Abstract
Vi etableret en endodermal epithelcellekultur model (EEC) på undersøgelse af funktionen af visse enzymer og proteiner i mediering næringsstofudnyttelse af aviær embryoner under udvikling. Befrugtede japanske vagtler æg blev inkuberet ved 37 ° C i 5 dage og derefter blommesækken membraner (YSM) blev opsamlet for at etablere EØF-dyrkningssystem. Vi isolerede den embryonale endoderm lag fra YSM, og skiveskåret membranen i 2 - 3 mm stykker og delvist spaltet med collagenase før podning i 24-brønds dyrkningsplader. EECS formere ud af vævet og er klar til studier af cellekulturer. Vi fandt, at EECS havde typiske karakteristika for YSM in vivo, for eksempel akkumulering af lipiddråber, ekspression af sterol O-acyltransferase og lipoproteinlipase. Den delvise fordøjelse behandling signifikant øget vellykket sats af EØF kultur. Ved hjælp EECS, vi påvist, at ekspressionen af SOAT1 blev reguleret af cAMP dependent proteinkinase A beslægtet pathway. Denne primære japansk vagtel EØF kultur-systemet er et nyttigt værktøj til at studere embryonale lipid transport og præcisere den rolle, gener involveret i formidling næringsstofudnyttelse i YSM under aviær embryonale udvikling.
Introduction
Den største ernæringsmæssige ressource fugleembryo er æggeblomme, sammensat af 33% lipider, 17% protein og 1% aske. 1 under fosterudviklingen, blommesækken membran (YSM) vokser inde fra embryoniske bughulen og gradvist dækker blommen overflade. Begyndende ved embryonisk dag 2 genekspression forbundet med lipidmetabolisme og angiogenese gradvist steg i YSM, og YSM langsomt udvikler villus-lignende fremspring. 8,9 Disse prognoser øger optagelsen af æggeblomme næringsstoffer til at understøtte fosterudviklingen. Den YSM er en extraembryonic væv, der indeholder tre kim lag, endoderm, mesoderm og ektoderm. 14 blommesæk ektoderm vender æggehviden og links med vitellinmembranen til forsigtigt at dække blommesækken. De endodermale epitelceller står direkte mod æggeblomme og tjener som næringsstofudnyttelse portaler. 6 Som YSM ekspanderer, endodermal epitelcelle (EECS) kan divideres med shape og funktionalitet i to grupper, område vitelline og område vasculosa. 7
Område vitelline består af endodermale celler og er fjernt fra foster; område vasculosa består af mesodermale celler og dækker differentierede EECS med blodkar og bindevæv. Ved fosterdag 5 er blommen helt dækket af ektoderm og endoderm af YSM og det vaskulære område er vokset hurtigt. The YSM absorberer, omdanner og frigiver lipider (som æggeblomme-afledte meget lavdensitetslipoprotein) og proteiner til det embryoniske kredsløbssygdomme. 9, 2 Derfor har vi etableret en primær japansk vagtel embryonale endodermal epithelcellekultur system, for at undersøge mekanismerne af lipid udnyttelse i YSM under aviær embryonisk udvikling.
Lipider såsom triacylglycerol, lecithin, phospholipid og kolesterol ester (CE) er de primære energikilder til aviær embryoner. På de tidlige stadier af udvikling, æggeblomme lipider er composed på kun 1,3% CE og det stiger til 10-15% midtvejs af aviær fosterudvikling 3, er 11. Kolesterol ester syntetiseret fra kolesterol med sterol O-acyltransferase en (SOAT1) i fugleembryo YSM. 4
Opbevaringen form for kolesterol er CE, er CE transporteres i lipoproteiner, og lipoproteiner transporteres med cirkulation til væv. 13. En uge før luge er der hurtig vækst af aviær embryoner. Ca. 68% af de resterende lipid indhold i æggeblomme absorberes i denne fase. 10. Den mekanisme, der æggeblomme lipider udnyttes kan afklares ved et EØF forskning model. En kylling EØF kultur protokol blev etableret for at opnå denne forskning mål. 2, 9 Men på grund af den lave succesrate på vævseksplantater, er behov for en forbedret procedure cellekultur EØF at studere funktionen af visse enzymer og proteiner i mediering næringsstofudnyttelse ved aviær embryoner under udviklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne procedure er en modifikation af en kylling model kultur protokol udviklet af Bauer et al 2013 og Nakazawa et al, 2011. 2,9..
1. Forbered Sund Embryonale Dag 5 Embryoner fra japansk Quail
- Placer 1 han og 3 kvinder kønsmoden japansk vagtel sammen i samme bur. Forsyning foder og vand ad libitum. Juster lys i dyret plads til 14 timer af lys og 10 timers mørke.
- Saml befrugtede æg i plastposer hver dag om eftermiddagen og holde dem i et 16 ° C køleskab at forsinke væksten af embryoner.
- Efter opsamling et tilstrækkeligt antal æg inden for en periode på to uger, inkuberes de befrugtede æg i en 37 ° C inkubator med god ventilation i fem dage.
2. Forbered basalt medium og vaskeopløsningerne
- Brug DMEM / F-12 medium (indstillet til pH 7,2) som vækstmedium og supplere detmed 10% nyfødt kalveserum (NBCS) og 1% Pen-Strep ampho. Opløsning (PSA; Penicillin, 10 5 enheder / l; streptomycin, 100 mg / l; amphotericin B, 0,25 mg / l).
- Forbered phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning ved en 10x koncentration til opbevaring; bruge 1x PBS-opløsning (indeholdende NaCl, 137,93 mM; KCI, 2.667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM; Na 2 HPO 4 -7H 2 O, 8,06 mM; justere til pH 7,2) for at vaske og fugte blommesækken membranen, mens adskillelse af endoderm fra æggeblomme og albumin.
- Brug DMEM-medium (indstillet til pH 7,2) til at re-suspendere endoderm pellets.
3. Indsamling af Primary EECS fra japanske Quail YSMs
- Inkuber de indsamlede æg i 5 dage (trin 1.3). Undersøg æggene ved et æg Candler at bekræfte normal fosterudvikling.
BEMÆRK: På embryonal dag 5, grænsen af YSM mesoderm er meget klar og de 3 embryonale lag mindre tæt-bundet sammen, så det er let at obtain endoderm. Brug kun æggene viser normal kapillær cirkulation udvikling for YSM kollektioner. - Rengør æggeskallen omhyggeligt med friske vand og 75% ethanol. Åbn æggeskallen fra luften celle position ved en saks, forsigtigt skræl ud og indsamle hele YSM af pincet og sted i en 10 cm dyrkningsskål fyldt med 37 ° C 1x PBS.
- Ved hjælp af en saks fjerne embryonet, blommesækken og æggehvide, og forsigtigt vaske YSM med 1x PBS tre gange og placere YSM i PBS-opløsning i en 10 cm dyrkningsskål.
- Brug pincet og en saks til at fjerne ectoderm fra YSM. Bruge 2 pincet, en til fast holde den endodermal cellelag, og den anden til at holde det kapillære mesoderm.
- Under et dissektionsmikroskop, træk fra hinanden og adskille endoderm fra kanten af mesoderm i retning mod embryoet. Opsaml lysegule endoderm i 50 ml centrifugerør under anvendelse af en pipette og anbringes i 15 ml vækstmedium i et 37 ° C watis bad, indtil alle væv kollektioner er afsluttet.
4. Spaltning af endoderm Skiver af collagenasefordøjelse
- Frisk opløse 6,5 enheder af type IV collagenase i 10 ml DMEM.
- Centrifuger 50 ml rør (3.4) ved 130 xg i 3 minutter ved stuetemperatur. Aspirer medium og placere alle de endoderm i en 6 cm dyrkningsskål under anvendelse af en pipette. Tilsæt 1 ml collagenase løsning på dette dyrkningsskålen.
- Skær endoderm indsamlet fra 2 vagtelembryoner med et par krum saks, indtil størrelsen på hver skive er omtrent 2 til 3 mm. Brug en dråbetæller, indsamle alle de skiverne i et 50 ml centrifugerør sammen med 9 ml frisk collagenaseopløsning.
- Fordøje væv med collagenase i 30 minutter i et 37 ° C rystevandbad ved 175 rpm. Denne delvise fordøjelse med collagenase bruges til at forbedre eksplantatet celleproliferation.
- Centrifuger ved 130 xg i 3 minutter ved stuetemperatur og forsigtigt fjerne supernatantfraktionen anvendelse af en pipette. Vask pelleten ved suspension i 20 ml DMEM og fjern supernatanten fraktion efter 130 xg centrifugering i 3 min.
- Resuspender pelleten med 12 ml vækstmedium (DMEM / F12 med 10% NBCS og 1% PSA) og frø forsigtigt og ligeligt i en plade med 24 brønde (hver brønd med 500 pi celle opløsning).
- Inkuber vævseksplantater ved 37 ° C i 5% CO2 i luft i 2 dage for at tillade celler at proliferere ud af vævene.
- Cellerne inkuberes i yderligere 2 dage og karakterisere for celle levedygtighed ved en celleviabilitetstest protokol. 15
BEMÆRK: Living celler opretholder et reducerende miljø i cytosolen. Resazurin, den aktive bestanddel, er et ikke-toksisk, celle permeabel substans, der er blå i farven og næsten ikke-fluorescerende. Ved tilsætning til cellekulturer, resazurin reduceres til resorufin i cytosolen af mitokondrielle enzymer. Resorufin er rød i farven og meget fluorescerende. Levedygtige celler kontinuerligt konvertere resazurin til resorufin, increAsing den samlede fluorescens og farve af dyrkningsmediet omkringliggende celler. - Udfør endoderm epitelcelle total RNA-isolering, revers transkription og kvantitativ real-time PCR af markørgen-mRNA-ekspression som beskrevet. 16,17
- Brug omvendt transkriptase-PCR til påvisning SOAT1 mRNA (sense: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR produkt = 168 bp) som en specifik markør for EØF-celler. Brug β-actin mRNA (sense: 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisense: 5'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; PCR produkt = 151 bp) som en husholdning gen og intern kontrol.
- Brug gelelektroforese for at detektere produktet størrelse RT-qPCR. Forbered 1% agarose gel, og bland 10 pi qPCR produkt med 2 pi lastning farvestof. Load 10 pi blandingen i hver brønd i 1% agarosegel, og køre gelen ved 100V i 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at nå målet om at etablere en sammenhængende og nyttig celle model, er vi nødt til at udvide og stabilisere spredning sats og ydeevne af aviær EECS. Vi sammenlignede direkte inkubering af endoderm uden enzym fordøjelse med endoderm partielt fordøjet med proteolytiske enzymer, såsom collagenase eller collagenase plus 0,6 U dispase. Dispase er en amino-endopeptidase, som hydrolyserer de N-terminale peptidbindinger i ikke-polære aminosyrerester. Henviser proteasespaltning behandlinger øget celleproliferation sammenlignet med ingen fordøjelse (figur 1), cellevækst var ikke markant forskellige mellem de to enzymbehandlinger efter fem dages inkubation (figur 2). Imidlertid collagenase behandling resulterede i en bedre vækstkurve og viste, at EECS prolifererede støt i 6-9 dage (figur 2). Således partiel collagenasefordøjelse forbedret vækst af EECS fraex-vivo eksplanteret og anbefales at opnå tilstrækkelig og funktionel EØF.
Efter 4 dages inkubation EECS havde en adipocyt-lignende udseende påvist efter formalin fiksering og Oil Red O-farvning (figur 3), hvilket tyder korrekte fysiologiske egenskaber de dyrkede celler.
Vi antager, at cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) er et transkriptionsregulatorisk middel, cAMP phosphodiesterase inhibitor, 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX; at mindske nedbrydningen af cAMP) og adenylcyclase aktivator, forskolin (for at øge syntese af cAMP) både stimuleret SOAT1 mRNA-ekspression efter 24 timer behandling (figur 4). Disse behandlinger også øget ekspression af SREBP2, en cholesterolsyntese regulatorisk transkriptionsfaktor, og forskolin forøgede ekspression af perilipin-2 (PLIN2), overfladeproteinet markør of lipiddråber (figur 5). De EØF mRNA profiler til lipogene gener kvantificeret ved real-time PCR ligner adipocytter (figur 5).
Figur 1. Virkning af delvis collagenasefordøjelse på endoderm epitelceller. Vævseksplantater blev inkuberet i 2 dage for at tillade celler at proliferere ud af vævet. Vi observerede og beregnede numrene på de succesfuldt dyrkede EECS. Tal blev beregnet for celler uden fordøjelse og celler delvist fordøjet med collagenase; begge blev dyrket i 24-brønds plader. Y-aksen er brønd antallet af vellykkede prolifererede EECS i cellekultur plade af 24 brønde. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM. Analyse blev bestemt ved parret t-test. P <0,0001. Klik herfor at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cell Growth Udførelse af EECS efter delvis Enzyme fordøjelse. Proliferationshastigheden blev påvist ved celleviabilitetstest. Assayet indeholdt resazurin, en blå forbindelse, der har svag fluorescens og resazurin reduceres til resorufin ved ankomsten celler. Levedygtige celler kontinuerligt konvertere resazurin til resorufin, øge den generelle fluorescens og farve af mediet omgivende celler. Levedygtige celler blev detekteret ved absorbans ved 570 nm med normalisering ved 600 nm. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM. Analyse blev bestemt ved to-vejs ANOVA med Bonferroni post-test (collagenase gruppe n = 10; collagenase + dispase gruppe n = 11). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Zoom click her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Morfologi af dyrkede EECS. Efter 4 dages inkubation EECS havde en adipocyt-lignende udseende påvist efter formalin fiksering og Oil Red O-farvning. Fra venstre mod højre: EØF er i lyse felt med 100X forstørrelse, i lyse felt med 200X forstørrelse og i 200X forstørrelse efter farvning med Oil-rød O og hæmatoxylin. Den mørke plet på venstre side af det yderste venstre tal er det delvist fordøjet endoderm (membran). Scale søjle repræsenterer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. SOAT1 Transrivelse af EECS behandlet med cAMP aktivatorer. Vi behandlede EECS med stigende koncentrationer af IBMX eller forskolin på dag 5 i 24 timer. Vi ekstraheret mRNA'er fra behandlede celler og omdannes RNA til cDNA ved revers transkription-PCR. Vi analyserede transskription niveauer ved real-time kvantitativ PCR. β-actin blev anvendt som housekeeping-genet. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM. Analyser var med envejs ANOVA med Tukey post-test (n = 6) (* P≤ 0,05, ** P≤ 0,01). IBMX er en kompetitiv ikke-selektiv phosphodiesteraseinhibitor som rejser intracellulært cAMP, aktiverer PKA, inhiberer TNF-alfa og leukotriensyntese, reducerer inflammation og medfødte immunitet og er et ikke-selektivt adenosinreceptorantagonist. Forskolin er en allestedsnærværende aktivator af eukaryote adenylylcyclase, der almindeligvis anvendes til at hæve niveauet af cAMP. Klik her for at se en større version af denne Figure.
Figur 5. mRNA Udtryk af EØF er vokset til fem dage, derefter behandlet med cAMP aktivatorer i 24 timer. CDNA'erne i figur 4 blev brugt til at analysere genekspression niveauer ved real-time kvantitativ PCR. β-actin blev anvendt som housekeeping-genet og tjente som intern kontrol. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM. Analyser blev ved envejs ANOVA med Tukey post-test (n≤ 6) til at sammenligne behandlinger med kontrollen. SREBP2, sterol regulatorisk element-binding protein 2; LPL, lipoprotein lipase; PLIN2, perilipin-2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordi den tidligere kultur system kun har begrænset succes, er der behov for en bedre dyrkningssystem. Den japanske vagtler YSM endoderm kræver behandling med proteolytiske enzymer, såsom collagenase at løsne celle-celle vejkryds for at opnå bedre vækst i ex-vivo-eksplantater. Vore data viser, at celle tal fra delvis fordøjelse behandling var større end fra ufordøjet vævskultur efter podning i 2 dage (Figur 1). Derfor er den delvise proteolytisk fordøjelse er et kritisk trin for at forbedre celleudbytte fra YSM.
Den kritiske ændring i den aktuelle kultur-protokollen er den delvise proteolytisk fordøjelse. Denne behandling langt mere celle udbytte og den vellykkede sats for at opnå levende EECS. Fordøjelsesperioden er meget kritisk, fordi over-fordøjelse vil adskille celler fra vævet og cellerne ikke vil vedhæfte til pladen, mens under-fordøjelse resulteret i mindre celle udbytte ud fravævseksplantater. Vi fandt, at fra 30 til 40 min fordøjelse under anvendelse af de ovenfor beskrevne betingelser er optimal.
Den nuværende protokol kræver stor teknisk uddannelse for at opnå EECS. Tidspunktet indsamle EECS er begrænset, for eksempel vi kun indsamle EECS på embryonisk dag 5. Årsagen er, at som aviære embryoner vokse, forbindelserne mellem lagene i blommesækken membran er mere komplekse, og det nedsætter den vellykkede sats indsamle EECS. Den protokol kan bruges til at opnå EECS af embryoer tidligt, men ikke sene fase embryoner. Det begrænser muligheden for direkte forskning om de sene fase EECS.
Udtrykket af SOAT1 og lipoprotein lipase, og lipid ophobning er væsentlige egenskaber YSM 4,5,11, især EECS. I den aktuelle undersøgelse, SOAT1, LPL, og perilipin 2 (PLN2) mRNA blev udtrykt stærkt i EECS, hvilket tyder dyrkningssystemet kan generere celler med den korrekte fysiologiske characteristics. Den nuværende teknik produceret en stor mængde af primære EECS. Når vi brugte den tidligere beskrevne procedure 9, succesraten for EØF kultur var ca. 60% i cellekultur plader af 24 brønde, mens den nuværende protokol genererede EECS på næsten 100% succesrate.
Blommesækken membran er den vigtigste væv for at absorbere proteiner, lipider og kolesterol fra æggeblomme og fungerer dermed at overføre næringsstoffer fra æggeblomme til embryoner under udvikling. Det vigtigste enzym til kolesterol ester dannelse er SOAT1. 11 Fordi SOAT1 øger dramatisk i de sene stadier af aviær embryonale udvikling, når massive kolesterol forestring opstår 4, brugte vi SOAT1 mRNA-ekspression som markør-gen for at vurdere de særlige kendetegn ved dyrkede EECS. Vi viste, at denne primære EØF kultursystem produceret forventet fysiologiske egenskaber. Derfor kan EØF kultur-systemet være et værdifuldt værktøj til at studere embryonic lipid transport og præcisere den rolle, gener involveret i formidling næringsstofudnyttelse i YSM under aviær embryonale udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Støtte til udvikling af nuværende protokol er især støttet af "Sigt efter Top University Plan" for National Taiwan University, Taiwan (tilskud ID-104R350144), samt Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Taiwan (tilskud ID: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Vi især takke Center for Biotechnology for National Taiwan University for at give et dyr værelse og laboratorium plads til den aktuelle undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
