Summary
Este procedimiento se realiza de larga duración in vivo registros intracelulares de las neuronas individuales durante los estados cerebrales fisiológicamente relevantes y después de la abolición total de las actividades eléctricas en curso, lo que resulta en un estado cerebral isoeléctrico. Las constantes fisiológicas del animal son monitoreados cuidadosamente durante la transición a la condición comatosa artificial.
Abstract
La información de proceso manera neuronas depende tanto de sus propiedades intrínsecas de membrana y en la dinámica de la red sináptica aferente. En particular la actividad de red generado endógenamente, que varía fuertemente en función del estado de vigilancia, modula significativamente la computación neuronal. Para investigar cómo las diferentes dinámicas cerebrales espontáneas impactan propiedades de integración neuronas individuales ', hemos desarrollado una nueva estrategia experimental en la rata que consiste en la supresión in vivo toda la actividad cerebral por medio de una inyección sistémica de una alta dosis de pentobarbital sódico. actividades corticales, controlados continuamente por electrocorticograma combinado (ECoG) y registros intracelulares se ralentizan progresivamente hacia abajo, lo que lleva a un perfil isoeléctrico estable. Este estado cerebro extrema, poniendo la rata en un estado de coma profundo, se controló cuidadosamente mediante la medición de las constantes fisiológicas del animal a lo largo de los experimentos. r intracelularecordings nos ha permitido caracterizar y comparar las propiedades de integración de la misma neurona integrado en la dinámica cortical fisiológicamente relevantes, tales como las encontradas en el ciclo de sueño-vigilia, y cuando el cerebro estaba totalmente en silencio.
Introduction
En la ausencia de estímulos ambientales o tareas de comportamiento, el "reposo" cerebro genera un flujo continuo de la actividad eléctrica que se puede grabar desde el cuero cabelludo, como las ondas electroencefalográficas (EEG). La correlación intracelular de esta actividad cerebral endógeno se caracteriza por fluctuaciones de la tensión de la membrana de fondo (también conocidos como "ruido sináptica"), que se componen de una combinación de los potenciales sinápticos excitatorios e inhibitorios que reflejan la actividad en curso de redes aferentes 1,2. Esta actividad espontánea varía en frecuencia y amplitud con los diferentes estados de vigilancia. Dilucidar el impacto de la actividad de red en la excitabilidad y capacidad de respuesta de las neuronas individuales es uno de los principales retos de la neurociencia 3,4.
Muchos estudios experimentales y computacionales han explorado el impacto funcional de la actividad sináptica en curso sobre el propertie integradoras de las neuronas. Sin embargo, el papel de los diferentes parámetros neuronales afectadas por el ruido de fondo sináptica sigue siendo difícil de alcanzar. Por ejemplo, el nivel medio de despolarización de la membrana se ha encontrado de manera positiva o negativamente 5,6 7-9 correlacionada con la capacidad de las entradas sensoriales para disparar los potenciales de acción. Además, mientras que algunas investigaciones sugieren que las fluctuaciones del potencial de membrana, lo que resulta de una corriente que varía continuamente de entradas sinápticas aferentes, afectan en gran medida la capacidad de respuesta de las neuronas individuales mediante la modulación de la ganancia de su relación de entrada-salida 3,10-13, otros indican que cambios en la conductancia de entrada de la membrana mediada por la inhibición de maniobras son suficientes para modular la ganancia neuronal, independientemente de la magnitud de las fluctuaciones de membrana 14,15. Por último, estudios recientes realizados en animales despiertos hicieron hincapié en cómo el procesamiento de la información sensorial en una sola neurona depende de manera crítica de la situación de la vigilancia de unand la corriente 16,17 demanda de comportamiento.
Una estrategia sencilla para elucidar el papel funcional de un proceso determinado en un sistema altamente interconectada es determinar cómo su ausencia altera específicamente el funcionamiento del sistema. Este método se ha utilizado ampliamente en la investigación en neurociencias, por ejemplo utilizando las lesiones experimentales o inactivación de diferentes áreas del cerebro 18-21, o el bloqueo farmacológico de los canales iónicos específicos 22,23. En particular, se ha aplicado in vivo para dar a conocer cómo las dinámicas de conectividad de red y funcionales afectan cómputo sola célula 24-27. Sin embargo, hasta la fecha manipulaciones locales destinados a bloquear la activación de las neuronas y / o perturbar sus propiedades biofísicas básicas pueden ser parcialmente efectivos y están limitadas a un volumen relativamente pequeño del cerebro 28.
Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un nuevo enfoque experimental in vivo enla rata para comparar las propiedades electrofisiológicas de las neuronas individuales registradas en un estado cerebro dado, es decir, incrustados en una red dinámica particular, a los obtenidos después de la supresión completa de la totalidad del cerebro actividad sináptica 29. En las condiciones de control, dos dinámicas distintas corticales se podrían generar. electrocorticográfica patrones de sueño-como (ECOG) fueron inducidas por la inyección de dosis moderadas de pentobarbital sódico. Alternativamente, las ondas de ECoG rápidos de pequeña amplitud comparable a la actividad cortical subyacente el estado de vigilia (patrón de vigilia-like) podrían ser producidos por la inyección de fentanilo. Posteriormente, mientras se mantiene la misma ECoG y registro intracelular, un silenciamiento completo de la actividad eléctrica cerebral endógeno se obtuvo por inyección sistémica de una alta dosis de pentobarbital de sodio, que se caracteriza por ECoG isoeléctrico y actividades intracelulares. Debido a que la inducción de un estado de coma tan extremo podría tener potencialmente fatal CONSECUENTEces sobre las funciones biológicas, una atención cuidadosa y constante de las variables fisiológicas era esencial. Por lo tanto, nosotros seguimos meticulosamente la frecuencia de latido del corazón, la concentración de CO 2-final de la espiración (ETCO 2), la saturación de O 2 (SpO2) y la temperatura central de la rata largo de los experimentos.
Evaluamos propiedades de las neuronas individuales durante estos diferentes estados utilizando microelectrodos afilados, que son particularmente adecuados para grabaciones largas y estables in vivo. El procedimiento descrito aquí, se puede combinar con otros métodos electrofisiológicos y de imagen y podría extenderse a otros modelos animales.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Unión Europea (Directiva 2010/63 / UE) y aprobado por el Comité Ético de Charles Darwin sobre la experimentación con animales. Se describe aquí el procedimiento que utilizamos habitualmente en nuestro laboratorio, sin embargo la mayoría de las medidas se pueden adaptar para satisfacer las necesidades específicas de cada uno.
1. Preparación quirúrgica
Nota: Todos los puntos de incisión y de presión deben ser infiltrado en varias ocasiones con anestésico local (lidocaína o bupivacaína). El presente procedimiento es terminal, si se requiere una preparación aséptica varias modificaciones deben ser implementadas.
- Anestesiar una rata con pentobarbital sódico (40 mg / kg) y ketamina (50 mg / kg) en dos inyecciones intraperitoneales separadas localmente (IP).
- Deje que el animal vaya bajo anestesia general y en repetidas ocasiones verificar que un plano quirúrgico de anestesia se alcanza (sin reacción a los pies pellizcos). Coloque la rata en una Feedback manta eléctrica e inserte una sonda rectal para mantener la temperatura del núcleo en torno al 37 ° C.
- Colocar un catéter en la cavidad peritoneal para facilitar la inyección subsiguiente de agentes anestésicos y para evitar la perforación de órganos por pinchazos de aguja repetidos 30.
- Cortar el pelo sobre un pequeño (~ 2 - 3 mm) zona superior una región situada en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del estómago.
Nota: Crema depilatoria también se puede utilizar. - Hacer un 2 - 3 mm incisión en la piel con unas tijeras afiladas o un bisturí. Utilizando disección roma, eliminar las capas de grasa y músculo hasta que se observa la cavidad peritoneal.
- Inserte aproximadamente 1 - 2 cm de un pequeño catéter en la cavidad y cerrar la herida con pegamento quirúrgico.
(. Por ejemplo, 2 French - correspondiente a 0,043 mm de diámetro interior): Nota El diámetro y la longitud total del catéter deben ser mínimos para reducir los volúmenes muertos. tubos de poliuretano son los más adecuados. - Haga un lazo de sutura y tél catéter a la piel para asegurarlo en su lugar.
- Cortar el pelo sobre un pequeño (~ 2 - 3 mm) zona superior una región situada en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del estómago.
- Instalar un tubo traqueal para controlar la ventilación durante la respiración artificial.
- En cuanto a la etapa anterior, preparar el área de interés (1 - 2 cm sobre la tráquea justo por encima del manubrio), quitar el pelo y una incisión en la piel.
- Blunt diseccionar las primeras capas de grasa y músculos, a continuación, pasar la glándula salivar a un lado y exponer la tráquea mediante la disección suavemente la última capa de músculos.
- Retirar con cuidado los tejidos más de la tráquea y deslice un hilo por debajo de ella mediante pequeñas pinzas. Hacer un nudo de cirujano con el hilo pero no lo hacen apretado todavía.
- Incisión en la tráquea de manera transversal entre dos anillos cartilaginosos. sangre hisopo en la tráquea en su caso.
- Insertar un tubo traqueal con el diámetro apropiado y apretar el nudo del hilo para asegurar el tubo estacionario. Para una estabilidad adicional del hilo adicional se puede conectar en un punto del tubo de la tráquea superior.
- Suture la herida cierre o bien utiliza grapas quirúrgicas. Evitar pegamento quirúrgico aquí si el tubo traqueal está destinado a ser reutilizado.
- Instalar el animal en un marco estereotáxico y vigilar atentamente las siguientes variables fisiológicas: ECoG, SpO 2, ETCO 2, la frecuencia cardíaca (a través de un electrocardiograma, ECG) y la temperatura interna. Vigilar y ajustar estas variables para mantener una profundidad adecuada de la anestesia y estado fisiológico. Específicamente, complementar la anestesia con una pequeña dosis (10 mg / kg) de pentobarbital sódico, si es necesario.
- Aplicar pomada ocular en ambos ojos para evitar la desecación. Cortar el pelo en el cuero cabelludo, hacer una incisión longitudinal (~ 2 cm) y la resección de los tejidos conectivos que recubren el cráneo utilizando un bisturí o una cureta.
- Hacer un pequeño craneotomía (~ 1,5 mm de diámetro) sobre la región de interés con un taladro dental.
Nota: En este caso, el campo barril de la corteza somatosensorial primaria está dirigida (7 - 8 mm por delante de la línea interauricular, 4,5- 5,5 mm lateral a la línea media 31). Enjuagar varias veces para disipar el calor. - El uso de fórceps finos adicional para hacer suavemente un pequeño orificio en la duramadre. Reservar una región ~ 0,5 mm dentro de la trepanación craneana para colocar el electrodo ECoG (véase el paso siguiente). Permanentemente mantener la corteza húmedo con una solución de NaCl 0,9% (o fluido cerebro-espinal artificial).
- Colocar una impedancia baja (~ 60 kW) electrodo de plata (el electrodo de ECoG) en la duramadre, evitando la región cortical no cubierto por las meninges, y colocar el electrodo de referencia en un músculo del cuero cabelludo en el otro lado de la cabeza.
- En esta etapa (30 min después de la inyección de pentobarbital última de sodio), mantener la anestesia mediante inyecciones repetidas de pentobarbital sódico (10-15 mg / kg / h) o fentanilo (3-6 mg / kg / h) a través del catéter IP. La primera tendrá como resultado una lenta oscilatoria,, patrón de ECoG similar al sueño mientras que el segundo se traducirá en una vigilia similar, el perfil cortical desincronizado.
- Ajuste el v artificialsistema ENTILACIÓN modo que la frecuencia respiratoria y el volumen son similares a las de la respiración espontánea de la rata (rango normal 70-115 respiración / min 32). A continuación, conecte la ventilación mecánica al tubo traqueal y verificar la inflación caja torácica adecuada (en ambos lados). Si no, ajuste la posición de la tubería de ventilación en el eje traqueal. Si es necesario, aspirar la secreción presente en la tráquea con un catéter conectado a una jeringa o una bomba de vacío.
- Si todas las variables fisiológicas 32-35 y ECoG 29,36 patrones reflejan un plano quirúrgico estable de la anestesia, hacer una inyección intramuscular de trietioduro de galamina en cada pierna para paralizar la rata, 40 mg / kg para la primera inyección y luego 20 mg / kg , cada 2 horas 19,29,36,50.
2. registros intracelulares
- Tirar de una micropipeta de vidrio (en punto de microelectrodos) con una punta de ~ 0,2 micras como su resistencia varía entrn 50 y 80 mO una vez llenos de 2 M de acetato de potasio (KAC).
- Coloque la pipeta en un soporte específico con una plata / plata-cloruro de alambre (Ag / AgCl) para conectar la solución de la pipeta a un amplificador intracelular (a través de una etapa de la cabeza). El soporte debe estar unido a un micromanipulador. Colocar un electrodo de referencia Ag / AgCl sobre los músculos del cuello de la rata.
- Introducir lentamente la pipeta en el cerebro hasta la región de interés y verificar su resistencia mediante la supervisión de las caídas de tensión en respuesta a medidas actuales. Utilice el zumbido (o zap) botón del amplificador para limpiar la pipeta si es necesario.
- Use hisopos de algodón o triángulos de absorción sintéticos para secar la craneotomía (tenga cuidado de no tocar la ECoG o electrodos intracelulares) antes de cubrirla con elastómero de silicona o 4% de agarosa para reducir los movimientos del cerebro.
- Bajar la pipeta de 1 - 2 micras pasos hasta que su resistencia aumenta cuando se acerca a una célula. A continuación, utilice la función de zumbido del amplificador al Penetradel te en la neurona.
3. inducir el estado isoeléctrico
- Realizar el protocolo experimental apropiado (por ejemplo, corrientes respuestas a disparar inyecta de forma intracelular, las relaciones corriente-tensión, las respuestas de los estímulos sensoriales) en esta etapa mientras se controla simultáneamente el potencial de membrana de la neurona, la ECoG y las variables fisiológicas.
- Asegúrese de que el electrodo intracelular es estable en la célula mediante el análisis de la estabilidad tanto del potencial de membrana y la acción de posibles propiedades a lo largo de la sesión de grabación. Si no es así, no se vaya al siguiente paso y esperar hasta que la grabación se estabiliza de nuevo o buscar otra neurona.
- Inyectar una dosis alta, pero infra-letal de pentobarbital sódico (~ 90 mg / kg, puede ser tan bajo como 35 mg / kg de la condición inicial pentobarbital y hasta 155 mg / kg de la condición inicial de fentanilo) a través de la línea IP.
Nota: Dentro de 15 - 20 min intracelular y la wa ECoGveforms deben reducir la velocidad con silencios eléctricos intermitentes para alcanzar transitoriamente el llamado "estallido de la supresión" perfil 37,38, que colapsa progresivamente a un estado isoeléctrico completa. Se espera que el ritmo cardiaco se ralentiza significativamente a la baja (por ~ 10 - 20%) pero la SpO 2 y CO 2 ef debe permanecer relativamente constante. - Si no se alcanza el estado isoeléctrico, inyectar una pequeña cantidad de pentobarbital sódico (~ 10% de la dosis paso 3.1). Espere 15 minutos antes de añadir más anestesia si todavía no se alcanza el estado isoeléctrico.
- Repita el protocolo experimental para comparar el impacto de la dinámica de la red de propiedades de integración de la neurona registrada.
Nota: Después del cese de las inyecciones anestésicas, la actividad eléctrica del cerebro debe recuperarse por completo dentro de 3 a 4 horas. - Al final del experimento, inyectar una dosis letal de pentobarbital de sodio (200 mg / kg, IP) para la eutanasia la rata.
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Representative Results
Inducir y mantener un estado cerebral isoeléctrico es un delicado procedimiento experimental in vivo. Se ha demostrado ser una herramienta poderosa para estudiar directamente el impacto de la actividad de la red cortical en la excitabilidad neuronal y función de transferencia 29. La Figura 1 muestra el control de múltiples parámetros, incluyendo ECoG y las constantes vitales, de estado fisiológico del animal antes (Figura 1A ) y después de la Figura 1B) inducción del estado isoeléctrico (.
Figura 1. El monitoreo de los parámetros fisiológicos en el Control y Condiciones isoeléctrico.
A y B, grabaciones simultáneas de ECoG (top trazas) y los parámetros fisiológicos durante el estado activo cortical (A) y submarinosisoeléctrico periodo equent (B). La temperatura central (Temp.), ETCO 2 y SpO 2 son esencialmente estable durante todo el experimento. Tasa de latidos del corazón, por el contrario, disminuye progresivamente después de la inducción del estado isoeléctrico (de 382 a 349 latidos / min), como se ve en el ECG. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Durante las sesiones de control, los parámetros fisiológicos fueron similares a los medidos en animales sanos y despiertos 32-35 y no se vio afectado después de la inducción del estado isoeléctrico, a excepción de la frecuencia cardíaca que fue ligeramente más lento hacia abajo (Figura 1). Esta es un punto importante, ya que la hipoxia o hipercapnia 39 40 puede alterar significativamente la excitabilidad neuronal y por lo tanto puede introducir un sesgo grave en un espárrago y la exploración de un estado que dependen de la modulación del cerebro de propiedades de integración neuronales.
Obtuvimos el estado isoeléctrico a partir de dos condiciones iniciales diferentes que imitan la dinámica endógena-corticales generados durante las primeras etapas del sueño (Figura 2Aa, panel izquierdo) o durante la vigilia (Figura 2Ab, panel izquierdo). Estos estados activos fueron inducidos bien por inyección de pentobarbital sódico (sueño) o fentanilo (vigilia similar). En ambos casos, la inyección subsiguiente de una dosis alta de pentobarbital de sodio dio como resultado una supresión completa de la actividad espontánea en la ECoG y las neuronas simultáneamente grabadas (Figura 2Aa y b, paneles de la derecha), de ahí el término isoeléctrico. La supresión de la actividad sináptica en curso dio como resultado una hiperpolarización constante significativa del potencial de membrana neuronal (Figura 2B).
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Figura 2. Las consecuencias de la supresión de la actividad sináptica espontánea sobre la Dinámica de potencial de membrana.
(A) grabaciones representativas simultáneas de ECoG (top trazas) y las actividades intracelulares (Intra, rastros de fondo) durante el sueño-como (A a) y la vigilia similar (A b) patrones (paneles de la izquierda), y durante los correspondientes épocas isoeléctricos posteriores (en los tiempos indicados después de la inyección de supresión; isoeléctrico, paneles de la derecha). El análisis tiempo-frecuencia de señales de ECoG (densidad de energía para el 0 - 50 Hz rango de frecuencias) se representa mediante escalas de color. Densidades (B) de probabilidad (P) de los valores de potencial de membrana (Vm, tamaño bin 0,5 mV, 10 segundos de la grabación) de las neuronas ilustrados en el panel A. Esta cifra se ha modificado, con autorización, de 29 de ref./ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para ilustrar el impacto funcional de este estado cerebral extrema, se extrajeron las propiedades intrínsecas pasivos y activos de las neuronas isoeléctricos y los comparó con los medidos durante la condición inicial correspondiente. Utilizando esta estrategia, hemos demostrado que las neuronas podrían disparar los potenciales de acción en respuesta a la inyección intracelular de despolarización de corriente durante el estado isoeléctrico, lo que demuestra que permanecieron completamente excitable incluso después de la supresión completa de fondo la actividad sináptica (Figura 3Aa y b, isoeléctrico). Por otra parte, se encontró que la función de transferencia de las neuronas, evaluada mediante la medición de la frecuencia de disparo inducida por pasos de la corriente de intensidad creciente (relación FI) despolarizante, era derecha desplazado en comparación con las condiciones iniciales activos, lo que indicauna disminución en la sensibilidad de las neuronas a las entradas excitadoras débiles (Figura 3B). La correspondiente ganancia neuronal, es decir, la pendiente de la curva de FI, se mantuvo sin cambios o se redujo cuando el estado de control era del tipo de vigilia o sueño-, respectivamente (Figura 3B). Sorprendentemente, la resistencia de entrada aparente de las neuronas no se modificó significativamente en la ausencia de unidad sináptica en comparación con las condiciones de control activos (Figura 3AA, b). Más resultados, incluyendo análisis de la población y la cuantificación de los patrones de descarga de las neuronas temporales en las condiciones activas y isoeléctricos, están disponibles en nuestro documento inicial 29.
Figura 3. Efecto comparativo de los patrones de actividad en tres cortical propiedades de la membrana y las relaciones de entrada-salida.
(A) Voltag respuestas e (trazas medio) de las neuronas corticales somatosensoriales a despolarizantes y pulsos de corriente de hiperpolarización (trazas abajo) durante el sueño-como (A a) y la vigilia similar (A b) los patrones de ECoG (Top registros) y después de la privación de la actividad sináptica (isoeléctrico ). Resistencia de la membrana de entrada (R m, los valores se indican) se midió a partir de las caídas de tensión (trazas grises, promedios de 20 ensayos) inducidas por inyecciones de impulsos de corriente de hiperpolarización (-0,4 nA). (B) Curvas FI correspondientes, proporcionando la función de transferencia de las neuronas ilustrados en el panel (A). La tasa de disparos fue medida en respuesta a pulsos de corriente de despolarización (200 ms de duración) de intensidad creciente. Cada intensidad de la corriente se aplicó 20 veces y las tasas de disparo correspondientes se promediaron. Las líneas discontinuas indican las respuestas celulares que se muestran en (A). Esta cifra se ha modificado, con autorización, de 29 de ref.cargar / 53576 / 53576fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se describe aquí un nuevo método para suprimir in vivo la actividad eléctrica cerebral espontánea, tanto en los niveles celulares de la red y. Este procedimiento conduce a un estado del cerebro extrema, conocida como estado de coma isoeléctrico 41. Desde un punto de vista clínico, una inactividad tales electrocerebral es la anomalía más grave que se puede ver en el EEG. Se asocia sobre todo con un coma irreversible, con todos los pacientes, ya sea que mueren o continuas en un estado vegetativo persistente 42, pero se puede revertir al menos parcialmente cuando es causada por una intoxicación con medicamentos depresores del sistema nervioso central (como tiopental), una hipotermia accidental 42 o un paro cardiaco por asfixia 43. En nuestro paradigma experimental, estado isoeléctrico se logra progresivamente por una inyección sistémica de pentobarbital sódico a altas dosis, que induce primero rápidamente una reducción en el contenido de frecuencia ECoG, a continuación, un modo "de supresión de explosión"41,42, lo que conduce finalmente a una completamente plana ECoG. En el nivel intracelular, la desaparición de la actividad espontánea sigue un curso de tiempo similar con la reducción concomitante de despolarización de la membrana y la hiperpolarización fluctuaciones potenciales. Por lo tanto, puede ser la hipótesis de que la inyección de pentobarbital de sodio aumenta primero la transmisión sináptica inhibidora conduce a una reducción de la actividad de las neuronas corticales de tiro, la supresión progresiva de la transmisión sináptica excitatoria y la inhibitoria que finalmente resulta en ECoG isoeléctrico y actividades intracelulares 29,44. Transiciones similares de activo a patrones de ECoG isoeléctricos se pueden obtener tras la administración de otros agentes anestésicos tales como ketamina (observación personal) o isoflurano 45,46.
El procedimiento puede aparecer relativamente sencillo. Sin embargo, debido a la coma extremadamente profunda inducida, el mantenimiento de las variables fisiológicas básicas dentro delos rangos normales es de suma importancia para el éxito del experimento. Los cambios en ETCO2 fluctuaciones pueden ser el resultado de un tapón de moco que forma en la tráquea. En tal situación, el ventilador debe ser desconectado y el moco rápidamente aspirado o eliminada a través del tubo traqueal. Por otra parte, la estabilidad mecánica de la preparación es crucial para las grabaciones intracelulares. Por lo tanto, se deben hacer esfuerzos especiales para reducir vascular y pulsaciones respiratorias, ajustando cuidadosamente el cuerpo del animal con relación a la cabeza, mientras que el mantenimiento de una alineación apropiada tubo traqueal, y mediante la aplicación de agarosa o de elastómero de silicona en la craneotomía. También es necesario evitar las contracciones musculares espontáneas por inyección de un agente paralizante. Por último, las vibraciones ambientales y ruido eléctrico deben reducirse tanto como sea posible. Otras publicaciones detalle los pasos esenciales para una óptima preparación en vivo que permiten intracelular estable o patch-clamp queregistros de célula le 29,47-50.
La capacidad de desacoplar neuronales propiedades intrínsecas de membrana y la dinámica de las redes es esencial para diseccionar los mecanismos por los que las neuronas individuales procesan la información en su entorno altamente conectado. Como se ha dicho en la introducción, los estudios anteriores dedicados a este tema central de las neurociencias fundamentales condujeron a resultados contradictorios, en parte debido a las características específicas de las neuronas y redes investigadas y las diversas condiciones experimentales, incluyendo in vitro frente a las preparaciones in vivo y, finalmente, la diferentes procedimientos anestésicos utilizados (véase, por ejemplo 29,36,51). Proponemos que el presente enfoque podría utilizarse para validar y, posiblemente, conciliar, los resultados obtenidos de la reducción en la preparación vitro y de los experimentos in vivo. De hecho, permite examinar directamente y comparar en la misma neurona y en el curso de el mismo procedimiento experimentalel impacto de distintos patrones de entradas sinápticas aferentes, de la dinámica de vigilia-como para completar la inactividad, en las propiedades de integración neuronales en un animal vivo.
Una característica distintiva de este protocolo es que, una vez dominado, podría ser combinada con otras técnicas experimentales, como la superficie y EEG profundidad grabaciones de múltiples sitios, indicadores fluorescentes genéticamente codificados investigaciones basadas y de imagen incluso hemodinámica y metabólica del cerebro, para investigar la multidimensional propiedades del cerebro isoeléctrico. Como perspectivas clínicas y de diagnóstico, ya que hemos demostrado que las neuronas son todavía excitable durante comatoso isoeléctrico persistente, sería relevante para probar las funciones corticales, por ejemplo, el procesamiento de la información sensorial, de los pacientes y modelos animales inmersos en tal estado patológico del cerebro inactividad.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Francia, el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, la Universidad Pierre y Marie Curie y el programa 'Investissements d'avenir "ANR-10-IAIHU-06.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Centravet | Pentobarbital | |
| Ketamine 500 | Merial | Imalgène 500 | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag | Fentanyl | |
| Xylocaine | Centravet | Xylovet | |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134 | |
| ECoG amplifier | A-M Systems | AC amplifier, Model 1700 | |
| Intracellular amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | |
| Data acquisition interface | Cambridge Electronic Design | CED power 1401-3 | |
| Data analysis software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 7 | |
| micromanipulator | Scientifica | IVM-3000 | |
| Capillary Puller | Narishige | PE-2 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-10 | |
| Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) | WPI | AGT0525 | |
| Ag-AgCl reference | Phymep | E242 | |
| Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) | WPI | AGT1025 | |
| Artificial respiration system | Minerve | Alpha Lab | |
| Physiological parameters monitoring | Digicare | LifeWindow Lite | |
| Heating Blanket | Harvard Apparatus | 507215 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Scissors | FST | 15005-08 | |
| Forceps Dumont #5 | FST | 11295-10 | |
| Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-00 | |
| IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm | Instech | BTPU-027 | |
| Silicon elastomere | WPI | KWIK-CAST | |
| Dental drill | NSK | Y1001151 and P496 | |
| Surgical glue | 3M | vetbond |
References
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