Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Üç boyutlu Biyomimetik Teknoloji: Roman Biorubber Kollajen Hidrojeller içinde Mikro ve Makro ölçekli Mimarileri Tanımlı oluşturur

doi: 10.3791/53578 Published: February 12, 2016

Abstract

Doku iskeleleri doku rejenerasyonu sürecinde önemli bir rol oynamaktadır. İdeal iskele gibi olan uygun kompozisyon, hedeflenen modülü ve iyi tanımlanmış mimari özellikleri gibi çeşitli koşulları yerine getirmelidir. In vivo doku içsel mimarisi özetlemek Biyomalzemeler hastalıkları okuyan yanı sıra kayıp ve kusurlu yumuşak doku rejenerasyonu kolaylaştırmak için hayati önem taşımaktadır. Bir roman biofabrication tekniği araştırma ve klinik uygulama için biyomalzeme yeni bir nesil oluşturmak için sanat görüntüleme, üç boyutlu (3D) baskı ve seçici enzimatik aktivite durumunu birleştiren geliştirilmiştir. geliştirilmiş bir malzeme, Bovine Serum Albumin kauçuk spesifik geometrik özelliklerini koruyan bir kalıba enjekte reaksiyondur. Bu kurban malzeme doğal iskele malzemesi mimari özellikleri yeterli transferini sağlar. Prototip 4 ve 3 mm kanalları Repr ile 3 boyutlu bir kollajen iskele oluşmaktadırdallı mimari ESENT. Bu yazıda, doğal yapıları nesil bu biofabrication tekniğinin kullanımı vurgulamaktadır. Bu protokol, bir bilgisayar destekli yazılımı (CAD) iskele malzemesi içinde mimari özelliklerinde, lastik enzimatik sindirme ile ve ardından BSA kauçuk enjekte Reaksiyon olacak katı kalıp üretmek için kullanır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Doku mühendisliği alanında doku iskeleleri imal yeteneği hayati önem taşımaktadır. Uygun bir ince kağıt skafold 3B bir yapıya sahiptir, biyolojik olarak uyumlu malzemelerden oluşan ve in vivo doku mimarisi taklit eden doku ve hücre büyüme ve yeniden kolaylaştırmak için. Bu iskele besin taşınmasını ve atıkların 1-4 kaldırılmasını izin vermelidir. Bu iskelelerinin üretiminde ana engellerden biri biyouyumlu malzeme içine belirli geometrik özellikleri özetlemek yeteneğidir. Çeşitli biofabrication teknikler bu iskelelerinin geometrik özellikleri kontrol etmek için rapor edilmiştir, örnekler, solvent döküm 9, stereolitografi 10 5-8 elektrospinning vardır, ve diğerleri arasında, 11 3D baskı. Bu teknikler kontrol, iç ve dış mimari özellikleri nispeten kolay aktarım sağlayan kısa düşmek, pahalı, onların çözünürlük ve basılabilirlik (ile sınırlıdır vardır 12 üretmek için uzun bir zaman periyodu talep sonrası imalat teknikleri gerektirmektedir.

Pek çok ticari üretim sistemlerinde, iç boşluklar, kanal ve özelliklerin oluşturulması kum ya da başka uygun bir çıkartılabilir ya da gözden çıkarılabilir malzemeler kullanılarak elde edilir. Metal veya plastik kısım kum kalıp etrafında oluşturulur ve bu bir kez katılaştınldıktan sonra, kum kaldırılır. hemen hemen aynı şekilde, biyomalzeme nesil biosand eşdeğer ihtiyacı var. Bu nedenle, BSA kauçuk biosand için bir yedek olarak geliştirilmiştir. BSA kauçuk glutaraldehit ile çapraz bağlanmış sığır serum albümini içerir yeni formüle malzemedir. Nihai hedef biyobozunur kollajen iskele içine özgü mimari özellikleri yeniden etmektir. Orijinal doku kalıp boyutlu sadakat korur kurban biorubber özellikleri açıklanmıştır.

teknoloji, in vivo doku esnekliğini ve ilgi doku diğer özellikleri taklit etmek ayarlanmış olabilir yüksek sadakat, nispeten kolay ve zamanında konuda bir biyolojik olarak parçalanabilir malzemeye belirli bir geometrik öğretici sunmak için uygun bir teknik sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Kollajen Toplu İş Katıların yüzdesi belirleyin

  1. Önceden yayınlanmış bir prosedüre 13 sonrası kollajen ekstrakte edin. Kollajen, 20 ml, en az çözülme. oluşan hidrojellerin kollajen konsantrasyonunu işlemek amacıyla toplu kollajen katıların ilk yüzdesini belirleyin.
    1. Alüminyum folyo (yaklaşık 6 x 6cm ebadında), üç adet kesin ve 25 ml'lik bir cam kaba alt kullanarak bir tava her biri şekil. Her tavada ağırlığını kaydedin.
    2. Her bir tavaya kolajen bir miktar ilave edin ve bir alüminyum kaba ve kollajen toplam ağırlığı kaydedin. Her alüminyum tava kollajen 0.8 g - 0.5 ekleyin.
      Not: Bu işlemden sonra, orada üç alüminyum folyo tava ve her biri kollajen bir miktar olmalıdır. Her (toplam 3) boş alüminyum tava ağırlığı ve kollajen ilavesinden sonra tencerenin ağırlığını kaydetmek için emin olun.
    3. f kullanarak her tavada kollajen ağırlığı hesaplamakformülü ollowing:
      Kollajen ağırlığı = Pan ve kolajen ağırlık - Pan ağırlığı
    4. 24 saat boyunca 100 ° C'de bir fırında kolajen tutan üç alüminyum tava yerleştirin.
    5. 24 saat sonra, her bir alüminyum tavaya ağırlığını ve kurutulmuş kollajen kaydedin.
    6. Aşağıdaki denklem kullanılarak susuz kollajen ağırlığı hesaplanır:
      Susuz kollajen ağırlığı = Pan ve kurutulmuş kollajen ağırlığı - Pan ağırlık
    7. üç örnek aşağıdaki formül kullanılarak kollajen katı konsantrasyonunu belirlemek için katı yüzdesini hesaplayın:
      denklem 2
    8. Üç örneğin her biri için, kollajen katıların yüzdesi kullanarak toplu ortalama kollajen bir katı miktarı hesaplanır.
      Not: kullanılacaktır kollajen hidrate kollajenin sol budur. susuz kollajen hiçbiri kullanılacaktır.
    9. kollajen katı (i yüzdesini belirledikten sonratoplu nitial kollajen konsantrasyonu), geri kalan hidrate kollajen kullanmaya devam edin. 3 kolajen partisinin pH'ı ayarlamak için kalibre edilmiş bir pH metre kullanımı.
      1. az miktarda 12 N hidroklorik asit (HCl) içinde (her seferinde 2-5 ul) eklenir. her zaman buz üzerinde tutun. kollajen doğrudan hidroklorik asit ilave etmeyin - tüp tarafına asit ekleyin. asit ilave edildikten sonra, kolajen asit itmek ıspatula ve hızlı bir şekilde karıştırın.
    10. Bu 3 arasında bir pH değerine ulaştığında, kollajen, 4 ° C de O / N bekletin.

BSA Kauçuk 2. Hazırlık

  1. Aşağıda listelenen prosedür takip Sığır Serum Albumin (BSA) çözeltisi hazırlayın.
    1. 2x Fosfat Tamponlu Salin solüsyonu (PBS) hazırlayın. 0.02 M PBS çözeltisi yapmak için, 100 ml su için iki PBS tablet ekleyin.
    2. Aşağıda listelenen prosedürü kullanarak% 30 BSA çözüm oluşturmak için 2x PBS ile BSA birleştirin.
      1. Örneğin, 2x PBS ile 30 ml% 30 BSA hale BSA 12.9 g kullanımı. Bir karıştırma çubuğu olan bir şişeye 2x PBS (örneğin, 10 mL) 1/3 ekleyin. Şişeye BSA (örneğin, 6.45 g BSA) 1/2 eklenir ve bir ıspatula kullanılarak, kuru bir çözünmüş madde ıslak.
      2. tüm çözünen kadar PBS ve sonra BSA ekleyerek bu işlemi tekrarlayın ve çözücü şişede olduğunu. tüm çözünen ıslak spatula kullanın. Bazı sıvı ve topaklar bir karışımı gibi görünecek. yaklaşık 30 dakika boyunca bekletin.
      3. Sonra, bir düşük döngüsünde karıştırıcı açmak ve karıştırma çubuğu etrafında kümeleri olmadığından emin olun. Bu çözelti içinde her şeyi almak için 90 dakika sürer ya da 4 ° C 'de O / N karıştırıldıktan bırakılabilir. Çözünen Tüm eridikten sonra, 20 ml'lik bir şırınga içinde çözelti yerleştirin ve 0.20 um'lik bir şırınga filtresi ile kapatıldı. filtre içinden sıvı kovmak ve yeni bir tüp içinde steril solüsyon toplamak için pistonu basınız. 4 ° C'de saklayın.
    3. % 3 glutaraldehid soluti hazırlanmasısteril süzülmüş 2x PBS ile% 25 glutaraldehit solüsyonu seyreltilmesi ile ilgili. Örneğin,% 3 glutaraldehit çözeltisi 10 ml, 2% 25 glutaraldehid eklenir ve 2x PBS 8 ml kullanın. 4 ° C'de saklayın.

3. Kalıplar Tedavisi

Not: Bu yazıda anlatılan prototip bir özel yapılmış paslanmaz çelik Y kalıp parçasını kullanır. Kalıp bir giriş ve sırasıyla 4 ve 3 mm, iki çıkış kanallarını içerir. İlk olarak, temiz kalıpları, doymamış domuz yağı ile onları sprey, ve onları sterilize. Aşağıda tarif edilen prosedür takip kalıpları hazırlayın.

  1. 35 kHz frekansta sonikatör kullanarak temiz paslanmaz çelik kalıplar. sonikatörde kalıpları yerleştirin ve su ve buz ile daldırın. sonikatör çalışırken her zaman soğuk kalıpları tutun. 90 dakika 2 dönemler için sonikatör çalıştırın.
    1. Her dönemden sonra, Luer hiçbir malzeme paslanmaz çelik veya b kilit olduğundan emin olmak için bir iğne kullanınrass konektörü. kalıp iki tarafın tüm yüzeyini temizlemek için sabun ve su kullanın. kanallarda herhangi bir engel olduğunu doğrulayın.
  2. Bir otoklav torbasına kalıplar, vidalar ve Luer lock konnektörü yerleştirin ve otoklav.
  3. piyasada mevcut domuz yağı (karışık yağ asidi çözücü ajan) ile bir hava püskürtücü yarım verdiği şişeye doldurun. Düzenli kapak şişe kapağı değiştirin. Bir otoklav poşetine koyun ve otoklav.
    Not: domuz yağı, daha sonra enjekte Reaksiyon olacak bir materyal (BSA kauçuk) çıkartılmasını kolaylaştırmak için kullanılır. iç mühür zarar verebilir otoklav- püskürtücü şişe kapağı koymayın.
  4. 45 saniye ya da bir mikrodalga fırında berrak ve sıvı kadar domuz yağı ısıtın. domuz yağı şişesine hava püskürtücü kapağı vidalayın. püskürtücü ile kapağı bağlayın. laboratuvar tezgah hava kaynağına püskürtücü takın. Hava valfini açın ve yüzey ıslatma başlayana kadar püskürtücü meme açmakBir kağıt havlu.
  5. Yüzey tamamen kaplıdır kadar kalıp yüzeyine dik domuz yağı püskürtün. her parça püskürtülür edildikten sonra, bir Petri kabındaki koyun ve kapağını kapatın. 2 saat süreyle 4 ° C 'de kalıplar yerleştirin.
  6. 30 dakika boyunca UV ışığına sathının getirilmesi sureti ile kalıp sterilize edin. onlar tepki enjekte olmaya hazır olana kadar 4 ° C'de onları geri yerleştirin.

BSA Kauçuk 4. Reaksiyon Enjeksiyon

Not: Bir sonraki adımda BSA kauçuk erken ayarını önlemek için kullanmaya hazır olana kadar tüm malzemeler ve çözüm soğuk tutmak gerekir.

  1. aşağıdaki adımları kalıplara BSA kauçuk sunmak için vericiyi hazırlayın.
    1. Karıştırma tüm bileşenlerin sterilize: polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) başlığı içinde, 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılmasıyla (iki O halkalar, şırınga kapağı, çift şırınga ucu karıştırın ve 4 1 dağıtıcı).
      Not: Bir PCR kaput t çünkü kullanıldıBu prosedürün fiksatif içerir. Bu kimyasal maddeler nedeniyle hücrelerine maruz kalma ve toksisite riski hücre / doku kültürü kaputu kullanılamaz. UV ışığı içeren herhangi bir başka kaput uygun olacaktır.
    2. Çözelti tutucu ucu kapağını yerleştirin.
    3. BSA: 1 oranında bir 4: karıştırma ve enjeksiyonun gerçekleştirilmesi Glutaraldehit. çözümün en yüksek miktarda teslim edecek çift şırınga haznesine% 30 BSA ekleyin (Bu doldurmak için yaklaşık 4 ml alacaktır). Bitişik odasının taşan ve kirlenmesini önlemek amacıyla O ring yerleştirmek için yeterli boşluk bırakın emin olun.
    4. diğer odaya% 3 glutaraldehit solüsyonu ekleyin (bunu doldurmak için yaklaşık 1 ml alacaktır). Bitişik odasının taşan ve kirlenmeyi önlemek için O ring yerleştirmek için yeterli boşluk bırakın emin olun.
    5. dağıtıcının çift şırınga yerleştirin. Şırınga kap üstünde olacak şekilde dikey olarak derleme eğin. karıştırma ucu ile kapağı değiştirin.
    6. scBirlikte iki paslanmaz çelik kalıp parçaları rew.
    7. otoklav torbanın iç montaj yerleştirin.
    8. dağıtıcı herhangi bir havayı çıkarmak için, dik konumda tutun ve hızlı bir şekilde tutamacı gluteraldehit ile karışık BSA küçük bir miktar serbest bırakmak için bir kez sıkın. Sonra hızlı bir şekilde şırınga ucu paslanmaz çelik Y Kalıbın Luer kilit bağlantısını takın.
    9. sol el ve sağ tarafta BSA-Glutaraldehyde karışım dağıtıcı ile paslanmaz çelik Y kalıp tutun. Alternatif içindeki boşluklar çözeltisi ile doldurulur emin olmak için, bir otoklav torbanın kenarlarına egzoz basarak çıkış kanalları sol ve sağ egzoz her kaplama. Ardından, yatay kalıpları yerleştirmek ve tekrar enjekte.
    10. 25 mm Petri kabındaki dağıtıcı ve yerden kalıpları ayırın.
    11. kauçuk su kaybını önlemek için Petri kabı etrafında Parafilm yerleştirin.
    12. 4 ° C buzdolabı O / N kalıp yerleştirin.

Not: kolajen işlemi sırasında her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.

  1. Kollajen katıların yüzdesini kullanarak kollajen konsantrasyonu değiştirin.
    1. Soğuk su ile ilk kollajen konsantrasyonunu ayarlayarak% 1.75 kollajen 10 ml olun.
    2. kalibre edilmiş bir pH metre kullanılarak, 12 N hidroklorik asit kullanılarak pH'ı 3'e ayarlanır. kollajen doğrudan hidroklorik asit ilave etmeyin tüp tarafına asit ekleyin. asit ilave edildikten sonra, kolajen içine asit itmek için ıspatula ve hızlı bir şekilde karıştırın.
    3. Ayrı konik bir tüp içinde kollajen 4 g tartılır.
    4. 4 ° C ve 20-30 dakika boyunca 9,343 x g'de havayı çıkarmak için kollajen santrifüjleyin.
    5. 30 dakika boyunca hücre kültürü kapağı sterilize ve 4 ml kolajen laminin 14 ul, UV. Bu 10 ug / ml bir son konsantrasyonda laminin ile sonuçlanacaktır. Not: Laminin s sağlartructural bütünlüğü, yapışma, çeşitli hücresel tepkileri teşvik etmektedir.
    6. önce sterilizasyon için kaputu kullanarak PCR UV 20-30 dakika süreyle üzerinde ışık açın.
    7. 2 saat boyunca, etanol içinde bir 20 ml şırınga eklemek için, Luer kilit kapağı yerleştirin. Sonra kurumaya ve UV ışık yerleştirmek için izin verir.
    8. Gama 1200 cGy ulaşmak için 8.6 dakika boyunca kollajen ışın tedavisi.
      Not: Zaman Sezyum kaynağının çürüme bağlıdır. Aynı doz ulaşmak için saati ayarlayın.

BSA Kauçuk üzerinde Kolajen 6.Casting

  1. 1: 1 oranında, (kollajen: HEPES: MEM) kollajen polimerize etmek için, bir 8 kullanın. Aşağıdaki prosedür, (Kademe 5.1.8 arasında) ile asitleştirildi kollajen ilk 4 g dayanır.
    1. su içinde 0.2 N HEPES çözeltisi yapmak ve 1-5 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi, az miktarda (1-5 ul) eklenmesi ile pH 9'a ayarlanır. kalibre edilmiş bir pH metre kullanılarak, her eklemeden sonra, solüsyonun pH değerinin izlenmesi. 4 ° C veya ke saklayınbuz üzerinde ep.
    2. Kaputu sterilize etmek için 20-30 dakika süreyle doku kültürü kaputu UV ışığı açın.
    3. Otoklav forseps, spatula, ve sterilizasyon için neşter.
    4. Doku kültürü kapağı kullanarak, 0.2 N HEPES (pH 9) ve mi 10x MEM 1.5 1.5 mi karıştırın. Kullanmadan önce 5 saniye boyunca buz ve vorteks onu tutmak için emin olun. 4 ° C'de saklayın veya buz üzerinde tutmak.
    5. PCR kaput sterilize etmek için, 30 dakika boyunca UV ışığı açın.
    6. 10 dakika boyunca -20 ° C'de bir 12 kuyulu plaka ve bir 20 ml şırınga yerleştirin veya hazır olana kadar devam etmektedir. Not: Kullanıma hazır olana kadar soğuk tüm malzemelerini saklayın. Sıcaklık artışı, erken kollajen fibrillogenesis indükler.
    7. % 70 etanol ile kaputun olması ve sterilizasyon için kurumaya bırakın olacak tüm tüpler ve iyi plakaları püskürtün. daha sonra kullanmak için soğumaya buz üzerinde 20 ml şırınga yerleştirin.
    8. PCR kaputu, BSA kauçuk ve bir neşter kullanılarak serbest bırakmak için paslanmaz çelik kalıpları açmak BSA r egzoz kanalları kesmekubber kalıp.
    9. PCR Kaputun altında, HEPES-MEM çözeltinin 1 ml steril kollajen tüplerini açıp ekleyin (emin olun iyi karışık ve hiçbir katı mevduat olduğunu, HEPES-MEM çözüm ayıklanması önce).
    10. Steril spatula kullanarak, iyice kollajen ve tampon çözelti karıştırın.
    11. Kapatın ve girdap hızla bir iyi karıştırılmış hidrojel sağlamak.
    12. Soğuk 20 ml şırınga aktarın.
    13. Tek bir el ile, kuyunun içindeki BSA Kauçuk tutun ve diğer kullanılarak kuyunun dibine kolajen hidrojel çözeltinin yansı dağıtın.
    14. Steril cımbız kullanarak, kauçuk giriş ve çıkış uçları iyi yanlarını dokunmadan emin olun.
    15. tamamen kaplıdır kadar kauçuğun üstünde kolajen çözeltisi dökülür.
    16. BSA kauçuk kollajen içinde askıya alındığını ve özellikle lastik uçlarına yakın hiçbir kabarcıklar, bulunmadığından emin olun.
    17. Kapağı yerleştirin ve etrafına sarın ParafilmKuyunun çevresi.
    18. 37 ° C'de 1 saat boyunca kuluçkaya konulmuştur. PCR UV ışığı tutun.
  2. kollajen Polimerizasyondan sonra UV aşağıdaki yöntemle hidrojel çapraz bağlanırlar.
    Not: kollajen, çapraz bağlama enerjisi miktarı kontrol edilebildiği bir UV çapraz bağlayıcı cihazı kullanılarak yapılır.
    1. UV çapraz bağlayıcı açın ve 630.000 μJ / cm 2 ile boş odasını saçmak için enerji ayarını kullanın.
    2. inkübatör jeller çıkarın.
    3. etanol ile ellerini Sprey ve, odasının içine mümkün olduğunca çabuk kapağı çıkarın.
    4. Odasına kapatın ve UV enerji ayarını seçerek ve 630.000 μJ / cm 2 ışınlanması ile hidrojeller çapraz.
    5. Çapraz bağlama döngüsünden sonra, PCR örtünün üzerinde UV ışığı kapatmak
    6. etanol ile ellerini Sprey ve hızlı bir şekilde plaka üzerine geri kapağını yerleştirerek, odasını açın. plaka taşıPCR kaput.
    7. yavaşça gevşetin ve kuyudan jel kaldırmak, steril spatula ile. hidrojel alt çapraz bağlanması için kaputun altında jeller çevirin. Adımı tekrarlayın 6.2.3 ve 6.2.4.

BSA Kauçuk 7. Enzim Sindirim

  1. içi boş bir kollajen iskele sahip olmak için, hidrojel gömülü boyutları etkilemeyen bir şekilde BSA Kauçuk çıkarın. Prosedür aşağıda tarif edilmektedir.
    1. doku kültürü kaput sterilize etmek için 20-30 dakika süreyle UV ışığı açın.
    2. % 0.25 tripsin solüsyonu pH 7.8 sağlayın. Örneğin, 15 ml su, bir 50 ml konik bir tüp içinde tripsin 0,0376 g ekleyin. 1 M NaCl, az miktarda (2-5 ul) eklenmesi ile 7.8'e pH ayarlayın. 20 ml'lik bir şırınga içinde çözelti yerleştirin ve 0.20 um'lik bir şırınga filtresi ile kapatıldı. filtre içinden sıvı kovmak ve yeni bir tüp içinde steril bir çözüm toplamak için pistonu basınız.
    3. su banyosu açın ve 30 sıcaklığını ayarlamak° C.
    4. 30 dakika sonra, UV ışığı kapatın. kaputu kullanılacak olan tüm boru ve malzemeler üzerinde etanol püskürtün.
    5. Ayrı konik tüp başlık ve yer altında kollajen hidrojel aktarın.
    6. Her tüpe 7.8 bir pH ile,% 0.25 tripsin solüsyonu (jeller kaplamak için yeterli miktarda) 3-5 ml ekleyin.
    7. Yaklaşık 1 dakika boyunca hafifçe Parafilm ve vorteks tüpleri Seal.
    8. 15-24 saat boyunca 30 ° C su banyosunda yerleştirin. BSA kauçuk dijeste veya hidrojel kaldırıldı kadar su banyosu içinde iken, hafifçe sık jeller girdap.
      Not: Amacıyla BSA kauçuk kaldırıldı olup olmadığını belirlemek için, ya kauçuk tripsin solüsyonu içinde yüzen ya da dökümünü parçaları vardır. hidrojel içinde hiçbir görsel karanlık alanlar olmalıdır.
  2. aşağıda açıklandığı gibi tüm BSA kauçuk ve tripsin hidrojeller kaldırıldı emin olmak için, durulayın.
    1. PCR hoo açın20-30 dakika d UV ışığı.
    2. Mosconas çözüm hazırlayın. Su içerisinde potasyum klorid (KCl, 28.6 mM), (NaHCO3, 11.9 mM), glikoz (9.4 mM) ve (NaH 2 PO 4, 0.08 mM) bir araya getirin. 1 M NaOH ve 12 M HCI çözeltisi ile 7.4'e pH ayarlayın. 20 ml'lik bir şırınga içinde çözelti yerleştirin ve çözelti sterilize etmek için 0.20 um bir şırınga filtre kullanın.
    3. örtünün üzerinde yerleştirerek önceden etanol ile sprey her şey ve etanol kurumasını bekleyin.
    4. tüp açın ve yeni bir 50 ml konik tüp, steril Mosconas çözeltisi 5-10 ml aktarın.
    5. enzim çözeltisi içeren konik tüp kollajen hidrojel aktarın. hidrojel tamamen çözümü ile kaplı olduğundan emin olun. 30 dakika boyunca 4 ° C'de buzdolabında çalkalayıcı tüpü boş.
    6. Mosconas çözümü ve iki kez adımı yineleyin 7.2.5 aspire.
    7. 4 ° C'de saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sonuçlar, bu biofabrication tekniği in vivo doku görülen uzamsal taklit 3D iskeleleri üreten etkili olduğunu göstermektedir. Mimari özellikleri doku in vivo hücre etkileşim ve işlevsellik açısından önemli bir rol oynayan doku mühendisliği uygulamaları için hayati parametreler vardır.

BSA kauçuk tutarlılık ve mixability homojen ve hedeflenen şeklini korumak için güçlü bir BSA lastik üretiminde önemli bir parametredir. protein çözünürlüğü, protein-protein etkileşimi, ve genel olarak, protein davranışına değişikliğe sebep çözücü ile etkileşim arası etkileri ile tespit edilir. BSA çözeltisi iletkenliği çözeltilerinin tuz konsantrasyonunun bir göstergesi olan ölçülmüştür. Tablo 1 combinatiBSA ons, solvent ve glutaraldehit test edilmiştir. Beklendiği gibi, yüksek iletkenliğe sahip numuneler (2x PBS çözücü) BSA çözünürlüğünü kolaylaştırmıştır.

Bu kurban materyalin geliştirilmesi için uygun durumunu belirlemek için kullanılan bir diğer parametre reaksiyon oranı oldu. beklendiği gibi BSA tepkime süresi, artan glutaraldehid konsantrasyonu azaldı. sabitleyici amino asit α-amino grupları, peptidlerin N-terminali amino grubuna ve sisteinin sülfhidril grubu ile reaksiyona girer. Glutaraldehit arası kovalent bağlar (Şekil 1A) 14 oluşturulması için lizin amino grupları ile BSA ile ağırlıklı olarak reaksiyona girer. Inkübasyondan sonra, numuneler, artan glutaraldehit konsantrasyonu (Şekil 1B).% 20,% 30, bir ile yoğunluğu artan, koyu sarı kahverengi açık sarı bir renk değişimi gösterilmemiştirsu içinde% 2 glutaraldehid ile D 40% BSA kauçuk oluşturmamıştır. % 40 BSA çözeltisi nedeniyle, yüksek viskozite ve yüksek ölçüde reaktif FIXATIV kauçuk boyunca gücü değişen sonuçlandı. Bu davranış, homojen protein zincirlerini penetran glutaraldehit zorluk neden olabilir. Çözücü ölçüde proteinin çözünürlüğünü hem de sabitleyici ile reaksiyonunu etkilemiştir. 2x PBS çözümleri kolayca karıştırılabilir idi. su ile BSA çözeltisi karışımı zordu. BSA çözünürlüğü büyük ölçüde protein yapısal değişimlere neden çözücü (Tablo 2) iletkenliği etkilenir. En umut verici numuneleri 1x PBS ve 2 x PBS içinde% 3 glutaraldehid ile% 30 BSA idi.

Lastik sürekli yükleme kuvvetlerine başardı emin olmak için, bir sıkıştırma testi uygulandı. BSA kauçuk dört numune mekanik özellikleri ölçüldü:% 30 BSA% 3 gluteraldehit2x PBS, 1 x PBS, 1 x PBS içinde 2 x PBS içinde% 20 BSA% 3 glutaraldehit ve% 20 BSA,% 2 gluteraldehit içinde% 30 BSA% 3 glutaraldehid. Sinüs dalgaları gerilme ve şekil değiştirme eğrileri (Ek Şekil 3) aktarılır yük ve deplasman eğrileri (Ek Şekil 2) arasında çok küçük bir faz değişim göstermiştir. Gerilme ve şekil değiştirme eğrileri dayanarak, ilk üç numune yükleme ve boşaltma (Şekil 2A-2C) arasında histerezisi gösterdi. Bu üç örnekleri kuvvetler uygulandığı zaman, elastik ve viskoz özelliklerini içeren bir viskoelastik malzemesi olarak davrandım. % 20 BSA,% 2 glutaraldehid, kalıcı deformasyona (şekil 2D) belirtileri gösterdi. 1x PBS ve 2x PBS içinde% 30 BSA% 3 glutaraldehit benzer bir davranış (Şekil 2E-on yükleme ve boşaltma çevrimi) gösterdi. Elastik modül, bu dört numune (Şekil 2F) doğrusal bölümü belirlenmiştir. fosfatın konsantrasyonuçözücü önemli ölçüde Test edilen aralık (p = 0.03) de bir esneklik modülüne artmıştır. 1x PBS içinde% 20 BSA,% 2 glutaraldehid daha düşük bir elastikiyet modülüne gösteren kolayca deforme.

Belirli bir zaman noktasında enzim ile temas haline geçtiğinde kauçuk enzimatik sindirimi değerlendirmek için, reaksiyon hızı hesaplandı BSA kauçuk kayboluşu dayanıyordu. enzimatik sindirimi işlem bir parti reaktörü olarak muamele edilmiştir. Tedavisi ve sindirim kinetiğinin bilinmesi için yapıldı liyofilize edildikten sonra kalan kauçuk önce başlangıç ​​kauçuk konsantrasyonu arasında bir karşılaştırması. Şekil 3, glutaraldehit ve BSA, çözücünün konsantrasyonu ile ilgili olarak, her bir numune için reaksiyon oranını gösterir ve bekleme süresi. Net bir eğilim çapraz bağlayıcı konsantrasyonları ve işletmenin ayrışma reaksiyon oranı arasında gözlendi. İstatistiksel analiz, her bir zaman noktasında yapılmıştır. thE 15 saatlik bir zaman noktasında, glutaraldehit konsantrasyonu önemli ölçüde 0.02 p değeri (Ek Tablo 4) elde edilen reaksiyon üzerinde etkili olmuştur. O zaman noktadan sonra, glutaraldehit ve BSA konsantrasyonu hem önemli ölçüde oranı (Ek Tablo 5-7) etkiledi. en etkili faktör genel daha önemli bir p değeri tarafından belirtilen glutaraldehit konsantrasyonu oldu. glutaraldehit konsantrasyonu artışı kauçuk varlığın sindirim reaksiyon oranı azalmıştır.

Tripsin ile çözünmüş protein miktarı BCA tahlili (Şekil 4) kullanılarak tespit edilmiştir. Yaygın bir eğilim gözlendi: fiksatif alt konsantrasyonu, daha fazla protein BSA kauçuk sindirildi. Tripsin böylece üzerinde genel yapısını eriterek, BSA ve glutaraldehit tarafından oluşturulan yeni oluşturulan kovalent bağlarını keserek lastik örneği ile etkileşimzaman. 1x PBS ile 2x PBS ile karşılaştırıldığında daha erken bir zaman noktasında daha çözünmüş protein olduğu görülmektedir. Zaman içinde, 48 saat kadar artmaya devam eden ve daha sonra bu düşüş 15 saat sonra çözelti içinde protein bir artış vardır. Bu tripsin sürekli olarak daha küçük peptitler ve amino asitler oluşturma ve böylece proteinlerin parçalanması ve bağlı olabilir. Aynı zamanda, sadece üç veya daha fazla amino asitten oluşan peptitleri oku tahlilde sınırlamaları, atfedilebilir. İstatistiksel analiz BSA ve glutaraldehit konsantrasyonu önemli ölçüde BSA kauçuk (p <0.05) proteinin salınmasını etkilediğini gösterdi. glutaraldehid bir artış çözündürüldü protein bir azalmaya neden olmuştur BSA konsantrasyonundaki bir artış, üstte yüzen madde içindeki proteininin bir artışa neden olmuştur.

Bu kurban materyalin ayrışma ölçmek için, kauçuk conta yerleştirmeden önce (ıslak zemin) tartıldıtripsin ile ct. Enzimi sindirimi çözeltiye yerleştirilmiş lastik kuru ağırlığına eşdeğer enzim solüsyonu BSA kauçuk ile tepkimeye sokulur ve bu şekilde, proteinin çözünür Ek, Şekil 1'de gösterilen değerler kullanılarak belirlenmiştir. Muameleden sonra geri kalmış lastik O / N liyofilize edildi ve tartılmıştır. Şekil 5, çözücü, kauçuğun ayrışma etkilediği gösterir. BSA ve glutaraldehid aynı konsantrasyonda, 2x PBS çözücü kauçuklar 1x PBS karşılaştırıldığında malzemenin daha korudu.

Üç katı kalıp parçaları imal edilmiştir: Döngü Kalıp (Ek Şekil 4A), Stabilite Piece (Ek Şekil 4B), ve Y Kalıp (Şekil 6A, sol). Paslanmaz çelik Y kalıp parçası (sağ, Şekil 6A) Microlution makinesi kullanılarak oluşturuldu. Bu kalıp, reaksiyon% 30 BSA ve% 3 glutaralde enjekte edildi2x PBS (sol Şekil 6B, vb) Hyde. Kauçuk, 4 ° C 'de O / N reaksiyona girmesine izin verildi. Lastik kolajen (Şekil 6B, ortada) ile döküm ve daha sonra enzim (sağ, Şekil 6B) sindirildi. Ön veriler, pH 7.8 ve 15 saat boyunca 30 ° C'lik bir sıcaklıkta BSA kauçuk kollajen platform üzerinde minimum etkisi olan sindirilebilir olduğunu göstermiştir. 15 saat sonra, kauçuk enzim ve kolajenin geometrik özelliklerini etkilemeden kanal bırakmaktadır yeterince gevşek tarafından zayıflar. 3D kollajen iskele özgü geometrik özelliklere sahip olduğu oluşturuldu. Şekil 6B (sağda) BSA kauçuk enzim sindirimi sonra kollajen hidrojel içinde 4 mm çaplı kanalını gösterir. bir kanalı orijinal boyuta muhafaza emin olmak için bir çap pergeli ile ölçüldü. Nitekim, kollajen hidrojel yeni kanal 4 mm idi. BSA lastik kalıpları bizi test edildiği, 300 mikron kadar küçük boyutlara tutabiliristikrar kalıp ing (Şekil 7). Bu iskeleleri kalan glutaraldehit için test edildi ve biz Mosconas yıkamadan sonra hiçbir kalıntı bulundu.

Şekil 1
Şekil 1. BSA lastik. (A) BSA lastik reaksiyonu. glutaraldehit kovalent bağlar oluşturarak BSA çapraz bağlar. (B) BSA Lastik. Farklı BSA konsantrasyonları, glutaraldehit konsantrasyonları ve solvent türü 24-iyi plakalar üzerinde döküm ve 4 ° C'de O / N reaksiyona sokuldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
BSA kauçuk Şekil 2. Gerilme-Şekil Değiştirme eğrileri. BSA ru Gerilme-Şekil eğrileri bbers. (A), 2x PBS içinde% 30 BSA% 3 glutaraldehid; (B) 1 x PBS içinde% 30 BSA% 3 glutaraldehid; (C) 2x PBS içinde% 20 BSA% 3 glutaraldehid; 1 x PBS içinde ve (D)% 20 BSA,% 2 glutaraldehid (3 defa). eğrileri bazı histeresis var, ama onların orijinal şekline geri dönmek AC gösterisi kauçuklar. Örnek D kolay yükleme ve boşaltma işlemleri sırasında sürekli olarak deforme çok düşük bir esneme modülü ile bir lastik gösterilmiştir. Grafik E (her numunenin bir devir temsilcisi) tek bir yükleme ve boşaltma döngüsünün görüldüğü gibi Örnek A ve B çok benzer bir davranış göstermiştir. elastikiyet sabitleştirici konsantrasyonu ve kullanılan çözücü (F) etkilenmiştir. Numuneler tuzlarının bir artış (** p <0.05) ile birlikle modulus bakımından önemli bir artış göstermiştir. Daha yüksek bir tespit edici konsantrasyonu BSA kauçukların elastikiyet önemli bir artış gösterir (* p <0.05) neden oldu.arget = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
BSA kauçuk dağılması Şekil 3. Reaksiyon hızı. Sabitleyici arttıkça, reaksiyon hızı 1 x PBS (A), 2x PBS (B), ve su (C) 'de, tüm numuneler için azalır. 2x PBS içinde% 40 BSA% 2 glutaraldehit reaksiyon en yüksek oranlardan biri göstermektedir. Bu BSA proteini homojen hale karşılaşılan zorluk kaynaklanmaktadır. (mavi:% 20 BSA, mor:% 30 BSA ve kırmızı:% 40 BSA). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Protein quantifi Enzim sindiriminden sonra katyonudur. sabitleyici arttıkça, kauçuklar çözülmüş protein, 1x PBS (A), 2x PBS (B), ve su (C) 'de, tüm numuneler için azalır. (mavi:% 20 BSA, mor:% 30 BSA ve kırmızı:% 40 BSA). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. Lastik sindirim. Biz kuru baz ürünleri başlangıç ​​karşılaştırarak ve son tarafından sindirilmiş lastik miktarı belirlendi. Biz% 6 glutaraldehit örnek üzerinde sindirim az miktarda elde 1x PBS içinde en fazla% 30 BSA% 2 glutaraldehit. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ove_content "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> Şekil 6,
Şekil 6. Dallı prototip. Şube damarsal (A) Temsil. Solda gösterilen G Kanunu dönüştürülür ve sağda görüldüğü gibi Microlution 363-S kullanılarak imal edildiği Mastercam oluşturulan sağlam. Paslanmaz çelik kalıp parçası iki 3mm çıkış kanallarını 4 mm girişi kanalı temsil eder. (B) 3D kollajen iskele. Yukarıda gösterilen kalıp kullanılarak yapılan BSA lastik solda gösterilen. merkez kollajen hidrojel gömülü kauçuk gösterir. Kauçuk enzimi sindirilmiş sonra kolajen iskele içinde sol kanallar sağda gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
Şekil 7. BSA kanalı. A 300 mikron BSA kanalı istikrar parça kalıptan çıkarıldı. kanal çevresinde kalıp çözücü maddenin ince bir tabaka vardır. Ek alan açık bir mikroskop altında ayırt edilir ve kolayca çıkarılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

BSA (%) Glutaldehyde (%)
20 2
20 3
20 6
30 2
30 3
30 6
40 2
40 3
6

. Üç farklı solventler kullanılarak: 1 oranında Tablo 1. BSA lastik parametreleri BSA ve fiksatif 4 de karıştırılmıştır.

Örnek İletkenliği (mS / cm) pH
BSA (%) çözücü
30 2x PBS 11.43 7.06
30 1X PBS 6.35 7.05
30 DI 2.39 6.76
20 2x PBS 13.00 6.92
20 1X PBS 8.67 7.09
20 DI 2.08

Tablo 2. İletkenlik ve BSA örneklerinin pH. BSA çözeltilerinin iletkenlikleri ve pH farklı çözücülerin mevcudiyetinde ölçülmüştür. iletkenlikteki artışı 2X ve 1 x PBS ile gösterilir.

6
BSA (%) Glutaraldehit (%) çözücü gözlemler
20 2 1X PBS Yumuşak, kolay deforme olabilen malzeme
20 3 1X PBS Yumuşak ama% 2 glutaraldehit daha sağlam
20 6 1X PBS Sert, biraz kırılgan
30 2 1X PBS iyi tutarlılık
30 3 1X PBS iyi tutarlılık
30 6 1X PBS Kırılgan
40 2 1X PBS Bir jel / kauçuk tutarlılığını oluşturmada çok tutarsız
40 3 1X PBS tutarlılık numune boyunca değişir
40 6 1x PBS Kırılgan
20 2 2x PBS Yumuşak, kolay deforme edilebilir malzeme, ancak 1X PBS örnek daha sağlam
20 3 2x PBS Yumuşak ama% 2 daha sert
20 6 2x PBS iyi tutarlılık
30 2 2x PBS Kıvam, 1 x PBS ile daha studry
30 3 2x PBS Kıvam, 1 x PBS ile daha studry
30 2x PBS İyi mixability ama britle
40 2 2x PBS tutarlılık numune boyunca değişir
40 3 2x PBS tutarlılık numune boyunca değişir
40 6 2x PBS tutarlılık numune boyunca değişir ve kırılgan oldu
20 2 Su Bir jel / kauçuk malzeme teşkil etmedi
20 3 Su bir jel oluşturduğu ancak t daha sert görünüyorO, tutarsız PBS ve 2x PBS 1x
20 6 Su bir jel oluşturduğu ancak 1x PBS ve 2x PBS daha sert, tutarsız görünüyor
30 2 Su Bir jel / kauçuk malzeme teşkil etmedi
30 3 Su bir jel oluşturduğu ancak 1x PBS ve 2x PBS daha sert, tutarsız görünüyor
30 6 Su bir jel oluşturduğu ancak 1x PBS ve 2x PBS daha sert, tutarsız görünüyor
40 2 Su Bir jel / kauçuk Materi teşkil etmedial
40 3 Su tutarlılık numune boyunca değişir - üstünde sert
40 6 Su tutarlılık numune boyunca değişir - üstünde sert

BSA kauçuk O tepki gösterdi sonra Tablo 3. BSA lastik. / N, numunenin 8 mm biyopsi yumruk delik alındı. Bu tablo tutarlılık ve örneklerin ortaya çıkması bazı görsel gözlemler içeriyor.

Yan Şekil 1
Ek Şekil 1. Katı yüzdesi. Her lastik katıların yüzdesi (kuru ağırlık / yaş ağırlık) tespit edilmiştir. Solvent Percenta etkilemedikatıların ge (p> 0.05). Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Şekil 2
Ek Şekil PBS 2x% 30 BSA% 3 glutaraldehit 2. Sinüs dalgası. Numunenin basınç yükü ve deplasman geçen zaman fonksiyonları olarak gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Şekil 3
Ek Şekil PBS 2x% 30 BSA% 3 glutaraldehit 3. Sinüs dalgası. Gerilme ve numunenin streyn hesaplanır ve geçen zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Küçük bir faz kayması, indi vardırkauçuk viskoelastik davranış cative. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Şekil 4
Ek Şekil 4. Mastercam katılar. (A) Döngü ve (B) kararlılık adettir. Bu kullanarak Mastercam tasarladıktan sonra, G kodu ithal edildi ve Microlution makine veya MakerBot 3D Replicator kullanarak bir PLA parçası kullanarak bir paslanmaz çelik veya pirinç parçası. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Sınırları min maksimum
-17 3
Deplasman (mm) -1.5 0.3
Dalga Seviye 1 Seviye 2 Frekans (Hz) devir
Sinüs -15 -3 1 5000
Veri toplama
tarama süresi 1.008
tarama noktaları 360
Taramalar Sayısı </ Td> 5
müteakip Tarama tarama arasında 1.008 sn

Ek Tablo 1. Sıkıştırma test parametreleri. Bir sinüs dalgası kullanarak, yük ve deplasman arasındaki ilişki kauçuk dört türleri için tespit edilmiştir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

ANOVA Sonuçları
df SS MS F F anlamı
gerileme 3 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
artık 20 1.40E + 01 6.99E-01
Toplam 23 9.99E + 02
Regresyon analizi
katsayılar Standart hata t Stat P-değeri
durdurmak 1.74E + 00 8.23E-01 2.12E + 00 4.70E-02
BSA (%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
Glutaraldehit (%) 3.17E-01 </ Td> 1.03E-01 3.09E + 00 5.71E-03
çözücü 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

Ek Tablo BSA kauçuk katı yüzdesi 2. istatistiksel analizi. BSA ve glutaraldehit önemli ölçüde katı yüzdesini etkilemiştir. Çözücü katıların yüzdesi etkilemedi. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

ANOVA Sonuçları
df SS MS F F anlamı
gerileme 3 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
artık 7 6.07E + 04 8.67E + 03
Toplam 10 3.67E + 05
Regresyon analizi
katsayılar Standart hata t Stat P-değeri
durdurmak 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1.23E-06
BSA (%) 4.67E + 00 3.80E + 01 1.23E-01 9.06E-01
çözücü 1.02E + 02 3.80E + 01 2.67E + 00 3.20E-02
Glutaraldehit (%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

Ek Tablo PBS konsantrasyonuna bağlı elastik modülü 3. istatistiksel analizi. PBS konsantrasyonu önemli ölçüde elastik modül etkiledi. Çözücü tuzların artış elastik modülü artışa neden olmuştur. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

ANOVA Sonucu
df SS MS F F anlamı
gerileme 3 6.15E-15 2.05E-15 3.68E + 00 1.67E-02
artık 60 3.34E-14 5.57E-16
Toplam 63 3.96E-14
Regresyon analizi
katsayılar Standart hata t Stat P-değeri
durdurmak 3.74E-08 1.37e-08 2.74E + 00 8.03E-03
BSA (%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
Glutaraldehit (%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E + 00 2.02E-03
çözücü -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

Ek Tablo enzim sindirimi 15 saat. Glutaraldehit konsantrasyonu önemli ölçüde daha yüksek glutaraldehit konsantrasyonlarda azaltarak kauçuk sindirim reaksiyon hızına etkisi sonra reaksiyon hızı 4. istatistiksel analizi. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

d> P-değeri
ANOVA Sonuçları
df SS MS F F anlamı
gerileme 3 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
artık 62 4.20E-15 6.78E-17
Toplam 65 1.16E-14
Regresyon analizi
katsayılar Standart hata t Stat
durdurmak 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
BSA (%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
Glutaraldehit (%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E + 00 3.00E-14
çözücü -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

Ek Tablo enzim sindirimi 24 saat sonra reaksiyon hızı 5. İstatistiksel analiz. BSA ve glutaraldehit konsantrasyonu önemli ölçüde lastik sindirim reaksiyon hızına etkisi. yüksek glutaraldehit konsantrasyonlarda, t bir azalma vardırO reaksiyon hızı. Yüksek BSA konsantrasyonlarda reaksiyon oranında bir artış söz konusudur. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

ANOVA Sonuçları
df SS MS F F anlamı
gerileme 3 3.10E-15 1.03E-15 2.74E + 01 1.64E-11
artık 64 2.42E-15 3.78E-17
Toplam 67 5.52E-15
Regresyon analizi
katsayılar Standart hata t Stat P-değeri
durdurmak 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
BSA (%) 2.13E-10 9.20E-11 2.31E + 00 2.39E-02
Glutaraldehit (%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E + 00 1.90E-12
çözücü 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

Ek TabloEnzim sindirimi 48 saat sonra reaksiyon hızı. BSA ve glutaraldehit konsantrasyonu 6. İstatistiksel analiz anlamlı kauçuk sindirim reaksiyon hızına etkisi. Yüksek glutaraldehit konsantrasyonlarda, reaksiyon hızı azalma var. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

ANOVA Sonuçları
df SS MS F F anlamı
gerileme 3 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
artık 61 1.46E-15 2.39E-17
Toplam 64 3.64E-15
Regresyon analizi
katsayılar Standart hata t Stat P-değeri
durdurmak 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
BSA (%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
Glutaraldehit (%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E + 00 1.21E-11
bu yüzdenlvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

Ek Tablo enzim sindirimi 72 saat sonra reaksiyon hızı 7. İstatistiksel analiz. BSA ve glutaraldehit konsantrasyonu önemli ölçüde lastik sindirim reaksiyon hızına etkisi. yüksek glutaraldehit konsantrasyonlarda, reaksiyon hızı azalma var. Yüksek BSA konsantrasyonlarda reaksiyon oranında bir artış söz konusudur. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biofabrication biyoloji ve mühendislik prensipleri yerli doku taklit karmaşık materyalleri üretmek için birleştirme hangi bir derece disiplinli bir alandır. Bunu başarmak için, in vivo doku elde edilen bilgileri kullanarak ve bir in vitro iskele çevirmek teknikleri geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Bu şekilde, platform yakın in vivo doku, mimari, işlevsel ve mekanik özelliklere benzer olduğu tasarlanabilir. Optimal iskele malzemesi, biyo-uyumlu olarak, belirli özelliklere sahiptirler ilgi konusu doku mekanik özelliklerini taklit, kontrollü bozunma edebilen hücre canlılığını desteklemek için güçlü ve 2,3 remodeling doku sağlayan yeteneğine sahip olmalıdır.

imalat teknikleri çok sayıda canlı, üç boyutlu yapıları oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu teknolojiler iki ana kategoriye ayrılır: geleneksel And ilerledi. geleneksel teknikler, gözenekli yapılarının yapılması için sentetik ve doğal geleneksel malzemelerin kullanımını içerir. Bazı örnekler, solvent dökümdür dondurarak kurutma ve döküm eritebilir. Bu tekniklerin dezavantajları iskelelerinin içinde iç kanalları yapma zayıf yapısı içinde gözeneklilik kontrolünü (gözenek boyutu ve gözenek birleştiricisi) ve güçlüğü sayılabilir. Gelişmiş teknikler diğerleri 1 arasında stereolitografi, döküm, 3D baskı, ve elektrospinning içerir. Bu teknikler, uzun menzilli mikro mimari kanallarının olmaması, küçük çaplı ucu, malzemeye bağlı olarak en verimli dağıtabilen olurken, toksik olabilir detaylı sonrası işlem gerektiren optimum mekanik mukavemet temin etmek üzere malzeme seçimi olarak dezavantajlara sahiptir ve bir in vitro yapı iç mimarileri tasarımında kısıtlama. 3D baskı bakımından çok önemli bir dezavantajı yeterli hücre taşıyıcısı olan biyomalzeme mevcut olmasıdırAyrıca belirli bir mimari düzenlenmesi 12 sağlamak için gerekli mekanik özelliklere sahip iken. Burada sunulan teknoloji, hem geleneksel ve ileri üretim teknikleri içermektedir. iki dünyanın en iyi bilgisayar destekli oluşturmak için imalat veya ithalat, bir enzim kararsız lastik gelişimi ile istenilen mimari yakınsama elde edilir. Paslanmaz çelik kalıplar bir öğütme makinası kullanılarak hazırlandı, ama bunların imalat bu teknik sınırlı değildir. 3D Printer (örneğin, MakerBot) kullanarak, aynı kalıplar polilaktik asit (PLA) imal edilmiştir. Negatif kalıplar herhangi bir materyal için özellikleri kolay ve güvenilir bir transferi oluşturmak katı kalıplar sağlayan CAD programı tarafından tasarlanan mimari direktifleri kullanılarak öğütülür. Bu sadece dış doku bileşimin kontrol sağlar ki bu teknoloji, ancak aynı zamanda son derece karmaşık iç mimari, önemlidir. iş burada sunulanÖncelikle homojen kolayca zaman makul miktarda sindirilir karıştırılabilir BSA kauçuk karakterizasyonu yöneliktir yapısında değişikliklere dirençli ve döküm işlemi sırasında stabilitesini tutarken, dakika özelliklerini taklit edebilir . Bu tekniğin sınırlama test edildi ve kurban malzemenin çözünürlüğü çapı 300 mikron kadar küçük boyutlara koruyabilirsiniz. Bununla birlikte, Şekil 7, bir kanal kalıp çözücü maddenin ince bir tabaka ile çevrilidir göstermektedir. Bir mikroskop kullanarak, bu ek alan açık ayırt edilir ve istenen boyutta olacak şekilde kaldırılabilir. Bu biofabrication tekniği makro mikro ölçekli değişir iç yapıları çok çeşitli çoğaltma sağlar.

Serum albümini, dolaşım sistemi içinde en bol proteindir. Proteinler polielektrolitler olduğundan, çözünürlük elektrostatik etkileşimler ile belirlenmiştir 15-17. Bu düşük tuz konsantrasyonlarında olduğu gösterilmiştir, bir tuzlama in çözünürlüğünü 18 sağlayan bir protein üzerindeki etkisi vardır. Glutaraldehit albümin özelliklerinde değişikliklere neden olan bir çapraz bağlama maddesidir. Şekil 1 'de görülen renk değişimi aldimin bağlantıları 19-21 oluşmasına atfedilir. Glutaraldehit arası kovalent bağlar 14 oluşturmak için lizin amino grupları ile BSA ile ağırlıklı olarak reaksiyona girer. Veri tuzlarının artış (PBS 2x 1x PBS) kauçuk elastikiyetini geliştirilmiş olduğunu gösterir. yüksek glutaraldehit konsantrasyonu düşük konsantrasyon olanlara kıyasla daha erken set sert jeller üretir. Bununla birlikte, bunlar dağıtım homojen karışımı daha zordur ve bunlar kırılgan jelleri oluştururlar. yüksek sıcaklıklar glutaraldehit ve BSA reaksiyonu hızlandırmak için kalıplar içine BSA kauçuk uygun bir miktar vermek için, montaj her parçası soğuk tutulmalıdır.İdeal kauçuk (% 30 BSA 2x PBS veya 1 x PBS içinde% 3 glutaraldehit) sürekli olarak deforme olmadan büyük bir yüke direnebilen viskoelastik malzemesi olarak davranır. taşıma ve BSA lastik yapısı etrafında malzeme döküm Bu çok önemli hale gelir.

Tripsin proteinleri hidrolize bir serin proteazdır. Tripsin, yüksek parçalama özgüllüğü yaygın olarak kullanılan bir enzimdir. Bu amino asitler, lizin karboksil tarafında ağırlıklı peptid zincirleri böler ve 22 arginin. BSA su içinde düşük konsantrasyonlarda kolayca çözülebilir ve tripsin kolaylıkla sağlam ve nispeten bakir kolajen ayrılan BSA kauçuk ile sindirilmiş. Malzeme hücreleri ile herhangi bir temas olmayacak. yapı serbest glutaraldehit varlığı için test edildi ve bu fiksatif izine vardı. Bu biofabrication için gözden çıkarılabilir materyal olarak BSA kauçuk etkinliğini göstermektedir. Bu protokolde, kollajen herhangi ot iskele malzemesi olarak kullanılan, fakatTripsin sindirime dirençlidir, malzemenin kullanılabilir.

Gelecek çalışma endotel ve fibroblast hücreleri ile iskele ekim yoluyla hidrojellerin içinde vasküler bileşenleri sulandırılması üzerinde durulacaktır. zorluklardan biri yerel 3D dağılımı taklit kanalların içinde boyunca hücrelerin muntazam bir dağılımının oluşturmaktır. Bu sorunu çözmek için, bir strateji, sızdırmazlık veya kanal tıkanması ve hücre süspansiyonu enjekte izin veren geliştirilmektedir. Test edilen malzeme 4 ° C'da bir termik jel, sıvı ve C 23,24 ° 30 üzerinde bir katı Pluronic F 127 vardır. Pluronic yüksek konsantrasyonu, gerekli zamansal bir yalıtım oluşturmak başarılı oldu. Hücre süspansiyonu, skafoldun kanal içinde sonra hücreler 3D yapısının tüm kenarlarına bağlı kadar işletme zaman belirli bir miktarda döndürülür. iç kanal korumak için yeterli ortam olacakHücre sağkalım. Pluronic da jel formunda muhafaza eder ve bir sulu ortam içinde kolayca çözülebilir. Hücreler uygun sonra, hidrojel ortamı ile su altında olacak ve çalışma amacına bağlı olarak, sabit ya da akış koşullarında yetiştirilebilir. Bu metodoloji ayrıca değerlendirilebilecektir olacak ve bu yayına takip olacak. Burada tarif edilen biofabrication tekniği henüz insan renal arterin bir iskele çoğaltmasını geliştirmek için kullanılmaktadır. Aynı yaklaşım, klinik geniş bir uygulama yelpazesine bu işlemin uygulanabilirliği genişletmek için, örneğin kalp gibi dokularda, diğer türleri ile yapılabilir.

Burada geliştirilen biofabrication tekniği hızlı ve güvenilir içsel geometrik özelliklerini özetlemek olabilir, in vitro iskelelerinin nesil ileri bir adımdır. Doğal bir malzeme, kolajen gibi, en uygun kimyasal ve sentetik malzemeler üzerine hücrelere fiziksel ipuçları sağladığı için seçildi. bu nayapısal materyaller olarak hasar görmüş dokunun değiştirilmesi için, geliştirme, malformasyon, ve hastalık dokusu in vitro model olarak, terapötik araştırma için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
  2. Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-172 (2003).
  3. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, s467-s479 (2008).
  4. Salerno, A., Di Maio, E., Iannace, S., Netti, P. A. Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends. J. Porous Mater. 19, 181-188 (2011).
  5. Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10, 11-25 (2014).
  6. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos. Sci. Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  7. Sell, S. A., McClure, M. J., Garg, K., Wolfe, P. S., Bowlin, G. L. Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and cardiovascular tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev. 61, 1007-1019 (2009).
  8. Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Biomimetic Collagen Nanofibrous Materials for Bone Tissue Engineering. Adv. Eng. Mater. 12, B451-B466 (2010).
  9. Cao, H., Kuboyama, N. A biodegradable porous composite scaffold of PGA/beta-TCP for bone tissue engineering. Bone. 46, 386-395 (2010).
  10. Ankam, S., et al. Substrate topography and size determine the fate of human embryonic stem cells to neuronal or glial lineage. Acta Biomater. 9, 4535-4545 (2013).
  11. Bose, S., Vahabzadeh, S., Bandyopadhyay, A. Bone tissue engineering using 3D printing. Mater. Today. 16, 496-504 (2013).
  12. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  13. Yost, M. J., et al. A novel tubular scaffold for cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng. 10, 273-284 (2004).
  14. Habeeb, A. J., Hiramoto, R. Reaction of proteins with glutaraldehyde. Arch Biochem Biophys. 126, 16-26 (1968).
  15. Tanford, C., Buzzell, J. G. The Viscosity of Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin between pH 4.3 and 10.5. J. Phys. Chem. 60, 225-231 (1956).
  16. Yadav, S., Shire, S. J., Kalonia, D. S. Viscosity analysis of high concentration bovine serum albumin aqueous solutions. Pharm Res. 28, 1973-1983 (2011).
  17. Tobitani, A., Ross-Murphy, S. B. The intrinsic viscosity of polyelectrolytes revisited. Polym. Int. 44, 338-347 (1997).
  18. Arakawa, T., Timasheff, S. N. Theory of protein solubility. Methods Enzymol. 114, 49-77 (1985).
  19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37, 790-796 (2004).
  20. Burmeister, J. J., et al. Glutaraldehyde cross-linked glutamate oxidase coated microelectrode arrays: selectivity and resting levels of glutamate in the CNS. ACS Chem Neurosci. 4, 721-728 (2013).
  21. Chatterji, P. R. Gelatin with hydrophilic/hydrophobic grafts and glutaraldehyde crosslinks. J. Appl. Polym. Sci. 37, 2203-2212 (1989).
  22. Freije, J. R., et al. Chemically modified, immobilized trypsin reactor with improved digestion efficiency. J Proteome Res. 4, 1805-1813 (2005).
  23. Cunha-Filho, M. S., Alvarez-Lorenzo, C., Martinez-Pacheco, R., Landin, M. Temperature-sensitive gels for intratumoral delivery of beta-lapachone: effect of cyclodextrins and ethanol. ScientificWorldJournal. 2012, 126723 (2012).
  24. Basak, R., Bandyopadhyay, R. Encapsulation of hydrophobic drugs in Pluronic F127 micelles: effects of drug hydrophobicity, solution temperature, and pH. Langmuir. 29, 4350-4356 (2013).
Üç boyutlu Biyomimetik Teknoloji: Roman Biorubber Kollajen Hidrojeller içinde Mikro ve Makro ölçekli Mimarileri Tanımlı oluşturur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).More

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter