Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

복잡한 번역 후 수정 재조합 단백질을 생산하는 기술은 구조와 기능 연구를위한 주요 과제를 나타냅니다. 일시적으로 형질 감염된 포유 동물 세포주로부터 신속한 확립하고 높은 회복 자연스럽게 ER 및 골지체 매개 분비 경로를 통해 표출되는 단백질을 발현하는 효과적인 수단이 장벽을 해결하고있다. 여기서 인간 HEK293F 및 높은 단백질 수율을 위해 설계 포유 동물 발현 벡터로 형질 감염된 HEK293S 세포 라인을 사용하여 단백질 발현을위한 하나의 프로토콜이다. 이 시스템의 적용은 문화의 리터 당 회수 정제 단백질의 95-120 mg의 사이의 수익률로 표현 세 대표하는 당 단백질을 사용하여 설명된다. 이들 단백질은 인간과 쥐 FcγRIIIa α2-6 시알 산 전이 효소, ST6GalI 모두 N 말단 GFP 융합으로 표현뿐만 아니라 변형되지 않은 인간 면역 글로불린 G1 된 Fc이다. 이 강력한 시스템 요로 감염동위 원소 적으로 농축 된 단백질 및 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광법을 이용한 구조 연구 탄수화물의 발현에 적응할 혈청 배지를 활용합니다. 또한, N 글리 칸의 조성물은 수율을 감소시키지 않는 방식으로 특정 당쇄 변형을 방지하는 작은 분자를 첨가함으로써 조절 될 수있다.

Introduction

구조와 기능에 대한 자세한 분석을 위해 적절하게 접혀 및 번역 후 변형 된 인간 단백질의 높은 수율을 생산하는 것은 중요한 과제로 남아. 발현 시스템의 많은 수의 네이티브와 같은 기능과 행동 재조합 단백질을 생산하는 사용할 수 있습니다. 효모, 식물, 곤충 및 포유 동물 시스템은도 1 ~ 4를 설명하지만 세균 발현 시스템, 주로 대장균 균주 인해 이들 발현 시스템의 단순성, 연구 분야에 가장 접근하고 일반적으로 사용되는 도구를 나타낸다. 그러나, 이들 시스템들의 대부분은 표적 단백질의 적절한 번역 후 변형 불가능하다. 바브와 Moremen 실험실의 근본적인 관심은 적절한 당질과 진핵 생물의 단백질을 생산하고있다. 대부분의 인간 단백질 (5) 적절한 기능에 적합한 글리코 실화를 필요로한다.

진핵글리코 실화가 광범위한 기계 모두 아스파라긴 (N)를 포함 변형의 다양한 범위를 제조 할 수있다 - 세린 / 트레오닌 (O)는 복합 글리 칸 6 -linked. 이것은 인간 단백질의> 50 % 7 N 글리코 실화가있는 것으로 추정된다. 글리 칸은 몇 가지 이름 인자 IX 같은 치료 단일 클론 항체, 에리트로 포이 에틴, 혈액 응고 인자 등 많은 단백질의 필수 구성 요소입니다. 여러 방법이 적절 N-당화 단백질을 준비하기 위해 존재하고 8-10 순수 합성에 이르기까지 다양하지만, 가장 강력한를 할 놀랍게도, 인간의 발현 시스템은 지금까지 입증되지 설계 재조합 시스템 15-20에서 11-14 또는 복구를 화학 효소합니다 인간 단백질을 생성하기위한 방법.

많은 인간 치료 용 당 단백질은 포유 동물 세포를 사용하여 재조합 시스템에서 생산된다. 주 시스템 중국 햄스터 난소 (CHO), 마우스 골수종 (NS0), 아기 햄스터 Kidne이다Y (BHK), 인간 배아 신장 (HEK-293) 및 단백질 생산 4,21,22에 대한 접착 또는 현탁 배양에 사용되는 인간의 망막 세포 라인. 그러나, 포유 동물 단백질의 발현 시스템은 안정 세포주 고가 성장 배지 및 형질 보조 기판 (23)의 시저 발생을 요구했다.

포유 동물 세포의 형질 감염은 칼슘 포스페이트 (24, 25), 양이온 성 중합체 (DEAE 덱스 트란, 폴리 브렌, 폴리 리신, 폴리 에틸 이민 (PEI)) 또는 양으로 하전 된 양이온 성 리포좀을 포함하여 다수의 제 26 ~ 29의 도움으로 달성된다. PEI는 다양 이온, 대전, 또는 ​​선형 DNA와 안정한 복합체를 형성하고있다 endocytosed 분기 고분자 (25 kDa의) (26)이다. 엔도 좀의 산성화되면, PEI는 세포질 26,30에 엔도 좀과 DNA의 릴리스의 파열로 이어지는, 팽창 생각된다.

suspensi에서 최근까지, 일시적 형질배양에서 세포 배양 물 (29)을 첨가하여 종래 DNA / PEI 복합체 형성에 의해 실시 하였다. 그러나 WURM 및 동료 31,32 동일계에서 DNA / PEI 복합체를 형성 HEK293 세포에서 재조합 단백질 생산을 위해 최적화 고효율 프로토콜을보고했다. 이 배지 내로 제제 복합체의 살균 및 버퍼 교환을 피했다. 상당한 수율 증가 (33)을 주도 식 향상 플라스미드를 포함하여 더 최적화. 여기에서 이러한 발전에 구축하고 광범위하게 적용하는 방법이다. 발현 조건도 글리 칸 N 조성에 영향을 위해 변경 될 수있다.

중간 단계에서 N 글리 칸 처리를 정지 유전자 결실 감염된 HEK293S 세포 라인은, (GlcNAc의 2 사람 5) 34 (2) N- 아세틸 글루코사민 잔기 플러스 다섯 만노스 잔기로 이루어진 균일 한 N 글리 칸으로 단백질의 발현에 이르게 (35). 이 세포N-acetylglucosaminyl 트랜스퍼 I (GntI) 하류 N-글리 칸 처리 (36, 37)에 필요한 유전자가 부족합니다. kifunensine, 시알 산 유사체와 푸 코스 아날로그 및 2- 데 옥시 -2- 플루오로 - 퓨 코스를 포함하여 당 전이 효소 억제제의 사용은 유사한 효과 및 N- 글리 칸 38-41 처리 한계를 가진다.

프로토콜은 여기에보고 한도 42,43에 도시 된 바와 같이 pGEn2 벡터를 사용하여, PEI를 이용한 일시적인 포유류 세포 선 (또는 HEK293F 감염된 HEK293S 세포)에 형질 감염하고, 적절히 글리코 실화 된 단백질의 높은 수율의 복구. 이 시스템은 강건하고, 재조합 단백질의 큰 역가의 제조 동위 원소 표지 및 당쇄 공학을 포함하는 다양한 요인을 수용 할 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

이 프로토콜 또는 HEK293F 감염된 HEK293S 세포를 사용하여 표현하기에 충분하다.

1. 셀 설립

  1. 문화 접종
    참고 : 모든 문화 조작 절차는 BSL-2 시설에서 실시되어야하며, 각 항목은 수용액에서 70 % 에탄올로 분사하여 살균해야하는 바이오 안전성 캐비닛에 가져왔다.
    1. 135 rpm으로, 80 % 습도에서 인큐베이터 쉐이커를 운영하고 8.0 % CO 2, 37 ℃에서. 작업에 적어도 1 시간 전에 바이오 안전성 캐비닛의 UV 램프 "의"를 켭니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 물 욕에서 밀봉 된 중간과 중간 B 병 Prewarm.
    2. 수용액에 70 %의 에탄올로 분무하여 벤트 캡, 피펫, 피펫과 데워진 미디어 병 125 ml의 삼각 플라스크 성장 살균. 바이오 안전성 캐비닛에 이러한 항목을 놓습니다. 참고 : 125 ml의 삼각 문화 플라스크를 덮고 바깥 쪽 플라스틱을 소독하고, 때 나는 만 제거바이오 안전성 캐비닛 내부의.
    3. 흔들어 혼합 (이후 신선한 배지로 지칭) 부드럽게 30 ㎖ 배양 용 26 중간 ㎖의 중간 B의 3 ㎖ (최종 배양의 10 %)을 회수하고, 125 mL의 삼각 배양 플라스크에 옮기고.
    4. 얼음에 배양 공간으로 이동 -80 ° C에 냉동 H​​EK293F 세포를 포함하는 세포의 전사 한 바이알. 주 : HEK293F 세포를 1 × 107 세포 / ml의 밀도로 제공된다.
    5. (이것은 약 1 분 소요되며 세포가 완전히 해동 안) 부분적으로 세포를 해동 37 ℃에서 수조에서 유리 병을 가볍게 가온. 수용액에 70 % 에탄올로 유리 병의 외부를 소독 및 바이오 안전성 캐비닛으로 이동합니다.
    6. 1 ml의 피펫을 사용하여, 세포 현탁액 (0.7 ml)에 인출하고, 신선한 배지 29 ml를 함유 125 mL의 삼각 플라스크에 옮긴다. 문화 플라스크의 커버를 닫고 배양 흔드는로 이동합니다.
    7. 셀 유지 보수 : 세포 밀도, 생존 세포 통로를 확인
      1. 아래의 프로토콜에 따라 문화의 해동의 24 시간 후 세포 밀도를 확인합니다. 참고 : 세포가> 80 %의 필수적인 세포의 성장과 생존을 보장하기 위해 해동 후 24 시간 동안 성장하고 있습니다.
      2. 수용액에 70 % 에탄올과 문화 플라스크를 소독 및 바이오 안전성 캐비닛으로 이동합니다.
      3. 1 ML의 피펫과 피펫을 사용하여 천천히 멸균 0.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 현탁 배양 및 전송 100 μl를 철회. 닫기 가능한 한 빨리 통에 다시 문화 플라스크를 전송합니다.
      4. 세포의 7.5 μL와 트리 판 블루 솔루션의 7.5 μl를 섞는다. 셀 / 트리 판 블루 혼합물의 7.5 μL와 적극적으로 혼합 및 계수 슬라이드로 전송.
      5. 자동 세포 계수기를 켜고 로딩 챔버로 계산 슬라이드를 배치합니다. 오토 리더가 활성화되어 세포 단위로 자동적으로 카운트mL 및 퍼센트 생존 당 세포의 수
      6. 0.3 × 106 살아있는 세포 / ml의 세포 밀도로 신선한 배지로 전송하기 위해 요구되는 도너 문화의 볼륨을 결정한다.
        참고 : 보충 자료의 샘플 계산을 참조하십시오.
      7. 단계를 반복 1.1.2 위의 "1.1 문화 접종"프로토콜의 1.1.3 신선한 배지에 필요한 자료를 준비합니다.
      8. 신선한 125 ml의 문화 플라스크에 중간 (23 ㎖) 및 중간 (B) (3 ml)에 전송합니다. 바이오 안전성 캐비닛에서 중간과 중간 B의 주식 병을 제거합니다.
        주 : 매체 병의 주식 293F HEK 세포와 동시에 바이오 캐비닛에 보관되어서는 안된다. 이것은 스톡 배지 병 오염의 가능성을 제한한다.
      9. 인큐베이터에서 H​​EK293의 세포 배양액을 제거하고 수용액에 70 %의 에탄올로 분무. (4 ml의 세포의 나누어지는을 철회, 새로운 피펫을 사용하여,이 책은 따라 T를 결정 하였다O의 배양 단계 1.2.6)와 신선한 배지를 함유하는 플라스크에 옮긴다.
      10. 1.1.1에 따라 설정 인큐베이터 쉐이커에 바이오 안전성 캐비닛에서 문화를 모두 전송합니다. 2-3 × 106 살아있는 세포 / ml의 농도로 세포를 대략적 성장.
        주 : 세포의 대략 배가 시간은 32 시간이다. 그것은이 밀도에 도달 3-4 일 소요됩니다. 최초의 형질 전환 이전에 세포의 안정적인 성장 패턴을 가지고 3-4 구절에 대한 세포를 품어.

    2. 형질에 대한 자료를 준비

    1. HEK293 세포를 준비 (1 일)
      1. 형질 감염 전에 새로운 배지 B 24 시간에 1 × 106 세포 / ml의 밀도로 배양 세포는 단계 1.2에있어서.
        주 : 형질 전환 배양 부피는 셀의 수에 의존 할 것이다. 큰 형질 볼륨 (> 20 ml)을이 단계에서 문화의 큰 볼륨을 필요로한다.
    2. 세인트 준비재료의 ocks
      1. 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 150 mM의 염화나트륨 (PH 7.5)를 함유하는 완충액에서 1 mg / ml의 농도로 선형 폴리에틸렌 이민 (PEI)의 스톡 용액을 제조 하였다. 완전히 PEI를 용해; 이 실온에서 30 ~ 60 분 정도 걸릴 수 있습니다. 장시간 사용을 위해 -20 ℃에서 0.22 μM 주사기 필터를 통해 살균 및 저장.
      2. (2.2.2.1-2.2.2.4 단계에 따라) 멸균 된 플라스미드 DNA를 준비합니다. 플라스미드 건설 절차 (42)는 다른 곳에 설명되어있다. DNA 준비를위한 간단한 절차는 여기에 설명되어 있습니다 :
        1. LB 배지 (Tryptone- 10g / L, 추출물을 5g / L 나트륨 클로라이드 - 10g / L 효모)가 보충 된 100 μg의 / 1 L에 pGEn2 벡터로 형질 전환 된 화학적 유능한 대장균 세포의 배양 물을 성장 ㎖의 앰피 실린. E. 대장균은 비 - 습윤, 진탕 배양기에서 37 ℃에서 성장된다.
        2. 마누 따른 pGEn2 벡터 부호화 대상 플라스미드 DNA를 정제하여의 facturer의 DNA 정제 프로토콜.
        3. 플라스미드 DNA의 완전한 무균 성을 보장하기 위해, 바이오 캐비닛 내부 DNA 추출 과정의 최종 이소프로판올 침전 단계를 수행 부유.
        4. 10,000 X에서 용출 된 DNA와 원심 분리기 (플라스미드 준비 키트에 지정) 이소프로판올의 볼륨을 추가 10 분 동안 G. 수용액에 70 % 에탄올로 DNA 용기의 외부 소독 및 바이오 캐비닛 내부에 옮긴다. 펫 및 사용 이소프로판올 뜨는 폐기 DNA 펠렛을 공기 - 건조. 일단 건조, 멸균 10 mM 트리스 완충액, pH가 8.0에서 펠렛을 재현 탁.
      3. 물에 220 밀리미터 발 프로 (VPA) 산의 주식 솔루션을 준비하고 멸균 0.22 μm의 필터를 통과하여 소독. 더 사용할 때까지 -20 ° C에서 솔루션을 저장합니다.

    3. 과도 형질 구축

    1. 형질 (일 0)
      1. 위의 "1.2. 셀 유지 보수"의 1.2.5 단계를 1.2.2에 따라 세포 밀도를 확인합니다. 형질 감염 (생존> 95 %와 2.5-3.0 × 106 살아있는 세포 / ml)에 대한 세포의 양을 결정한다. 보충 자료의 샘플 계산을 참조하십시오.
      2. 혈청 학적 멸균 피펫을 사용하여 250 mL의 원심 분리 튜브로 이전 단계 (여기에 67 ml)에 계산 된 현탁 배양 세포의 양을 전송. 100 × g으로 5 분간 원심 분리하여 세포를 수집한다.
      3. 한편, 새로운 형질 전환 배양 배지는 위의 "1.1. 문화 접종"에 따라 단계 1.1.3에 따라 준비합니다. 샘플 계산을위한 보충 자료를 참조하십시오. 또한, 멸균 15 ML 튜브에 신선한 문화 매체의 전송 5ml를 따로 설정합니다.
      4. 수용액에 70 % 에탄올과 튜브의 외부를 살균 번째 캔트하는 멸균 피펫을 사용 후 바이오 캐비닛으로 세포 펠렛을 함유하는 전열관소비 배지 이루어진 E 상등액.
      5. 격렬로 pipetting하여 신선한 배지와 형질 신선한 배지와 전사 플라스크에 10 ㎖를 사용하여 아래 펠렛 세포를 재현 탁 (위의 단계 3.1.3에서 제조). 배출 세포 배양 플라스크에 뚜껑을 나사와 진탕 15 분 - 1 시간 동안 (1.1.1에서 설정) 인큐베이터로 플라스크를 이동합니다.
      6. 이 시간 동안 플라스미드 DNA 및 0.5 μg의 / μL의 최종 농도 (위의 단계 3.1.3에서 인출 5 ml의 부피를 사용하여) 새로운 배지를 이용하여 PEI 축적량 희석. 보충 자료 샘플 계산은 DNA와 PEI의 양을 결정을 참조하십시오. 바이오 안전성 캐비닛에 분산 된 세포 배양 플라스크를 전송합니다.
      7. 마이크로 피펫을 사용하여 문화 플라스미드 DNA (0.5 μg의 / μL의 300 μL)를 추가하고 부드러운 수동 흔들어 섞는다. PEI 문화 (0.5 μg의 / μL의 900 μL)를 추가, 부드럽게 흔들어 섞는다. 신선한 막힌의 3.8 ML을 추가24 시간 동안 인큐베이터 쉐이커에 위의 단계 3.1.3 및 전송 플라스크에서 진짜야 매체.
      8. 1.1 단계에 따른 바이오 안전성 캐비닛을 청소합니다.
    2. (50 ㎖ 형질 볼륨) 희석 (1 일)
      1. 24 시간 동안 형질 문화를 품어.
      2. 1ml의 멸균 피펫을 사용하여 혈청학 및 멸균 50 ㎖ 튜브로 전송 (단계 2.2.3에 따라 제조 됨. VPA) 데워진 220 mM의 발 프로 산 1 ㎖를 철회.
      3. 5.0 데워진 중간 B ㎖의 데워진 중간의 44 mL의 인출 VPA 및 4.4 mM의 최종 농도로 신선한 배지 50 ㎖를 제조 멸균 피펫을 사용하여 혈청학 VPA 용액이 추가.
      4. 물을 용액에 70 % 에탄올로 플라스크의 외부 살균 후 바이오 캐비닛으로 형질 배양 이동 준비된 희석 매체를 추가 배양 진탕 플라스크로 다시 옮긴다.
    3. 발현 및 수확 (일 2-6)
      1. (5-6 일 형질 전환 이후 총) 추가 4~5일에 대한 세포를 품어.
      2. 단계 1.2.2 다음 배지의 분취 량을 철회. 1.2.5에. SDS-PAGE에 의해 하루에 단백질 발현을 분석 분취 액을 세포 생존 능력을 모니터링하고 저장, 멸균 1 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 위의 "1.2. 셀 유지 관리"에 설명 (아래, 제 5 장 참조).
      3. 5 분 1,000 g에서 세포 플러스 매체를 원심 분리하여 5~6일 후 수확 세포. 세포 생존율이 50 % 이하를 (단계를 참조 1.2.2-1.2.5) 떨어지면 또한, 상층 액을 수확.
      4. 분비 단백질을 포함 할 상층 액을 붓는다. HEK 세포 펠렛에 10 % 표백제의 5 mL를 추가하고 생물 학적으로 폐기하십시오.

    4. 단백질 정제

    1. 단백질의 세 파로스 5 ㎖로 열을 준비합니다. 버퍼 (3- 20 밀리미터 (5 컬럼 부피와 열 평형 N-모르 폴리 노) 프로판 산 (MOPS)의 pH 7.4, 100 mM의 NAC엘).
    2. 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 고속 (10 분 14,000g)에서 발현 된 단백질에 수집 된 상층 액을 원심 분리기. 신선한 튜브에 경사에 의해 수집합니다. 생물 학적으로 펠렛을 폐기하십시오.
    3. 상층 액의 10 μL 나누어지는을 수집하고 추가 SDS-PAGE에 의해 샘플을 분석하는 각각의 단백질 정제 단계에서 작은 샘플을 수집 (5 절에서 설명). 정화 된 상층 액을 넣고 통해 흐름을 수집합니다.
    4. 버퍼의 3 열 볼륨이 컬럼을 세척하고 100 mM의 글리신, 산도 3.0의 5 열 볼륨과 단백질을 용출. 급속 pH를 중화 1/2 1 M TRIS 완충액 용적, 8.0의 pH를 함유 튜브에 용출 물을 수집한다.
    5. 나중에 사용하기 위해 버퍼 및 저장의 10 열 볼륨에 열을 씻으십시오.
    6. 버퍼는 사용 10 kDa의 분자량 컷오프 필터를 원심 버퍼의 적어도 10 배 과량으로 용출 된 단백질을 교환한다. 참고 :에 용출 된 샘플을 집중하지 마십시오매우 낮은 볼륨 용출 버퍼 (<2 ㎖). A. 버퍼로 버퍼 교환 원심 필터를 사용
    7. 저장소는 다음에 사용할 때까지 4 ° C에서 단백질을 정제 하였다.
      주 : 상등액에서 발현 된 단백질은 단백질의 특성에 기초하여 또는 친 화성 태그의 사용을 선택적 친화 컬럼에 의해 정제 될 수있다. 전형적인 정제 절차, 단백질 열은 폴리 히스티딘 태그로 단백질 발현을 위해 사용될 수의 IgG 또는 니켈 된 Fc 단편 또는 열에 사용될 수있다. 여기서, 단백질의 칼럼을 사용의 IgG1-FC에 대한 정제 단계에 대하여 설명한다.

    SDS-PAGE에 의해 단백질의 분석 5.

    1. 배 로딩 완충액 (0.125 M 트리스, pH가 8.0, 4 % SDS, 10 % β 메르 캅토 에탄올, 20 % 글리세롤, 0.01 % 브로 모 페놀 블루)의 동량 각 샘플의 분취 량 (7.5 μL)를 희석.
    2. 열 블록 또는 수욕을 사용하여 5 분 동안 90 ℃에서 혼합물을 끓인다. 10,000g FO에서 샘플을 원심 분리기R 1 분. 마커 단백질의 5 μL와 일회용 팁 20 μL 피펫을 사용하여 분석을위한 시료 14 μL와 준비된 젤을로드합니다.
    3. 60 분 동안 25 밀리 암페어에 한 젤을 실행합니다. 전기 영동 단계가 완료되면, 물을 5 분 동안 전자 레인지로 1 L 용기에 겔을 전송.
    4. 물에 염색 액 (40 % 에탄올, 10 % 아세트산 및 0.1 % 쿠마시 브릴리언트 블루)을 2 시간과 함께 겔 destain 얼룩.

    질량 분석 6. 글리 칸 분석

    1. 이전 44 설명 된대로 글리 칸을 분석합니다. 간단히,의 IgG1-FC의 75 μg의 다음 글리 칸 (45)의 석방을 PNGaseF에 의해 처리, 트립신했다. 릴리즈 글리 칸은 메틸화 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 형 질량 분석계 (MALDI-TOFMS)를 사용하여 분석 하였다.

    특별 시나리오 7. 프로토콜 조정

    1. 15 N-와 단백질에 레이블(50 ㎖ 형질 볼륨) 아미노산 표지
      1. 단일 멸균 유리 바이알에 각각의 아미노산 5 ㎎을 분배. 물을 멸균 4 ㎖ (완전히리스와의 Phe는 달리, 용해하지 않는 티르 주)로 재현 탁. 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브에 의해 살균 용액. 이 솔루션은 50 ~ 60 ℃로 약 식히십시오.
      2. 50 ㎖ 형질 볼륨은 "3.1 과도 형질 전환 설정"에 따라 단계 3.1.3을 따르십시오. 적당한 볼륨이있는 예를 들어, 보충 자료 섹션을 참조하십시오.
      3. 형질 감염을 위해, 전술 한 바와 같이 제조 된 표지 아미노산 잔기로 치환 된 신선한 배지를 사용하여 "3. 일시적인 형질 설정"의 단계를 따른다.
      4. 형질 감염 24 시간 후에, 배양 희석 날에 데워진 매체 B의 5.0 ㎖, 데워진 보통 40 mL 및 아미노산 혼합물 갓 멸균 4 mL를 분취 인출한다 (단계 7.1.1에서와 같이 제조한다. 위) 1 추가VPA ㎖의 4.4 mM의 최종 농도로 희석 신선한 배지 50ml를 제조 VPA 용액 원액 데워진. 멸균 혈청 학적 피펫을 사용하여 형질 문화에이 매체를 추가합니다.
      5. 물을 용액에 70 % 에탄올로 플라스크의 외부 살균 후 바이오 캐비닛에 형질 배양을 전송 준비된 희석 매체를 추가 배양 진탕 플라스크로 다시 옮긴다.
        참고 : 중간는 화학적, 무 혈청 배지이다. 따라서, 다른 제형을 제조 할 수있다. 특정 아미노산이 부족 사용자 지정 중간 준비를 얻기 위해 공급 업체에 문의하십시오. 그것은 그러나, 우리는 완전한 강하 매체 보충 후 삼투압의 조정을 필요로하기 때문에 단지 몇 선택 잔기 부족 배지를 사용하는 것이, 모든 아미노산을 생략하는 것이 가능하다. 우리는 보충 할 수 있고, 삼투압 조절을 필요로하지 않는리스 - 티르 - 프 드롭 아웃 매체를 선택했다. 부rthermore, 중간 자유롭게 매체 성분의 농도를 공유하지 않습니다 공급 업체; 우리는 성공과리스, 티르와 Phe가 100 ㎎ / ℓ 각을 사용했다. 형질과 표현 매체의 볼륨은 추가 아미노산을 고려하여 조정해야합니다. 여기에 동위 원소 표지 위의 프로토콜에 대한 조정은
    2. 소분자로 형질 보충
      1. 멸균 물을 사용한 2- 데 옥시 -2- 플루오로 -1- 푸 코스의 100 mM의 스톡 용액을 제조하고, 0.22 μM 필터를 사용하여이 용액을 멸균.
      2. 50ml의 배양, 형질 희석 매체에 푸 코스 아날로그 용액 (250 μM에서) 125 μL를 추가한다. 참고 : 우리는 전체 배양 볼륨 .IT의 0.25 %이 농도 계정에 치환기를 추가하는 당쇄 처리 소분자 억제제를 사용하는 식을 수정하는 것이 가능하기 때문에 더 볼륨 조절을 수행하기 위해 무시. 여기서 우리는 2- 데 옥시 등의 조건을 기술2- 플루오로 -1- 푸 코스, 푸코 실화 글리 칸의 억제제. 우리는 형질 희석 배지에서 250 μM의 농도에서 푸 코스 유사체를 첨가함으로써 푸코 실화에서> 90 % 감소하는 결과.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

높은 수준의 단백질 발현 및 순도

이 최적화 된 발현 시스템은 단백질의 글리코 실화를 고 수율로 생성. 전형적인 패턴의 IgG1-FC (도 1)의 발현에 나타낸다. 이 경우, 주 0 조 배지에서 가용성 발현 분획을 사용하여 분석된다 주 5. 단백질 발현까지 1 일 (희석)이어서 형질 일 이후 배양 일이다. 배양 된 분취 량의 희석 배양 후 3 시간이 인출되었을 단백질 발현의 매우 소량 일 1에서 관찰되었다. 이것은 배지에서 뚜렷한 녹색을 표시 GFP 표지 된 단백질과 시각화를 용이하다. 이러한 증가는 5 일 하루 4 주 (5) 사이에 관찰의 날 (5)에 2 일에서 GFP - FcγRIIIa 및 GFP - ST6GalI의 표현에 대한 표현에 유의 한 증가가 관찰되지 않았다, 세포가 있었다 <50 %따라서 가능한 배양 단백질 분해를 제한하도록 수확 하였다. (> 99 %; 그림 2) GFP - FcγRIIIa 용의 IgG1 FC 또는 니켈 열의 열은 고순도 단백질의 결과 단백질 사용 선호도 정화, 수율 (표 1)과 완전한 글리코 실화를 (데이터가 표시되지 않음).

단백질과 글리 칸의 15 N 또는 13 C 동위 원소 표지

이 시스템은 효율적으로 설명한 프로토콜있어서의 IgG1 된 Fc 동위 원소가 풍부한 표현. 단백질 수율로 작은 감소 (25-50%)이 관찰 되었으나, 잘 분산 된 신호는 1 H 원자의 공명 주파수와 직접 결합 아미드 15 N 원자 (도 3) 연관 2D NMR 스펙트럼에서 관찰되었다. 발현 수준은 일반적으로 2-20 (기반 구조 연구에 필요한 규모에 효율적인 단백질 생산을 허용단백질 mg) 및 단백질로 표지 된 동위 원소의 성공적인 도입을 나타낸다. 이 스펙트럼과 출판 된 스펙트럼 간의 유사성의 정도가 높은 단백질의 표지 높은 최소 15 N 라벨 (43)의 스크램블링 발생 나타낸다.

다른 N-글리 칸과 생산 단백질

다른 글 라이코는 HEK293F 및 감염된 HEK293S 세포를 제작했다. 질량 분석 (MALDI-MS)을 효소 적으로 풀어 N 글리 칸 분석 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화가 예상 글리코 폼을 (도 4)에 나타냈다. 남자 5의 GlcNAc 2의 형식이었고, 더 퓨 코스 (그림 4)을 포함하지 N-글리 칸을 숨겨 감염된 HEK293S 세포에서 발현 된 단백질. HEK293F 발현 물질로부터 글리 칸은 단지 형, 코어 퓨 코스와 biantennary 형태와 주로 갖는 터미널했다N 아세틸 글루코사민 (GlcNAc의) 또는 모노 - 또는 디 - 갈 락토 실화 (GAL) 형태의 작은 비율. 이 ST6GalI과 FcγRIIIa의 기본 N-글리 칸이 무엇인지 알고 아니지만,의 IgG1 된 Fc의 글리 칸 프로파일은 인간 혈청 (46)로부터 정제의 IgG1 된 Fc에 매우 유사하다. 주요 차이점은 변형의 정도를 포함한다; 인간 혈청에서의 IgG1 된 Fc는 HEK293F의 발현을 관찰보다 갈락토스의 높은 수준을 보여줍니다. 식에 2- 데 옥시 -2- 플루오로 -1- 푸 코스, 당쇄 푸코 실화의 억제제의 첨가는 푸 코스 혼입에 극적인> 90 % 감소를 나타내었다 HEK293F 세포 라인을 사용하여 (도 4)를 수행 하였다.

그림 1
그림 1 : 재조합 단백질의 높은 수익률은 pGEn2 벡터에서 표현함으로써 복구됩니다. (A - B)는 두 식 V본 연구에 사용 된 ectors는 앰프 R 카세트 및 E.를 포함하는 pIBI30 플라스미드에서 생성 된 대장균 복제 기원. HEK293F 세포의 일시적인 형질 감염 후에 분비의 IgG1의 Fc 단백질 (C) 발현 수준. SDS-PAGE 분석은 주 5 일 0에서 발현 된 단백질의 축적을 보여주고 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 문화 매체로부터 발현 된 단백질의 복구. (A)의 IgG1-FC, (B)는 GFP-FcγRIIIa. "중간"원심 분리 후 배양 배지를 의미한다; FT =은 정제 컬럼에서 분획을 통해 흐른다. SDS-PAGE 샘플은 홍보입니다 β-머 캅토 에탄올없이 조건을 비 감소 epared. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :.의 IgG1 된 Fc의 아미노산 선택적 라벨의 1 H-15 N 이핵 단일 양자 간섭 스펙트럼 [15 N-티르 15 N-리스가]의 IgG1 된 Fc가 중간이 보충 사용자 정의에 HEK293F 세포를 사용하여 표현 - 표지 (15 N ) L-티르 및 L-리스 레이블. Crosspeaks는 이전 보고서 43,47에 따라 할당되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

_upload / 53568 / 53568fig4.jpg "/>
도 4 :. 당쇄 조성물의 작은 분자 조절 인자의 존재 하에서 단백질 발현 된 Fc의 IgG1의 N 글리 칸 프로파일은 다른 배양 조건을 이용하여 HEK293 세포에서 발현. 상위 스펙트럼의 IgG1 된 Fc가 감염된 HEK293S 세포에서 발현로부터 단리 글리 칸을 사용하여 제조 하였다. 중앙 스펙트럼 HEK293F 세포에서 발현 물질과 바닥 스펙트럼에서의 IgG1의 Fc 글 라이코 형태가 유사 세포 GDP 푸코 생합성 억제제, 2- 데 옥시 -2- 플루오로 -1- 푸 코스의 존재 하에서 배양 하였다 기대할 제조 하였다 보여준다. N-글리 칸은 CFG 규칙 5 다음 만화 다이어그램으로 표시하고 있습니다 : N- 아세틸 글루코사민 (GlcNAc의), 파란색 사각형; 만노스 (남자), 녹색 동그라미; 퓨 코스 (FUC) 빨간색 삼각형; 갈락토스 (갈)을, 노란색 동그라미. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<TBODY>
단백질 수율 (㎎ / ℓ)
의 IgG1 된 Fc (120)
GFP - FcgRIIIa (100)
GFP - ST6GalI (95)

표 1 : HEK293F 세포에서 발현 된 단백질에 대한 상이한 수율.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜은 S 또는 HEK293F 세포의 일시적인 형질 감염을 통해 단백질 발현을 도시한다. 바브와 Moremen 실험실 설립 형질 최적 조건은 고효율 형질 감염을 달성 셀 밀도 및 시약 농도의 중요한 조합을 채용한다. 이 프로토콜을 구현하는 중요한 고려 사항은 다음과 같습니다 (일관된 문화는 시간을 두 배로 포함) 형질 전환 이전에 안정적인 문화를 유지하는 단계; 95 % 이상 세포 생존 능력 (1 × 106 세포 / ㎖ 24 시간 이전에 형질 전환에에 희석 세포에 의해 달성) 적극적으로 성장하는 세포의 형질; 형질 세포의 밀도가 90 % 중간 10 % 중간 B를 함유하는 배양에서 생존> 95 % (형질 밀도) 6 10 × 2.5-3.0 사이 살아있는 세포 / ml이어야한다; 그리고, ml의 3 μg의 / 각각 31 9 μg의 / ㎖에서 PEI 추가하기 전에 DNA를 첨가하는 단계; 중간 접점에 1 : 24 시간 후 형질의 문화 1을 희석ining 4.4 mM의 희석 문화에 2.2 밀리미터 valprioc 산의 농도 결과에 발 프로 산을; 제조 단계 성장 후 추가 4~5일 37 ℃ 및 8 % CO 2의 가습 된 진탕 플라스크에서 계속된다. 여기에 기술 된 벡터를 최적화하고 가용성 단백질 발현 시스템 32,42의 중요한 특징이다.

목적 단백질을 발현하는 데 실패하면, 위에 나열된 요소 이외에 여러 다른 변수는 낮은 수율에 기여할 수있다. 단백질 코딩 DNA 서열이 인간의 세포에 최적화 된 코돈을 포함해야합니다. 이것은 여러 온라인 자원으로 평가 될 수있다. 절차 전반에 걸쳐 불임은 매우 중요합니다. HEK293F 세포의 활발하게 성장하고 순수 문화는 육안으로 약간 거친 표시해야하며, 매체 (특히 세포 밀도 <1.0 × 10 6 세포 / ㎖에서) 대부분이 명확해야한다.

세균이나 곰팡이해야 오염 된 문화즉시 확산을 방지하기 위해 제거 될 수있다. 것이 중요 건강한 재고 문화를 유지하는 것입니다. 이것은 / ㎖, 0.3 × 106 세포의 세포 밀도로 배양 물을 접종함으로써 달성된다. 저급 접종 밀도는 세포 성장 및 분열에 필요한 48 개의 다양한 성장 인자의 공급을 제한하여 성장 속도를 늦출 수있다. 배양 물은 25 개 이상 또는 30 회 계대 배양 한 바와 같이, 발현 감소가 관찰되었다. 이 때문에, 배양 30 시간은 폐기된다 계대.

이는 단백질이 발현 매체에서 분해되는 것이 가능하다, 또는 발현 기간은 단백질 분해에 주요한 너무 길다. 이러한 이유로, 최적의 발현시기를 결정하기 위해 각각의 일에 배양하고 생존 단백질 발현을 모니터링하기 위해 추천된다. 이것은 매체를 수확 후 가능한 빨리 단백질을 정제하는 것이 중요하다. 일부 단백질의 경우, 두린 프로테아제 억제제를 포함하는 유용G 정화. 전체적으로, 이러한 조정은 바브와 Moremen 실험실 42,43 단백질의 회수를 개선하고있다.

HEK293 세포의 일시적 형질 감염은 가용성 단백질 및 자연적으로 분비 경로를 타겟팅하는 단백질 도메인을 제조하기위한 큰 유틸리티를 도시하고있다. 그것은 세포질 또는 세포막 단백질의 생산이 더 최적화를 필요로 할 것 같다. 이 시스템의 주요 이점은, 단백질 생산에 대한 네이티브 기판과 기계는 HEK293 세포 (49)에 존재 가능하다. 이것은 주로 같은 아니 또는 제한 번역 후 변형, 또는 효모 및 배큘로 바이러스 시스템과 박테리아와 같은 다른 재조합 단백질의 생산 방법에 비해 장점에 계정이 제대로 접혀하지만 서로 다른 N-글리코은 1,50,51을 통합.

또한, 여기에 설명 된 프로토콜은 COM을 저 분자량을 포함하는 추가 기능을 도시이러한 표지 된 아미노산, 또는 표지 된 글루코스 N 글리 칸 조성물을 수정하기위한 소분자 파운드. HEK293 세포는 식물 효소를 포함한 비 - 포유 동물 단백질의 발현에 숙련 증명, 및 단백질 복합체의 복구를위한 복수의 폴리펩티드의 공동 발현을 지원한다 (데이터는 보이지 않음).

당 단백질의 구조적 및 기능적 특성은 종종 샘플 생산 문제에 의해 방해된다. 여기에 설명 된 단백질 발현 시스템은 정교한 세포 내 효소 처리 글리 칸 (6)의 보수를 이용하여 자연스러운 번역 후 변형을 달성하여 이러한 결점을 surmounts. 이 견고하고 간단한 프로토콜 현탁액 인간 HEK293 세포의 일시적인 형질 감염을 위해 검증된다. 이 방법은 상당한 당 단백질 수율을 보여 주었다 (> 95 ㎎ / ℓ) 세 N 글리코 실화 단백질 등과 같은 표지와 함께 아미노산 잔기 또는 소분자 화학 INH 같은 보조제를 수용 할ibitor -2- 데 옥시 -2- 플루오로 -1- 푸코. 당 단백질 발현은 상기 정의 된 글리코 폼 (52)의 다양한 제조 후 - 정제를 개조 할 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

이 작품은 재정적 보조금 K22AI099165 (AWB)에 의해, P41GM103390 (KWM)와 국립 보건원에서 P01GM107012 (KWM), 아이오와 주립 대학에서 생화학, 생물 물리학 및 분자 생물학의 로이 J. 카버 부서에서 기금에 의해 지원되었다 . 이 작품의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Tags

세포 생물학 문제 (106) 당 단백질 면역 글로불린 G 된 Fc 수용체 재조합 단백질 인간 HEK293F 및 감염된 HEK293S 세포

Erratum

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter