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Biology

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

doi: 10.3791/53568 Published: December 28, 2015

Abstract

El arte de la producción de proteínas recombinantes con complejas modificaciones post-traduccionales representa un desafío importante para los estudios de estructura y función. El rápido establecimiento y alta recuperación de las líneas de células de mamíferos transfectadas transitoriamente-aborda esta barrera y es un medio eficaz para la expresión de proteínas que se canalizan a través de la forma natural ER y Golgi vía secretora mediada. Aquí es un protocolo para la expresión de proteínas utilizando el HEK293F humana y líneas de células HEK293s transfectadas con un vector de expresión de mamífero diseñado para altos rendimientos de proteínas. La aplicabilidad de este sistema se demuestra mediante tres glicoproteínas representativos que expresaban con rendimientos entre 95 a 120 mg de proteína purificada recuperada por litro de cultivo. Estas proteínas son la FcRIIIa humana y la sialiltransferasa α2-6 rata, ST6GalI, ambos expresados ​​con una fusión GFP N-terminal, así como la inmunoglobulina humana no modificada G1 Fc. Este robusto sistema utilizes un medio libre de suero que es adaptable para la expresión de proteínas e hidratos de carbono para estudios estructurales utilizando espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear isotópicamente enriquecidos. Además, la composición de la N-glicano se puede ajustar mediante la adición de una molécula pequeña para evitar que ciertas modificaciones de glicano de una manera que no reduce el rendimiento.

Introduction

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La producción de altos rendimientos de proteínas humanas debidamente plegadas y después de la traducción modificados para el análisis detallado de la estructura y la función sigue siendo un reto importante. Un gran número de sistemas de expresión están disponibles que producen las proteínas recombinantes con la función y el comportamiento similar a la nativa. Sistemas de expresión bacterianos, predominantemente cepas de Escherichia coli, representan las herramientas más accesibles y comúnmente utilizados en el campo de la investigación, debido a la simplicidad de estos sistemas de expresión, aunque la levadura, plantas, insectos y sistemas de mamíferos son también describen a 1-4. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas son incapaces de modificación post-traduccional apropiado de las proteínas diana. Un interés fundamental de los laboratorios Barb y Moremen está produciendo proteínas eucariotas con glicosilación apropiada. Muchas proteínas humanas requieren glicosilación apropiada para la función apropiada (ver 5).

El eucariotamaquinaria de glicosilación es amplia y capaz de realizar una amplia gama de modificaciones, que incluye tanto la asparagina (N) - y serina / treonina (O) -vinculada glicanos complejos 6. Se estima que> 50% de las proteínas humanas son N-glicosilada 7. Los glicanos son componentes esenciales de muchas proteínas, incluyendo anticuerpos monoclonales terapéuticos, eritropoyetina y factores de coagulación de la sangre como el factor IX, para nombrar unos pocos. Aunque existen varios métodos para preparar proteínas adecuadamente N-glicosilada y van desde puramente sintético 8-10, a quimioenzimática 11-14 o la recuperación de los sistemas recombinantes ingeniería 15-20, como es lógico, los sistemas de expresión humanos hasta ahora han demostrado ser el más robusto métodos para generar proteínas humanas.

Muchos glicoproteínas humanas terapéuticas se producen en sistemas recombinantes utilizando células de mamíferos. Sistemas de la nota son el ovario de hámster chino (CHO), mieloma de ratón (NS0), Baby Hamster kidney (BHK), del riñón embrionarias humanas (HEK-293) y líneas de células de la retina humanos que se emplean en la adhesión o suspensión de cultivo para la producción de proteínas 4,21,22. Sin embargo, los sistemas de expresión proteína de mamífero han requerido la generación de líneas celulares estables, medios de crecimiento y el sustrato asistida caros procedimientos de transfección 23.

La transfección de células de mamífero se consigue con la ayuda de numerosos agentes, incluyendo fosfatos de calcio 24,25, polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polibreno, polilisina, polietilimina (PEI)) o liposomas catiónicos cargados positivamente 26-29. PEI es un policatiónico, cargada, lineal o polímero ramificado (25 kDa) 26 que forma un complejo estable con el ADN y se endocitosis. Tras la acidificación del endosoma, PEI se piensa a hincharse, lo que lleva a la ruptura de endosomas y la liberación del ADN en el citoplasma 26,30.

Hasta hace poco, la transfección transitoria en Suspensiònen la cultura fue llevado por la formación de complejos de ADN / PEI antes seguido de la adición al cultivo celular 29. Sin embargo, Würm y compañeros de trabajo informó de un protocolo altamente eficiente optimizado para la producción de proteínas recombinantes en células HEK293 que formaban un complejo ADN / PEI in situ 31,32. Esto evitó la preparación, la esterilización del complejo, y el intercambio de tampón en un medio de cultivo. Además optimización incluyendo plásmidos de expresión para mejorar llevado a aumentos de rendimiento significativa 33. Aquí un método que se basa en estos avances y es ampliamente aplicable. Condiciones de expresión también pueden alterarse para afectar a la composición de N-glicano.

La línea de células HEK293s, con una deleción del gen que detiene el procesamiento de N-glicano en una etapa intermedia, conduce a la expresión de proteínas con uniformes N-glicanos que consta de 2 residuos de N-acetilglucosamina más cinco residuos de manosa (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Estas célulascarecer de la N-acetilglucosaminil transferasa I (GnTI) de genes que se requiere para N-glicano de procesamiento aguas abajo 36,37. El uso de inhibidores de glicosiltransferasa incluyendo kifunensine, análogos del ácido siálico y el análogo de fucosa y 2-desoxi-2-fluoro-fucosa tiene efectos y los límites de procesamiento de N-glicano 38 a 41 similares.

El protocolo informó aquí utiliza el vector pGEN2 como se muestra en la Figura 1 42,43, PEI transfección asistida transitoria en líneas de células de mamíferos (HEK293F o células HEK293s), y la recuperación de altos rendimientos de proteína apropiadamente glicosilada. Este sistema es robusto y puede acomodar varios factores, incluyendo el etiquetado de isótopos y la ingeniería glicano para la producción de grandes títulos de proteínas recombinantes.

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Protocol

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Este protocolo es suficiente para la expresión utilizando células HEK293F o HEK293s.

1. Establecimiento de la célula

  1. Cultura Inoculación
    Nota: Todos los procedimientos de manipulación de la cultura deben ser realizadas en una instalación BSL-2 y cada artículo llevados a la cabina de bioseguridad deben esterilizarse mediante pulverización con un 70% de etanol en solución acuosa.
    1. Haga funcionar el agitador incubadora a 135 rpm, 80% de humedad y al 8,0% de CO 2 y 37 ° C. Girar "en" la lámpara UV de la cabina de bioseguridad al menos 1 hora antes de trabajar. Precalentar las botellas selladas Medio A y Medio B en el baño de agua a 37 ° C durante 1 hora.
    2. Esterilizar matraces Erlenmeyer de 125 ml de crecimiento con una tapa ventilada, pipetas, pipetas, y botellas de los medios de comunicación precalentadas por pulverización con el 70% de etanol en solución acuosa. Coloque estos artículos en la cabina de bioseguridad. Nota: Esterilizar sólo el exterior de plástico que cubre el frasco de cultivo Erlenmeyer de 125 ml, y luego retire sólo cuando is dentro de la cabina de bioseguridad.
    3. Por una cultura 30 ml, retirar 26 ml de Medio A y 3 ml de Medio B (10% del cultivo final) y transferir en el matraz de cultivo de Erlenmeyer de 125 ml y mezclar suavemente mediante agitación (en lo sucesivo denominado como medio de cultivo fresco).
    4. Transferencia de un vial de células que contienen células HEK293F, congelados a -80 ° C, en hielo y pasar a la sala de la cultura. Nota: Las células HEK293F se suministran a una densidad de 1 x 10 7 células / ml.
    5. Caliente el vial suavemente en baño de agua a 37 ° C para descongelar parcialmente las células (que tarda aproximadamente un minuto y células no debería estar completamente descongelada). Esterilizar el exterior del vial con el etanol al 70% en solución de agua y moverlo a la cabina de bioseguridad.
    6. El uso de 1 ml pipeta, retirar la suspensión de células (aproximadamente 0,7 ml) y la transferencia en el matraz Erlenmeyer de 125 ml que contiene 29 ml de medio de cultivo fresco. Cierre la tapa del frasco de cultivo y moverlo en la coctelera incubado.
    7. Mantenimiento Celular: Hora de densidad celular, Viabilidad y pases celulares
      1. Comprobar la densidad de células después de 24 h de descongelación de la cultura siguiendo el protocolo a continuación. Nota: Las células se cultivan durante 24 horas después de la descongelación para asegurar el crecimiento de células esenciales y la viabilidad de> 80%.
      2. Esterilizar el frasco de cultivo con el 70% de etanol en la solución de agua y moverlo a la cabina de bioseguridad.
      3. Con una pipeta de 1 ml y pipeta, retirar lentamente 100 l de la cultura y la transferencia de la suspensión en un ml tubo Eppendorf estéril 0.5. Cierre y transferir el frasco de cultivo de nuevo en la coctelera tan pronto como sea posible.
      4. Mezclar 7,5 l de una solución de azul de tripano con 7,5 l de células. Mezclar enérgicamente con 7,5 l de la / mezcla de azul tripán celular y transferirlo a la diapositiva contando.
      5. Encienda el contador de células automático y colocar la diapositiva de conteo en la cámara de carga. El lector automático se activa y las células se cuentan de forma automática en las unidadesde número de células por ml y el porcentaje de viabilidad
      6. Determinar el volumen de la cultura donante requerido para la transferencia a un medio de cultivo fresco a la densidad de células de 0,3 x 10 6 células / ml en vivo.
        Nota: Consulte un ejemplo de cálculo en Materiales suplementarios.
      7. Repita los pasos 1.1.2 y 1.1.3 del protocolo "1,1 Cultura Inoculación" anterior para preparar los materiales necesarios para el medio de cultivo fresco.
      8. Transferencia Medio A (23 ml) y Medio B (3 ml) a un matraz de cultivo de 125 ml fresco. Retire las botellas del stock de Medio A y medio B de la cabina de bioseguridad.
        Nota: Las existencias de botellas de los medios de comunicación no deben guardarse en la cabina de bioseguridad, al mismo tiempo que las células HEK 293F. Esto limita la posibilidad de contaminación de las botellas medianas valores.
      9. Retire el cultivo de células HEK293 de la incubadora y rociar con el 70% de etanol en solución acuosa. Utilizando una nueva pipeta, retirar la parte alícuota de células (4 ml, este volumen se determinó de acuerdo to paso 1.2.6) a partir del cultivo y la transfiere al matraz que contiene medio de cultivo fresco.
      10. Traslado tanto las culturas desde la cabina de bioseguridad al agitador incubadora de acuerdo con 1.1.1. Cultivan las células a una densidad aproximada de 2-3 x 10 6 células / ml en vivo.
        Nota: El tiempo de duplicación aproximada de las células es de 32 h. Se llevará a 3-4 días para llegar a esta densidad. Se incuban las células durante 3-4 pasajes tener patrón de crecimiento estable de las células antes de la primera transfección.

    2. Preparar materiales para transfección

    1. Preparación de células HEK293 (Día 1)
      1. Células subcultivo en una densidad de 1 x 10 6 células / ml en medio fresco B 24 hr antes de la transfección acuerdo con la Etapa 1.2.
        Nota: el volumen del cultivo de transfección será dependiente del número de células. Volúmenes de transfección más grandes (> 20 ml) requerirán un mayor volumen de la cultura en esta etapa.
    2. Preparación Stocks de Materiales
      1. Preparar solución madre de polietilenimina lineal (PEI) a una concentración de 1 mg / ml en un tampón que contiene 25 mM 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico ácido (HEPES) y NaCl 150 mM (pH 7,5). Disolver PEI por completo; esto puede tardar 30-60 minutos a temperatura ambiente. Esterilizar a través de filtro de jeringa de 0,22 M y se almacena a -20 ° C para su uso a largo plazo.
      2. Preparar ADN plásmido estéril (de acuerdo a los pasos 2.2.2.1-2.2.2.4). El procedimiento de construcción del plásmido se describe en otra parte 42. Una breve procedimiento para la preparación de ADN se explica aquí:
        1. Crecer un cultivo de células de Escherichia coli químicamente competentes-transformadas con el vector pGEN2 en 1 L de medio LB (10 g Tryptone- / L, Extracto de levadura 5 g / L y cloruros de sodio 10 g / L) suplementado con 100 mg / ml de ampicilina. E. coli se cultiva a 37 ° C en un no humidificado, incubadora de agitación.
        2. Purificar el ADN pGEN2 vector que codifica plásmido diana de acuerdo con el manuprotocolo de purificación de ADN de fabri-.
        3. Para asegurar la esterilidad completa del ADN de plásmido, realice los precipitación con isopropanol y resuspensión pasos finales de los procedimientos de extracción de ADN dentro de la cabina de bioseguridad.
        4. Añadir el volumen de isopropanol (especificado en el kit de preparación de plásmido) a la ADN eluido y se centrifuga a 10.000 x g durante 10 min. Esterilizar el exterior del recipiente de ADN con etanol al 70% en solución de agua y transferirlo dentro de la cabina de bioseguridad. Descartar el sobrenadante usando una pipeta de isopropanol y aire secar el sedimento de ADN. Una vez seco, resuspender el precipitado en tampón estéril Tris 10 mM, pH 8,0.
      3. Preparar solución madre de 220 mM de ácido valproico (VPA) en agua y esterilizar por paso a través de un filtro estéril de 0,22 micras. Guarde la solución a -20 ° C hasta su uso posterior.

    3. El establecimiento de una transfección transitoria

    1. La transfección (Día 0)
      1. Compruebe la densidad celular siguiendo los pasos 1.2.2 a través de 1.2.5 de "1.2. Mantenimiento Móvil" arriba. Determinar la cantidad de células para la transfección (2,5-3,0 x 10 6 células / ml en vivo con la viabilidad> 95%). Ver un ejemplo de cálculo en Materiales suplementarios.
      2. Transferir el volumen de las células de cultivo en suspensión calculados en el paso anterior (aquí 67 ml) a un tubo de centrífuga de 250 ml utilizando una pipeta serológica estéril. Recoger las células por centrifugación durante 5 min a 100 x g.
      3. Mientras tanto, preparar un medio de cultivo fresco transfección siguiente paso 1.1.3 de acuerdo con "1.1. Cultivo de inoculación" anterior. Ver los Materiales complementarios para el cálculo de la muestra. Además, la transferencia de 5 ml de medio de cultivo fresco a un tubo de 15 ml estéril y dejar de lado.
      4. Tubos de transferencia que contiene las células sedimentadas en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior de los tubos con el etanol al 70% en solución de agua y utilizar una pipeta estéril para decantar THe sobrenadante que consta de medio de cultivo gastado.
      5. Vigorosamente resuspender las células sedimentadas pipeteando arriba y abajo con 10 ml de medio de cultivo fresco y traslado al frasco con medio de cultivo fresco transfección (preparado en el paso 3.1.3 anterior). Tornillo de la tapa en el frasco de cultivo celular ventilado y mover el frasco a la incubadora (tal como se establece en 1.1.1) durante 15 minutos-1 hora con agitación.
      6. Durante este tiempo, diluir el ADN plásmido y las existencias de PEI utilizando medio de cultivo fresco (utilizando el volumen 5 ml retirado de paso 3.1.3 anterior) a una concentración final de 0,5 mg / l. Ver cálculos de ejemplo en materiales complementarios para determinar la cantidad de ADN y PEI. Transferir el matraz de cultivo con las células dispersa en la cabina de bioseguridad.
      7. Añadir ADN plásmido (300 l de 0,5 mg / l) al cultivo utilizando micro-pipeta y mezclar por agitación manual suave. Añadir PEI (900 l de 0,5 mg / l) a la cultura, se mezcla agitando suavemente. Añadir 3,8 ml de cul frescamedio ture, desde el paso 3.1.3, arriba y matraz de transferencia al agitador incubador durante 24 hr.
      8. Limpie el gabinete de bioseguridad de acuerdo con el Paso 1.1.
    2. Dilución (Día 1) (Para un volumen de 50 ml transfección)
      1. Incubar el cultivo transfectadas durante 24 horas.
      2. Retirar 1 ml de ácido valproico mM precalentado 220 (VPA; preparado de acuerdo con el paso 2.2.3.) Utilizando un estéril de 1 ml pipeta serológica y la transfiere a un tubo de 50 ml estéril.
      3. Retirar 5,0 ml de precalentado Medio B y 44 ml de Medio A precalentado y añadir esto a la solución VPA utilizando una pipeta serológica estéril para preparar 50 ml de medio de cultivo fresco con una concentración final de 4,4 mM de VPA.
      4. Mueva el cultivo transfectado en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior del matraz con un 70% de etanol en solución acuosa, añadir el medio de dilución preparada y transferir el matraz de nuevo a la coctelera se incubaron.
    3. Expresión y cosecha (días 2-6)
      1. Se incuban las células durante otros 4-5 días (5-6 días en total desde la transfección).
      2. Retirar alícuotas de medio de cultivo siguientes paso 1.2.2. a 1.2.5. se describe en "1.2. Mantenimiento de la célula", anteriormente usando una pipeta serológica de 1 ml estéril, para monitorizar la viabilidad células y guardar alícuotas para analizar la expresión de proteína en cada día por SDS-PAGE (véase la Sección 5, más abajo).
      3. Células de la cosecha después de 5-6 días por centrifugación de las células más medio a 1000 g durante 5 min. Además, cosechar el sobrenadante si el viabilidad celular cae por debajo de 50% (consulte los pasos 1.2.2-1.2.5).
      4. Retirar el sobrenadante que contendrá proteína secretada. Añadir 5 ml de un blanqueador 10% al sedimento celular HEK y desechar como un riesgo biológico.

    Purificación 4. Proteína

    1. Preparar una columna con 5 ml de proteína A-Sepharose. Equilibrar la columna con 5 volúmenes de columna de tampón A (20 mM de ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS), pH 7,4, NaCl 100 mMl).
    2. Centrifugar el sobrenadante recogido con proteína expresada a alta velocidad (14.000 g durante 10 min) para eliminar cualquier residuo celular restante. Recoger por decantación en un tubo nuevo. Deseche la pastilla como un peligro biológico.
    3. Recoger una alícuota de 10 l del sobrenadante y, además, una pequeña muestra en cada etapa de purificación de proteínas para analizar la muestra por SDS-PAGE (descrito en la Sección 5). Cargue el sobrenadante clarificado y recoger el flujo a través.
    4. Lavar la columna con 3 volúmenes de columna de tampón-A y eluir la proteína con volúmenes de 5 columnas de glicina 100 mM, pH 3,0. Recoger el eluido en tubos que contienen un medio volumen de tampón Tris 1 M, pH de 8,0 para neutralizar rápidamente el pH.
    5. Lavar la columna con 10 volúmenes de columna de tampón A y almacenar para su uso futuro.
    6. Intercambio de tampón se eluyó la proteína con al menos un exceso de 10 veces de tampón A utilizando 10 kDa de peso molecular filtros centrífugos de corte. Nota: No concentrar la muestra eluida aun volumen muy bajo (<2 ml) en el tampón de eluido. Usa los filtros centrífugos para intercambiar el tampón con tampón A.
    7. Tienda purificado proteínas a 4 ° C hasta su próximo uso.
      Nota: proteína expresada en el sobrenadante puede purificarse mediante columnas de afinidad seleccionados sobre la base de las propiedades de la proteína o el uso de etiquetas de afinidad. Para un procedimiento típico de purificación, columna de proteína A se puede utilizar para IgG o fragmentos Fc o columna de níquel se puede utilizar para proteínas expresadas con una etiqueta de poli-histidina. Aquí, es una descripción de las etapas de purificación para IgG1-Fc utilizando una columna de Proteína A.

    5. Análisis de proteínas por SDS-PAGE

    1. Diluir las alícuotas (7,5 mu l) de cada muestra con un volumen igual de tampón de carga 2x (0,125 M Tris, pH 8.0, 4% SDS, 10% β-mercaptoetanol, 20% glicerol, y 0,01% azul de bromofenol).
    2. Hervir la mezcla a 90 ° C durante 5 min usando un bloque de calor o baño de agua. Centrifugar las muestras a 10.000 g for 1 min. Cargue el gel preparado con 5 l de proteína marcadora y 14 l de las muestras para el análisis utilizando una pipeta de 20 l con una punta desechable.
    3. Ejecute uno de gel a 25 miliamperios durante 60 minutos. Una vez que el paso de electroforesis es completa, transferir el gel a un recipiente con 1 L de agua y microondas durante 5 min.
    4. Tinción del gel con solución de tinción (etanol 40%, ácido acético al 10% y 0,1% Azul Brillante de Coomassie) durante 2 horas y destain en agua.

    6. Los glicanos Análisis por Espectrometría de Masas

    1. Analizar glicanos como se ha descrito previamente 44. Brevemente, 75 g de IgG1-Fc se tripsinizó, luego se trató por PNGasaF para la liberación de glicanos 45. Glicanos liberados fueron permetilada y se analizaron por espectrometría de uso de láser asistida por matriz-desorción ionización tiempo de vuelo de masas (MALDI-TOFMS).

    7. Protocolo Ajustes por Escenarios especiales

    1. Etiquetado de proteínas con 15 N-etiquetados aminoácidos (para un volumen de 50 ml transfección)
      1. Dispensar 5 mg de cada aminoácido en un único vial de vidrio estéril. Resuspender con 4 ml de agua en autoclave (nota Tyr no solubilizar por completo, a diferencia de Lys y Phe). Esterilizar la solución en autoclave a 121 ° C durante 15 min. Deje que la solución se enfríe, aproximadamente a 50-60 ° C.
      2. Para un volumen de transfección 50 ml, siga el paso 3.1.3 de acuerdo con "3.1 Establecer una transfección transitoria". Vea la sección de Materiales suplementarios para un ejemplo con volúmenes adecuados.
      3. Para la transfección, siga los pasos de "3. El establecimiento de una transfección transitoria" utilizando medio de cultivo fresco sustituida con residuos de aminoácido marcado como se preparó anteriormente.
      4. Después de 24 h de transfección, en el día de la dilución de la cultura, retirar 5,0 ml de precalentado Medio B, 40 ml de Medio A precalentado y un recién autoclave 4 ml alícuota de la mezcla de aminoácidos (preparado como en el paso 7.1.1. Supra) y añadir 1ml precalentado solución madre de solución de VPA para preparar 50 ml de medio de cultivo de dilución fresca con una concentración final de 4,4 mM de VPA. Añadir este medio a la cultura de la transfección usando una pipeta serológica estéril.
      5. Transferir el cultivo transfectado en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior del matraz con un 70% de etanol en solución acuosa, añadir el medio de dilución preparada y transferir el matraz de nuevo a la coctelera se incubaron.
        Nota: Semi-A es un medio libre de suero químicamente definido. Por lo tanto, es posible preparar una formulación diferente. Póngase en contacto con el proveedor para obtener una preparación personalizada Medio A que carece de ciertos aminoácidos. Es posible tener todos los aminoácidos dejados de lado, sin embargo, se prefiere usar medio que carece de pocos residuos seleccionados porque un medio de deserción escolar completa requeriría un ajuste de la osmolaridad después de la suplementación. Elegimos un medio de deserción Lys-Tyr-Phe que puede ser complementada y no requiere ajuste de la osmolaridad. Furthermore, el Medio Un proveedor no comparte libremente las concentraciones de los componentes del medio; hemos utilizado 100 mg / L de cada uno para Lys, Tyr y Phe con éxito. Los volúmenes del medio de transfección y expresión deben ajustarse para dar cuenta de los aminoácidos añadidos. Aquí están los ajustes en el protocolo anterior para el etiquetado de isótopos
    2. Complementar la transfección con una pequeña molécula
      1. Preparar solución de 100 mM de stock de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa utilizando agua tratada en autoclave y esterilizar esta solución usando un filtro de 0,22 mM.
      2. Para un cultivo de 50 ml, añadir 125 l (a 250 m) de la solución de análogo de fucosa a los medios de transfección y de dilución. Nota: descuidado para realizar cualquier ajuste de volumen aún más debido a la adición de la sustituyente en esta cuentas de concentración por sólo 0,25% del total de volumen de cultivo .Es es posible modificar la expresión utilizando inhibidores de molécula pequeña de procesamiento de glicano. Aquí se describen las condiciones para la inclusión de 2-desoxi2-fluoro-L-fucosa, un inhibidor de la fucosilación glicano. Encontramos> 90% de reducción en fucosilación añadiendo el análogo de fucosa a una concentración de 250 mM en el medio de transfección y dilución.

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Representative Results

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La expresión de proteínas de alto nivel y la pureza

Este sistema de expresión optimizado genera un alto rendimiento de proteínas glicosiladas. Un patrón típico se muestra en la expresión de IgG1-Fc (Figura 1). En este caso, Día 0 es el día de la transfección seguido por Día 1 (dilución) y días de cultivo subsiguientes hasta el día 5. La expresión de proteínas se analiza utilizando la fracción expresión soluble en el medio crudo. Se observó una cantidad muy pequeña de expresión de la proteína en el Día 1 como la alícuota de cultivo se retira 3 hr después de la dilución de cultivo. Esto es más fácil de visualizar con proteínas GFP-etiquetados que muestran un color verde distinto en el medio de cultivo. Se observó Tal aumento en la expresión de la GFP-FcRIIIa y GFP-ST6GalI del día 2 al día 5. No hay un aumento significativo en la expresión se observó entre el día 4 y el día 5. En el día 5, las células fueron <50%cultivo viable y por lo tanto se cosechó para limitar la proteólisis. La purificación por afinidad utilizando una columna de proteína A para Fc de IgG1 o una columna de níquel para GFP-FcRIIIa dio lugar a proteínas con alta pureza (> 99%; Figura 2), rendimiento (Tabla 1) y la glicosilación completa (datos no mostrados).

15 N o 13 C isótopos etiquetado de proteínas y glicanos

Este sistema expresa de manera eficiente isotópicamente enriquecido IgG1 Fc según el protocolo descrito. Aunque se observó una pequeña reducción en el rendimiento de proteína (25-50%), las señales bien dispersadas fueron vistos en un espectro de RMN 2D que correlaciona la frecuencia de resonancia de los átomos de H 1 y la amida directamente unido 15 átomos de N (Figura 3). Este nivel de expresión permite la producción de proteínas eficiente en la escala requerida para los estudios basados ​​en la estructura (típicamente 2-20mg de proteína) e ilustra la incorporación exitosa de los isótopos marcados en la proteína. El alto grado de similitud entre este espectro y los espectros publicados indican un alto grado de etiquetado de proteínas se produjo con un mínimo de aleatorización de los 15 N 43 etiquetas.

La producción de proteínas con diferentes N-glicanos

Diferentes glicoformas fueron producidos con las células HEK293F y HEK293s. Ionización de desorción láser asistida por matriz de espectrometría de masas (MALDI-MS) análisis de los N-glicanos liberados enzimáticamente-mostró las glicoformas esperados (Figura 4). Las proteínas expresadas a partir de células HEK293s albergado N-glicanos que eran de la forma Man ​​5 GlcNAc 2 y no contenían fucosa (Figura 4). Los glicanos a partir de material expresado-HEK293F eran de tipo complejo, las formas biantenarios con fucosa de núcleo y sobre todo que tiene terminalesN-acetilglucosamina (GlcNAc) o pequeña proporción de formas mono- o di-galactosilada (GAL). Aunque no se sabe lo que los N-glicanos nativos de ST6GalI y FcRIIIa son, el perfil de glicano para IgG1 Fc es muy similar a IgG1 Fc purificada a partir de suero humano 46. Las principales diferencias incluyen el grado de modificación; IgG1 Fc partir de suero humano muestra un mayor grado de galactosilación que la observada para la expresión HEK293F. La adición de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa, un inhibidor de la fucosilación glicano, a una expresión llevó a cabo usando la línea celular HEK293F mostró una dramática reducción> 90% en la incorporación de fucosa (Figura 4).

Figura 1
Figura 1: altos rendimientos de proteínas recombinantes se recuperan mediante la expresión a partir del vector pGEN2. (A - B) Dos expresión vreflectores utilizados en este estudio fueron generados a partir de un plásmido pIBI30 que contiene un casete de R amp y un E. origen de replicación coli. Nivel (C) Expresión de la proteína Fc de IgG1 secretada después de la transfección transitoria de células HEK293F. SDS-PAGE análisis muestra la acumulación de proteínas expresadas a partir del día 0 hasta el día 5 y se indica por la flecha. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Recuperación de la proteína expresada a partir del medio de cultivo. (A) IgG1-Fc, (B) GFP-FcRIIIa. "Medium" se refiere al medio de cultivo después de la centrifugación; FT = fluya a través de la fracción de la columna de purificación. Muestras de SDS-PAGE son pr epared en condiciones no reductoras y sin β-mercaptoetanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Aminoácidos etiquetado selectiva de IgG1 Fc 1 H- 15 N heteronuclear única espectro de coherencia cuántica de [15 N-Tyr; 15 N-Lys] marcado con Fc de IgG1 expresa utilizando células HEK293F en la costumbre Medio A complementado con (15 N ) marcado l-Tyr y L-Lys. Fueron asignados sobre la base de informes anteriores 43,47 picos cruzados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4:. Expresión de proteínas en presencia de moduladores de molécula pequeña de la composición de glicano N-glicano perfiles de IgG1 Fc expresado en células HEK293 usando diferentes condiciones de cultivo. El espectro de la parte superior se preparó usando glicanos aislados de IgG1 Fc expresado en células HEK293s. El espectro revela centro de las glicoformas IgG1 Fc a partir de material expresado en células HEK293F y el espectro inferior se prepararon de forma similar esperan que las células fueron cultivadas en presencia de un inhibidor de la biosíntesis de GDP-fucosa, 2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa. N-glicanos se presentan como diagramas de dibujos animados después de la convención CFG 5: acetilglucosamina N- (GlcNAc), cuadrados azules; Manosa (Man), círculos verdes; Fucosa (FUC) triángulos rojos; La galactosa (Gal), círculos amarillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<tbody>
Proteína Rendimiento (mg / L)
IgG1 Fc 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

Tabla 1: Rendimiento para diferentes proteínas expresadas en las células HEK293F.

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Este protocolo ilustra la expresión de proteínas a través de la transfección transitoria de células HEK293F o S. Las condiciones de transfección óptimas establecidas en los laboratorios de Barb y Moremen emplean una combinación crítica de las concentraciones de densidad celular y reactivos para lograr una alta eficiencia de transfección. Consideraciones críticas en la aplicación de este protocolo son: mantener una cultura estable antes de la transfección (con cultura coherente veces doblando); la transfección de células en crecimiento activo (que se logra por las células de dilución a 1 x 10 6 células / ml 24 hr antes de la transfección) con la viabilidad celular mayor que 95%; densidad celular en la transfección debe estar entre 2,5 a 3,0 x 10 6 células / ml en vivo con una viabilidad> 95% (densidad de transfección) en un cultivo que contiene 90% Medio A y el 10% Medio B; y, la adición de ADN antes de la adición de PEI a 3 mg / ml y 9 g / ml, respectivamente 31; a las 24 horas después de la transfección de la cultura se diluye 1: 1 en medio contaINING 4.4 mM de ácido valproico para dar lugar a una concentración de 2,2 mM de ácido valprioc en el cultivo diluido; el crecimiento fase de producción continúa entonces en un matraz de agitación humidificado a 37 ° C y 8% de CO 2 durante otros 4-5 días. El vector descrito aquí está optimizado y una característica importante del sistema de expresión de la proteína soluble 32,42.

Si una proteína diana no expresa, además de los factores enumerados anteriormente, múltiples otras variables pueden contribuir a los bajos rendimientos. Asegúrese de que la secuencia de ADN que codifica la proteína contiene codones optimizados para las células humanas. Esto se puede evaluar con múltiples recursos en línea. La esterilidad durante todo el procedimiento es de suma importancia. Un crecimiento activo y puro cultivo de células HEK293F debe aparecer ligeramente granulada a simple vista, y el medio debe ser mayormente despejado (particularmente a densidades celulares <1,0 × 10 6 células / ml).

Los cultivos contaminados con bacterias u hongos debesalir inmediatamente para evitar la propagación. Es importante mantener una cultura de la salud. Esto se logra mediante la inoculación de estos cultivos a una densidad de células de 0,3 × 10 6 células / ml. Densidades de inoculación más bajas pueden ralentizar la tasa de crecimiento al limitar el suministro de diversos factores de crecimiento necesarios para el crecimiento y la división celular 48. Como culturas han sido a pases durante más de 25 o 30 veces, se observó una disminución en la expresión. Por esta razón, los cultivos se pasaron más de 30 veces se descartan.

Es posible que la proteína se degrada en el medio de expresión, o el plazo de expresión es demasiado largo, que conduce a la degradación de proteínas. Por estas razones, es recomienda para monitorizar la viabilidad del cultivo y expresión de proteínas en cada día para determinar un plazo expresión óptima. Es importante para purificar proteínas lo más rápidamente posible después de la cosecha el medio. Para algunas proteínas, es útil para incluir inhibidores de la proteasa Durinpurificación g. En total, estos ajustes han mejorado la recuperación de proteínas en el Barb y Moremen laboratorios 42,43.

La transfección transitoria de células HEK293 ha demostrado una gran utilidad para la producción de proteínas solubles y dominios de proteínas que se dirigen naturalmente a la vía secretora. Es probable que la producción de las proteínas de membrana citoplasmática o integrales requerirá una optimización adicional. Una ventaja principal de este sistema es los sustratos nativos y maquinaria para la producción de proteínas están presentes y disponibles en las células HEK293 49. Esto explica en gran parte a sus ventajas sobre otros métodos de producción de proteínas recombinantes tales como bacterias sin o con limitadas modificaciones post-traduccionales, o sistemas de levadura y baculovirus con plegada correctamente pero diferentes N-glicoformas incorporan 1,50,51.

Además, el protocolo descrito aquí muestra la capacidad adicional para incluir bajo peso molecular comlibras tales como aminoácidos marcados, glucosa marcada o pequeñas moléculas diseñadas para modificar la composición N-glicano. Las células HEK293 también prueban expertos en la expresión de proteínas de no mamíferos, incluyendo enzimas de plantas, y soporta co-expresión de múltiples polipéptidos para la recuperación de los complejos de proteínas (datos no presentados).

La caracterización estructural y funcional de glicoproteínas es a menudo obstaculizada por problemas de producción de la muestra. El sistema de expresión de la proteína descrito aquí supera este inconveniente mediante la realización de modificaciones post-traduccionales usando el complemento natural de sofisticados enzimas de procesamiento de glicano intracelulares 6. Este protocolo robusto y sencillo se ha demostrado para la transfección transitoria de células HEK293 humanos de suspensión. Este método demostró rendimiento glicoproteína significativa (> 95 mg / L) con tres proteínas N-glicosilados y puede acomodar suplementos tales como residuos de aminoácidos marcados o las inh químicos de molécula pequeñaibitor 2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa. Las glicoproteínas expresadas pueden ser remodelados aún más después de la purificación para preparar una amplia gama de glicoformas definidos 52.

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Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado financieramente por las subvenciones K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) y P01GM107012 (KWM) de los Institutos Nacionales de Salud, y con fondos del Departamento de Roy J. Carver de Bioquímica, Biofísica y Biología Molecular en la Universidad Estatal de Iowa . El contenido de esta obra es de la exclusiva responsabilidad de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

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Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).More

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