंटेनर के बाहर जीवाणुरहित और जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर यह हस्तांतरण। एक विंदुक का उपयोग करने और isopropanol सतह पर तैरनेवाला त्यागें डीएनए गोली हवा सूखी। एक बार सूखा, बाँझ 10 मिमी Tris बफर, 8.0 पीएच में गोली resuspend।
      3. पानी में 220 मिमी वैल्प्रोइक (VPA) एसिड का जायजा समाधान तैयार है और एक बाँझ 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित होने के द्वारा बाँझ। आगे उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर।

    3. एक क्षणिक अभिकर्मक की स्थापना

    1. अभिकर्मक दिवस (0)
      1. ऊपर "1.2। सेल रखरखाव" की 1.2.5 के माध्यम से कदम 1.2.2 का पालन करते हुए सेल घनत्व की जाँच करें। अभिकर्मक (व्यवहार्यता> 95% के साथ 2.5-3.0 एक्स 10 6 जीवित कोशिकाओं / एमएल) के लिए कोशिकाओं की राशि का निर्धारण करते हैं। पूरक सामग्री में एक नमूना गणना देखें।
      2. एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर एक 250 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पिछले चरण (यहां 67 एमएल) में गणना निलंबन संस्कृति कोशिकाओं की मात्रा स्थानांतरण। 100 x जी पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए।
      3. इस बीच, एक ताजा अभिकर्मक संस्कृति के माध्यम से ऊपर "1.1। संस्कृति टीका" के अनुसार कदम 1.1.3 निम्नलिखित तैयार करते हैं। एक नमूना गणना के लिए पूरक सामग्री देखें। इसके अलावा, एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब ताजा संस्कृति के माध्यम से हस्तांतरण 5 मिलीलीटर और अलग निर्धारित करें।
      4. पानी के घोल में 70% इथेनॉल के साथ ट्यूबों के बाहर स्टरलाइज़ और वें छानना करने के लिए एक बाँझ पिपेट उपयोग करने के बाद जैव सुरक्षा कैबिनेट में pelleted कोशिकाओं से युक्त हस्तांतरण ट्यूबखर्च की संस्कृति के माध्यम से मिलकर ई सतह पर तैरनेवाला।
      5. सख्ती pipetting और ताजा संस्कृति के माध्यम से और ताजा अभिकर्मक संस्कृति के माध्यम से फ्लास्क को हस्तांतरण के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर नीचे pelleted कोशिकाओं resuspend (ऊपर चरण 3.1.3 में तैयार)। दिए सेल संस्कृति फ्लास्क पर कैप भाड़ और झटकों के साथ 15 मिनट-1 घंटे के लिए (1.1.1 में सेट के रूप में) इनक्यूबेटर कुप्पी चलते हैं।
      6. इस समय के दौरान, डीएनए और 0.5 ग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए (ऊपर चरण 3.1.3 से वापस ले लिया 5 मिलीलीटर मात्रा का उपयोग) ताजा संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर पी शेयरों पतला। पूरक सामग्री में नमूना गणना डीएनए और पी की राशि का निर्धारण करने के लिए देखें। जैव सुरक्षा कैबिनेट में बिखरे कोशिकाओं के साथ संस्कृति कुप्पी स्थानांतरण।
      7. सूक्ष्म पिपेट का उपयोग संस्कृति के लिए प्लास्मिड डीएनए (0.5 माइक्रोग्राम / μl के 300 μl) जोड़ें और कोमल का मार्गदर्शन झटकों से मिश्रण। पी संस्कृति के लिए (0.5 माइक्रोग्राम / μl के 900 μl) जोड़ें, धीरे झटकों से मिश्रण। ताजा संस्कृति के 3.8 मिलीलीटर जोड़ें24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर प्रकार के बरतन के लिए ऊपर चरण 3.1.3, और हस्तांतरण कुप्पी से ऊपरी मध्यम,।
      8. 1.1 कदम के अनुसार जैव सुरक्षा कैबिनेट साफ करें।
    2. (एक 50 मिलीलीटर अभिकर्मक मात्रा के लिए) कमजोर पड़ने दिवस (1)
      1. 24 घंटे के लिए ट्रांसफ़ेक्ट संस्कृति सेते हैं।
      2. एक बाँझ 1 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग और एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण, (2.2.3 कदम के अनुसार तैयार किया। VPA) prewarmed 220 मिमी वैल्प्रोइक एसिड के 1 मिलीलीटर वापस ले लें।
      3. 5.0 prewarmed माध्यम बी के मिलीग्राम और prewarmed मध्यम एक 44 मिलीलीटर वापस लेने और VPA के 4.4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के साथ ताजा संस्कृति के माध्यम से 50 मिलीलीटर तैयार करने के लिए एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग VPA समाधान करने के लिए इस जोड़ें।
      4. , पानी के घोल में एक 70% इथेनॉल के साथ कुप्पी के बाहरी स्टरलाइज़ के बाद जैव सुरक्षा कैबिनेट में ट्रांसफ़ेक्ट संस्कृति ले जाएँ तैयार कमजोर पड़ने मध्यम जोड़ने और incubated प्रकार के बरतन में वापस कुप्पी हस्तांतरण।
    3. अभिव्यक्ति और हार्वेस्ट (दिन 2-6)
      1. (5-6 दिनों अभिकर्मक के बाद से कुल) एक अतिरिक्त 4-5 दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      2. कदम 1.2.2 निम्न मध्यम संस्कृति की aliquots वापस ले लें। 1.2.5 करने के लिए। एसडीएस पृष्ठ से प्रत्येक दिन में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए aliquots कोशिकाओं व्यवहार्यता पर नजर रखने और बचाने के लिए, एक बाँझ 1 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर ऊपर ", 1.2। सेल रखरखाव" में वर्णित (नीचे, धारा 5 देखें)।
      3. 5 मिनट के लिए 1,000 ग्राम पर कोशिकाओं के साथ साथ मध्यम centrifuging द्वारा 5-6 दिनों के बाद हार्वेस्ट कोशिकाओं। सेल व्यवहार्यता नीचे 50% (चरण देखें 1.2.2-1.2.5) गिर जाता है तो इसके साथ ही, तैरनेवाला फसल।
      4. स्रावी प्रोटीन शामिल होंगे कि सतह पर तैरनेवाला डालो। HEK सेल गोली के लिए एक 10% ब्लीच के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक biohazard रूप त्यागें।

    4. प्रोटीन शुद्धीकरण

    1. प्रोटीन एक sepharose के 5 मिलीलीटर के साथ एक स्तंभ तैयार करें। बफर (3 से 20 मिमी (5 स्तंभ संस्करणों के साथ स्तंभ संतुलित करना एन morpholino) propanesulfonic एसिड (MOPS), पीएच 7.4, 100 मिमी एनएसीएल)।
    2. किसी भी शेष सेल मलबे को हटाने के लिए उच्च गति (10 मिनट के लिए 14,000 छ) पर व्यक्त प्रोटीन के साथ एकत्र सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। एक ताजा ट्यूब में decanting द्वारा लीजिए। एक biohazard के रूप में गोली त्यागें।
    3. सतह पर तैरनेवाला की एक 10 μl विभाज्य लीजिए और अतिरिक्त एसडीएस पृष्ठ से नमूना विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक प्रोटीन शुद्धि कदम पर एक छोटा सा नमूना इकट्ठा (धारा 5 में वर्णित)। स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला लोड और के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा।
    4. बफर के 3-स्तंभ संस्करणों के साथ स्तंभ धो लें और 100 मिमी ग्लाइसिन, पीएच 3.0 से 5-स्तंभ संस्करणों के साथ प्रोटीन elute। तेजी से पीएच बेअसर करने के लिए एक से डेढ़ 1 एम Tris बफर की मात्रा 8.0 के पीएच युक्त ट्यूबों में eluate लीजिए।
    5. भविष्य में उपयोग के लिए बफर एक और दुकान के 10 कॉलम के संस्करणों के साथ स्तंभ धो लें।
    6. बफर का उपयोग कर 10 केडीए आणविक वजन कट ऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर बफर के कम से कम 10 गुना अतिरिक्त के साथ eluted प्रोटीन का आदान-प्रदान। नोट: करने के लिए eluted नमूना क्या ध्यान नहीं हैएक बहुत ही कम मात्रा eluted बफर में (<2 मिलीलीटर)। बफर ए के साथ बफर का आदान-प्रदान करने के लिए केन्द्रापसारक फिल्टर का प्रयोग करें
    7. स्टोर अगले उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन शुद्ध।
      नोट: सतह पर तैरनेवाला में व्यक्त प्रोटीन प्रोटीन के गुणों के आधार या आत्मीयता के टैग के उपयोग पर चयनित आत्मीयता कॉलम द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। एक ठेठ शोधन प्रक्रिया के लिए, एक प्रोटीन स्तंभ एक पाली हिस्टिडीन टैग के साथ व्यक्त प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आईजीजी या एफसी टुकड़े या निकल स्तंभ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इधर, एक प्रोटीन एक स्तंभ का उपयोग IgG1-एफसी के लिए शुद्धि चरणों का वर्णन है।

    एसडीएस पृष्ठ से प्रोटीन की 5. विश्लेषण

    1. 2x लोडिंग बफर (0.125 एम Tris, पीएच 8.0, 4% एसडीएस, 10% β-mercaptoethanol, 20% ग्लिसरॉल, और 0.01% bromophenol नीला) के एक बराबर मात्रा के साथ प्रत्येक नमूने की aliquots (7.5 μl) पतला।
    2. एक गर्मी ब्लॉक या नहाने के पानी का उपयोग कर 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण उबाल लें। 10,000 जी के लिए पर नमूने अपकेंद्रित्रआर 1 मिनट। मार्कर प्रोटीन के 5 μl और एक डिस्पोजेबल टिप के साथ एक 20 μl पिपेट का उपयोग विश्लेषण के लिए नमूने के 14 μl के साथ तैयार जेल लोड करें।
    3. 60 मिनट के लिए 25 milliamps में एक जेल चला। वैद्युतकणसंचलन कदम पूरा हो जाए, 5 मिनट के लिए पानी और माइक्रोवेव के 1 एल के साथ एक कंटेनर को जेल हस्तांतरण।
    4. पानी में धुंधला समाधान (40% इथेनॉल, 10% एसिटिक एसिड और 0.1% Coomassie खूब ब्लू) 2 घंटे के लिए और destain साथ जेल दाग।

    मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा 6. ग्लाइकान विश्लेषण

    1. पहले से 44 के रूप में वर्णित ग्लाइकान का विश्लेषण करें। संक्षेप में, IgG1-एफसी के 75 माइक्रोग्राम तो ग्लाइकान 45 की रिहाई के लिए PNGaseF द्वारा इलाज, trypsinized था। जारी ग्लाइकान permethylated और मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption आयनीकरण समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOFMS) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया।

    विशेष परिदृश्यों के लिए 7. प्रोटोकॉल समायोजन

    1. 15 एन के साथ प्रोटीन लेबलिंग(एक 50 मिलीलीटर अभिकर्मक मात्रा के लिए) एमिनो एसिड लेबल
      1. एक भी बाँझ कांच की शीशी में प्रत्येक अमीनो एसिड की 5 मिलीग्राम बांटना। पानी autoclaved 4 मिलीलीटर (पूरी तरह से लिस और पीएचई के विपरीत, solubilize नहीं है Tyr नोट) के साथ Resuspend। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा समाधान जीवाणुरहित। समाधान 50-60 डिग्री सेल्सियस तक लगभग शांत करने के लिए अनुमति दें।
      2. एक 50 मिलीलीटर अभिकर्मक मात्रा के लिए, "3.1 एक क्षणिक अभिकर्मक की स्थापना" के अनुसार कदम 3.1.3 का पालन करें। उचित मात्रा के साथ एक उदाहरण के लिए पूरक सामग्री अनुभाग देखें।
      3. अभिकर्मक के लिए, ऊपर तैयार के रूप में चिह्नित अमीनो एसिड के अवशेष के साथ प्रतिस्थापित ताजा संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर "3. एक क्षणिक अभिकर्मक की स्थापना" के कदम का पालन करें।
      4. अभिकर्मक के 24 घंटे के बाद, संस्कृति कमजोर पड़ने के दिन पर, prewarmed माध्यम बी के 5.0 मिलीलीटर, prewarmed मध्यम एक के 40 मिलीग्राम और अमीनो एसिड के मिश्रण का एक हौसले autoclaved 4 मिलीलीटर विभाज्य वापस लेने (कदम 7.1.1 के रूप में तैयार किया। इसके बाद के संस्करण) और 1 जोड़नेमिलीलीटर VPA के 4.4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के साथ नए सिरे से कमजोर पड़ने संस्कृति के माध्यम से 50 मिलीलीटर तैयार करने के लिए VPA समाधान के शेयर समाधान prewarmed। एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग अभिकर्मक संस्कृति को यह मध्यम जोड़ें।
      5. , पानी के घोल में एक 70% इथेनॉल के साथ कुप्पी के बाहरी स्टरलाइज़ के बाद जैव सुरक्षा कैबिनेट में ट्रांसफ़ेक्ट संस्कृति स्थानांतरण तैयार कमजोर पड़ने मध्यम जोड़ने और incubated प्रकार के बरतन में वापस कुप्पी हस्तांतरण।
        नोट: मध्यम एक एक रासायनिक परिभाषित, सीरम मुक्त माध्यम है। इस प्रकार, यह एक अलग सूत्रीकरण तैयार करने के लिए संभव है। कुछ अमीनो एसिड का अभाव है कि एक कस्टम मध्यम एक तैयारी प्राप्त करने के लिए आपूर्तिकर्ता से संपर्क करें। यह हालांकि, हम एक पूर्ण छोड़ने वालों मध्यम पूरकता के बाद परासारिता के समायोजन की आवश्यकता होगी क्योंकि केवल कुछ चुनिंदा अवशेषों का अभाव है कि माध्यम का उपयोग करना पसंद करते हैं, सभी एमिनो एसिड बाहर छोड़ दिया है संभव है। हम पूरक हो सकता है और परासारिता समायोजन की आवश्यकता नहीं है कि एक लिस-Tyr-पीएचई छोड़ने वालों मध्यम चुना है। फूrthermore, मध्यम स्वतंत्र रूप से मध्यम घटकों की सांद्रता का हिस्सा नहीं है एक सप्लायर; हम सफलता के साथ लिस, Tyr और पीएचई के लिए 100 मिलीग्राम / एल प्रत्येक इस्तेमाल किया। अभिकर्मक और अभिव्यक्ति मध्यम के खंड जोड़ा अमीनो एसिड के लिए खाते में समायोजित किया जाना चाहिए। यहाँ आइसोटोप लेबलिंग के लिए ऊपर प्रोटोकॉल के लिए समायोजन कर रहे हैं
    2. एक छोटा सा अणु के साथ अभिकर्मक अनुपूरक
      1. Autoclaved पानी का उपयोग कर 2-Deoxy-2-फ्लोरो एल fucose 100 मिमी शेयर समाधान तैयार है और एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करते हुए इस समाधान बाँझ।
      2. एक 50 मिलीलीटर संस्कृति के लिए, अभिकर्मक और कमजोर पड़ने मीडिया के लिए fucose अनुरूप समाधान की (250 माइक्रोन से कम) 125 μl जोड़ें। नोट: हम कुल संस्कृति मात्रा .यह का केवल 0.25% के लिए इस एकाग्रता खातों पर substituent जोड़ने glycan प्रसंस्करण के छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग कर अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए संभव है, क्योंकि किसी भी आगे की मात्रा समायोजन प्रदर्शन करने की उपेक्षा की है। यहाँ हम 2-deoxy- सहित के लिए परिस्थितियों का वर्णन2-फ्लोरो एल fucose, glycan fucosylation के एक अवरोध। हम अभिकर्मक और कमजोर पड़ने के मीडिया में 250 माइक्रोन की एकाग्रता पर fucose अनुरूप जोड़कर fucosylation में> 90% की कमी पाया।

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Representative Results

उच्च स्तर प्रोटीन अभिव्यक्ति और पवित्रता

यह अनुकूलित अभिव्यक्ति प्रणाली ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का एक उच्च उपज उत्पन्न। एक विशिष्ट स्वरूप IgG1-एफसी (चित्रा 1) की अभिव्यक्ति में दिखाया गया है। इस मामले में, 0 दिवस कच्चे माध्यम में घुलनशील अभिव्यक्ति अंश का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है डे 5. प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए ऊपर दिवस 1 (कमजोर पड़ने) द्वारा पीछा अभिकर्मक दिन और बाद में संस्कृति दिनों का है। संस्कृति विभाज्य संस्कृति कमजोर पड़ने के बाद 3 घंटा वापस ले लिया गया था के रूप में प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक बहुत छोटी राशि के दिन 1 में मनाया गया। इस संस्कृति के माध्यम में एक विशिष्ट हरे रंग प्रदर्शित करने वाले GFP टैग प्रोटीन के साथ कल्पना करने के लिए आसान है। ऐसी वृद्धि 5 दिन पर दिन 4 और दिन 5. बीच मनाया गया डे 5. करने के लिए 2 दिन से GFP-FcγRIIIa और GFP-ST6GalI की अभिव्यक्ति के लिए अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि मनाया गया, कोशिकाओं थे <50%व्यवहार्य और इसलिए संस्कृति प्रोटियोलिसिस सीमित करने के लिए काटा गया था। (> 99%, चित्रा 2) एक GFP-FcγRIIIa के लिए IgG1 एफसी या निकल स्तंभ के लिए एक स्तंभ उच्च शुद्धता के साथ प्रोटीन के परिणामस्वरूप प्रोटीन का उपयोग आत्मीयता शुद्धि, उपज (1 टेबल) और पूर्ण ग्लाइकोसिलेशन (डेटा) नहीं दिखाया।

प्रोटीन और ग्लाइकान की 15 एन या 13 सी आइसोटोप लेबलिंग

इस प्रणाली को कुशलता से वर्णित प्रोटोकॉल अनुसार IgG1 एफसी isotopically समृद्ध व्यक्त किया। प्रोटीन उपज में एक छोटी सी कमी (25-50%) मनाया गया था हालांकि, अच्छी तरह से छितरी संकेतों 1 एच परमाणुओं के अनुनाद आवृत्ति और सीधे बंधुआ एमाइड 15 एन परमाणुओं (चित्रा 3) संबद्ध है कि एक 2 डी एनएमआर स्पेक्ट्रम में देखा गया था। अभिव्यक्ति के इस स्तर 2-20 आम तौर पर (संरचना के आधार पर अध्ययन के लिए आवश्यक पैमाने पर कुशल प्रोटीन के उत्पादन के लिए परमिटप्रोटीन की मिलीग्राम) और प्रोटीन में लेबल आइसोटोप के सफल समावेश को दिखाता है। इस स्पेक्ट्रम और प्रकाशित स्पेक्ट्रा के बीच समानता के उच्च स्तर प्रोटीन लेबलिंग के एक उच्च डिग्री न्यूनतम 15 एन लेबलों 43 के पांव मार के साथ हुई संकेत मिलता है।

अलग एन ग्लाइकान के साथ उत्पादन प्रोटीन

विभिन्न glycoforms HEK293F और HEK293S कोशिकाओं के साथ उत्पादन किया गया था। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI एमएस) enzymatically से जारी एन ग्लाइकान का विश्लेषण करती है मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर आयनीकरण की उम्मीद glycoforms (चित्रा 4) से पता चला है। आदमी 5 GlcNAc 2 फार्म के थे और कोई fucose (चित्रा 4) निहित है कि एन-ग्लाइकान harbored HEK293S कोशिकाओं से व्यक्त प्रोटीन। HEK293F व्यक्त सामग्री से ग्लाइकान जटिल प्रकार, कोर fucose साथ biantennary रूपों और ज्यादातर होने टर्मिनल थेएन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन (GlcNAc) या मोनो या डाई-galactosylated (गला) रूपों के छोटे से अनुपात। यह ST6GalI और FcγRIIIa के देशी एन ग्लाइकान क्या कर रहे हैं पता नहीं है हालांकि, IgG1 एफसी के लिए glycan प्रोफ़ाइल मानव सीरम 46 से शुद्ध IgG1 एफसी के समान है। प्रमुख मतभेद संशोधन की डिग्री शामिल हैं; मानव सीरम से IgG1 एफसी HEK293F अभिव्यक्ति के लिए मनाया से galactosylation के एक उच्च स्तर को दर्शाता है। एक अभिव्यक्ति के लिए 2-Deoxy-2-फ्लोरो एल fucose, glycan fucosylation के एक अवरोध के अलावा fucose समावेश में एक नाटकीय> 90% की कमी से पता चला HEK293F सेल लाइन का उपयोग कर (चित्रा 4) का आयोजन किया।

आकृति 1
चित्रा 1: पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च पैदावार pGEn2 वेक्टर से व्यक्त करने से बरामद कर रहे हैं। (ए - बी) के दो अभिव्यक्ति वीइस अध्ययन में इस्तेमाल ectors एक amp आर कैसेट और एक ई होता है कि एक pIBI30 प्लाज्मिड से उत्पन्न किया गया कोलाई प्रतिकृति मूल। HEK293F कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक के बाद स्रावित IgG1 एफसी प्रोटीन (सी) अभिव्यक्ति के स्तर। एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण डे 5 दिन 0 से व्यक्त प्रोटीन का संचय से पता चलता है और तीर द्वारा संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: संस्कृति के माध्यम से व्यक्त प्रोटीन की वसूली। (ए) IgG1-एफसी, (बी) GFP-FcγRIIIa। "मध्यम" centrifugation के बाद संस्कृति के माध्यम से संदर्भित करता है; एफटी = शुद्धि स्तंभ से अंश के माध्यम से प्रवाह। एसडीएस पृष्ठ नमूने जनसंपर्क कर रहे हैं β-mercaptoethanol बिना शर्तों गैर को कम करने में epared। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। IgG1 एफसी के एमिनो एसिड चयनात्मक लेबलिंग की 1 एच 15 एन heteronuclear एक क्वांटम जुटना स्पेक्ट्रम [15 एन Tyr, 15 एन लिस] IgG1 एफसी माध्यम एक साथ पूरक कस्टम में HEK293F कोशिकाओं का उपयोग व्यक्त -labeled (15 एन ) एल Tyr और एल लिस लेबल। Crosspeaks पिछली रिपोर्टों 43,47 के आधार पर आवंटित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4:। Glycan रचना के छोटे अणु माड्युलेटर्स की उपस्थिति में प्रोटीन अभिव्यक्ति IgG1 एफसी के एन glycan प्रोफाइल अलग संस्कृति शर्तों का उपयोग HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त किया। शीर्ष स्पेक्ट्रम IgG1 एफसी HEK293S कोशिकाओं में व्यक्त से अलग ग्लाइकान का उपयोग कर तैयार किया गया था। केंद्र स्पेक्ट्रम HEK293F कोशिकाओं में व्यक्त सामग्री और नीचे स्पेक्ट्रम से IgG1 एफसी glycoforms इसी प्रकार की कोशिकाओं के सकल घरेलू उत्पाद-fucose जैवसंश्लेषण के एक अवरोध, 2-Deoxy-2-फ्लोरो एल fucose की उपस्थिति में बड़े हो रहे थे उम्मीद तैयार किया गया था पता चलता है। एन ग्लाइकान CFG सम्मेलन 5 निम्नलिखित कार्टून चित्र के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं: एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन (GlcNAc), नीले वर्गों; Mannose (मैन), हरी हलकों; Fucose (fuc) लाल त्रिकोण; Galactose (गला), पीला हलकों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<tbody>
प्रोटीन यील्ड (मिलीग्राम / एल)
IgG1 एफसी 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

तालिका 1: HEK293F कोशिकाओं में व्यक्त विभिन्न प्रोटीन के लिए निकलेगा।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल HEK293F या कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति को दिखाता है। कंटिया और Moremen प्रयोगशालाओं में स्थापित इष्टतम अभिकर्मक शर्तों उच्च दक्षता अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए सेल घनत्व और अभिकर्मक सांद्रता का एक महत्वपूर्ण संयोजन रोजगार। इस प्रोटोकॉल को लागू जब गंभीर कारणों में शामिल हैं: (सुसंगत संस्कृति बार दोहरीकरण के साथ) अभिकर्मक करने से पहले एक स्थिर संस्कृति को बनाए रखने; 95% से अधिक सेल व्यवहार्यता के साथ (1 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल 24 घंटा से पहले अभिकर्मक करने के लिए गिराए कोशिकाओं के द्वारा प्राप्त) सक्रिय रूप से बढ़ कोशिकाओं के अभिकर्मक; अभिकर्मक पर सेल घनत्व 90% मध्यम एक और 10% मध्यम बी युक्त एक संस्कृति में एक व्यवहार्यता> 95% (अभिकर्मक घनत्व) के साथ 6 से 10 एक्स 2.5-3.0 के बीच जीवित कोशिकाओं / एमएल होना चाहिए; और, एमएल 3 माइक्रोग्राम / और क्रमश: 31 9 माइक्रोग्राम / एमएल, पर पी अलावा करने से पहले डीएनए जोड़ने; मध्यम conta में 1: 24 घंटा बाद अभिकर्मक पर संस्कृति एक पतला हैining 4.4 मिमी पतला संस्कृति में 2.2 मिमी valprioc एसिड की एकाग्रता में परिणाम की वैल्प्रोइक एसिड; उत्पादन चरण के विकास तो एक अतिरिक्त 4-5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 8% सीओ 2 पर एक humidified हिला कुप्पी में जारी है। यहाँ वर्णित वेक्टर अनुकूलित और घुलनशील प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली 32,42 की एक महत्वपूर्ण विशेषता है।

एक लक्ष्य प्रोटीन को व्यक्त करने में विफल रहता है, तो उपरोक्त कारकों के अलावा, कई अन्य चर कम पैदावार के लिए योगदान कर सकते हैं। प्रोटीन कोडिंग डीएनए अनुक्रम मानव कोशिकाओं के लिए अनुकूलित कोडोन शामिल किया जाता है। यह कई ऑनलाइन संसाधनों के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रक्रिया के दौरान बाँझपन सर्वोपरि है। HEK293F कोशिकाओं का एक सक्रिय रूप से बढ़ रहा है और शुद्ध संस्कृति नग्न आंखों के लिए थोड़ा दानेदार प्रकट करना चाहिए, और मध्यम (विशेष सेल घनत्व <1.0 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल) पर मुख्य रूप से साफ किया जाना चाहिए।

बैक्टीरिया या कवक चाहिए साथ दूषित संस्कृतितुरंत प्रसार को रोकने के लिए हटा दिया जाना। यह महत्वपूर्ण है एक स्वस्थ शेयर संस्कृति को बनाए रखने के लिए है। यह / एमएल 0.3 × 10 6 कोशिकाओं की एक कोशिकाओं घनत्व में इन संस्कृतियों inoculating द्वारा हासिल की है। लोअर टीका घनत्व सेल के विकास और विभाजन 48 के लिए आवश्यक विभिन्न विकास कारकों की आपूर्ति को सीमित करके विकास दर को धीमा कर सकते हैं। संस्कृतियों से अधिक 25 या 30 बार के लिए passaged किया गया है, अभिव्यक्ति में कमी देखी गई। इस कारण से, संस्कृतियों 30 से अधिक बार खारिज कर रहे हैं passaged।

यह प्रोटीन अभिव्यक्ति के माध्यम में अपमानित किया जा रहा है संभव है, या अभिव्यक्ति समय सीमा प्रोटीन गिरावट के लिए अग्रणी, बहुत लंबा है। इन कारणों के लिए यह एक इष्टतम अभिव्यक्ति समय सीमा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक दिन पर संस्कृति व्यवहार्यता और प्रोटीन अभिव्यक्ति की निगरानी करने की सलाह देते हैं। यह मध्यम कटाई के बाद के रूप में जल्दी संभव के रूप में प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ प्रोटीन के लिए, यह ड्यूरिन प्रोटीज अवरोधकों शामिल करने के लिए उपयोगी हैजी शुद्धि। कुल में, इन समायोजन कंटिया और Moremen प्रयोगशालाओं 42,43 में प्रोटीन की वसूली में सुधार हुआ है।

HEK293 कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक घुलनशील प्रोटीन और स्वाभाविक रूप से स्रावी मार्ग को लक्षित कर रहे हैं कि प्रोटीन डोमेन के उत्पादन के लिए महान उपयोगिता को दिखाया गया है। यह साइटोप्लास्मिक या अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के उत्पादन को आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी कि संभावना है। इस प्रणाली का एक प्राथमिक लाभ प्रोटीन के उत्पादन के लिए देशी substrates और मशीनरी HEK293 कोशिकाओं 49 में वर्तमान और उपलब्ध हो रहा है। यह काफी हद तक इस तरह के साथ कोई या सीमित बाद translational संशोधन, या खमीर और baculovirus सिस्टम के साथ बैक्टीरिया के रूप में अन्य पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के तरीकों पर अपने फायदे के लिए खातों के सही ढंग से मुड़ा लेकिन अलग अलग एन glycoforms 1,50,51 शामिल किया।

इसके अलावा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल कॉम कम आणविक भार में शामिल करने के लिए जोड़ा क्षमता से पता चलता हैऐसे लेबल अमीनो एसिड, लेबल ग्लूकोज या एन-glycan संरचना को संशोधित करने के लिए डिज़ाइन छोटे अणुओं के रूप में पाउंड। HEK293 कोशिकाओं भी संयंत्र एंजाइमों सहित गैर स्तनधारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति में माहिर साबित, और प्रोटीन परिसरों की वसूली के लिए कई polypeptides का सह अभिव्यक्ति का समर्थन करता है (डेटा) नहीं दिखाया।

ग्लाइकोप्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन अक्सर नमूना उत्पादन चुनौतियों आड़े आती है। यहाँ वर्णित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली परिष्कृत इंट्रासेल्युलर glycan प्रसंस्करण एंजाइमों 6 के प्राकृतिक पूरक का उपयोग कर बाद translational संशोधनों को पूरा करने से इस खामी surmounts। इस मजबूत और सरल प्रोटोकॉल निलंबन मानव HEK293 कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक के लिए साबित हो रहा है। इस विधि महत्वपूर्ण ग्लाइकोप्रोटीन उपज का प्रदर्शन (> 95 मिलीग्राम / एल) तीन एन ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के साथ और ऐसे लेबल अमीनो एसिड के अवशेष या छोटे अणु रासायनिक INH रूप में की खुराक को समायोजित कर सकते हैंibitor 2-Deoxy-2-फ्लोरो एल fucose। व्यक्त ग्लाइकोप्रोटीन आगे परिभाषित glycoforms 52 की एक विस्तृत श्रृंखला तैयार करने के लिए पोस्ट-शुद्धि remodeled जा सकता है।

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Acknowledgments

इस काम के लिए आर्थिक अनुदान K22AI099165 (AWB) द्वारा, P41GM103390 (KWM) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से P01GM107012 (KWM), और आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी में जैव रसायन, बायोफिज़िक्स और आण्विक जीवविज्ञान के रॉय जे कार्वर विभाग से धन द्वारा समर्थित किया गया । इस काम की सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी एनआईएच की आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

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References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 106 ग्लाइकोप्रोटीन इम्युनोग्लोबुलिन जी एफसी रिसेप्टर पुनः संयोजक प्रोटीन मानव HEK293F और HEK293S कोशिकाओं

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Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

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Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

निलंबन में HEK293 कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक के साथ पुनः संयोजक मानव प्रोटीन की उच्च उपज अभिव्यक्ति
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Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

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