To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Vi etableret en endodermal epithelcellekultur model (EEC) på undersøgelse af funktionen af visse enzymer og proteiner i mediering næringsstofudnyttelse af aviær embryoner under udvikling. Befrugtede japanske vagtler æg blev inkuberet ved 37 ° C i 5 dage og derefter blommesækken membraner (YSM) blev opsamlet for at etablere EØF-dyrkningssystem. Vi isolerede den embryonale endoderm lag fra YSM, og skiveskåret membranen i 2 – 3 mm stykker og delvist spaltet med collagenase før podning i 24-brønds dyrkningsplader. EECS formere ud af vævet og er klar til studier af cellekulturer. Vi fandt, at EECS havde typiske karakteristika for YSM in vivo, for eksempel akkumulering af lipiddråber, ekspression af sterol O-acyltransferase og lipoproteinlipase. Den delvise fordøjelse behandling signifikant øget vellykket sats af EØF kultur. Ved hjælp EECS, vi påvist, at ekspressionen af SOAT1 blev reguleret af cAMP dependent proteinkinase A beslægtet pathway. Denne primære japansk vagtel EØF kultur-systemet er et nyttigt værktøj til at studere embryonale lipid transport og præcisere den rolle, gener involveret i formidling næringsstofudnyttelse i YSM under aviær embryonale udvikling.
Den største ernæringsmæssige ressource fugleembryo er æggeblomme, sammensat af 33% lipider, 17% protein og 1% aske. 1 under fosterudviklingen, blommesækken membran (YSM) vokser inde fra embryoniske bughulen og gradvist dækker blommen overflade. Begyndende ved embryonisk dag 2 genekspression forbundet med lipidmetabolisme og angiogenese gradvist steg i YSM, og YSM langsomt udvikler villus-lignende fremspring. 8,9 Disse prognoser øger optagelsen af æggeblomme næringsstoffer til at understøtte fosterudviklingen. Den YSM er en extraembryonic væv, der indeholder tre kim lag, endoderm, mesoderm og ektoderm. 14 blommesæk ektoderm vender æggehviden og links med vitellinmembranen til forsigtigt at dække blommesækken. De endodermale epitelceller står direkte mod æggeblomme og tjener som næringsstofudnyttelse portaler. 6 Som YSM ekspanderer, endodermal epitelcelle (EECS) kan divideres med shape og funktionalitet i to grupper, område vitelline og område vasculosa. 7
Område vitelline består af endodermale celler og er fjernt fra foster; område vasculosa består af mesodermale celler og dækker differentierede EECS med blodkar og bindevæv. Ved fosterdag 5 er blommen helt dækket af ektoderm og endoderm af YSM og det vaskulære område er vokset hurtigt. The YSM absorberer, omdanner og frigiver lipider (som æggeblomme-afledte meget lavdensitetslipoprotein) og proteiner til det embryoniske kredsløbssygdomme. 9, 2 Derfor har vi etableret en primær japansk vagtel embryonale endodermal epithelcellekultur system, for at undersøge mekanismerne af lipid udnyttelse i YSM under aviær embryonisk udvikling.
Lipider såsom triacylglycerol, lecithin, phospholipid og kolesterol ester (CE) er de primære energikilder til aviær embryoner. På de tidlige stadier af udvikling, æggeblomme lipider er composed på kun 1,3% CE og det stiger til 10-15% midtvejs af aviær fosterudvikling 3, er 11. Kolesterol ester syntetiseret fra kolesterol med sterol O-acyltransferase en (SOAT1) i fugleembryo YSM. 4
Opbevaringen form for kolesterol er CE, er CE transporteres i lipoproteiner, og lipoproteiner transporteres med cirkulation til væv. 13. En uge før luge er der hurtig vækst af aviær embryoner. Ca. 68% af de resterende lipid indhold i æggeblomme absorberes i denne fase. 10. Den mekanisme, der æggeblomme lipider udnyttes kan afklares ved et EØF forskning model. En kylling EØF kultur protokol blev etableret for at opnå denne forskning mål. 2, 9 Men på grund af den lave succesrate på vævseksplantater, er behov for en forbedret procedure cellekultur EØF at studere funktionen af visse enzymer og proteiner i mediering næringsstofudnyttelse ved aviær embryoner under udviklingen.
Fordi den tidligere kultur system kun har begrænset succes, er der behov for en bedre dyrkningssystem. Den japanske vagtler YSM endoderm kræver behandling med proteolytiske enzymer, såsom collagenase at løsne celle-celle vejkryds for at opnå bedre vækst i ex-vivo-eksplantater. Vore data viser, at celle tal fra delvis fordøjelse behandling var større end fra ufordøjet vævskultur efter podning i 2 dage (Figur 1). Derfor er den delvise proteolytisk fordøjelse er et kritisk trin for at forbedre c…
The authors have nothing to disclose.
Støtte til udvikling af nuværende protokol er især støttet af "Sigt efter Top University Plan" for National Taiwan University, Taiwan (tilskud ID-104R350144), samt Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Taiwan (tilskud ID: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Vi især takke Center for Biotechnology for National Taiwan University for at give et dyr værelse og laboratorium plads til den aktuelle undersøgelse.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |