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Developmental Biology

Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

doi: 10.3791/53624 Published: March 10, 2016

Abstract

Nós estabelecemos um modelo de cultura de células epiteliais endodérmico (CEE) para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de utilização de nutrientes por embriões de aves durante o desenvolvimento. Fertilizados ovos de codorniz Japonesa foram incubadas a 37 ° C durante 5 dias e, em seguida, yolk sac membranas (YSM) foram recolhidas para se estabelecer o sistema de cultura de CEE. Isolamos a camada endoderma embrionário de YSM, e cortado da membrana em 2 - 3 mm pedaços e parcialmente digerido com colagenase antes de semear em placas de cultura de 24 poços. O EECS proliferam para fora do tecido e estão prontos para os estudos de cultura de células. Descobrimos que o EECS tinha características típicas de YSM in vivo, por exemplo, acúmulo de gotículas lipídicas, expressão de esteróis O-aciltransferase e lipoproteína lipase. O tratamento a digestão parcial aumentou significativamente a taxa de sucesso da cultura CEE. Utilizando o EECS, foi demonstrado que a expressão de SOAT1 foi regulado pelo AMPc dproteína quinase ependent Um caminho relacionado. Este sistema de cultura de codorna japonesa CEE primária é uma ferramenta útil para estudar o transporte de lipídios embrionário e para esclarecer o papel de genes envolvidos na mediação de utilização de nutrientes em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

Introduction

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O recurso principal nutricional do embrião aviário é gema, composto de 33% de lípidos, proteínas 17%, e 1% de cinzas. 1 durante o desenvolvimento embrionário, a membrana vitelina (YSM) cresce a partir de dentro da cavidade abdominal embrionário e cobre gradualmente a gema superfície. Começando no dia embrionário 2, a expressão de genes associados com o metabolismo dos lípidos e a angiogénese é gradualmente aumentada em YSM, e o YSM desenvolve lentamente projecções das vilosidades semelhantes. Estas projecções 8,9 aumentar a absorção de nutrientes gema para suportar o desenvolvimento embrionário. O YSM é um tecido extra-embrionário que contém três camadas germinativas, endoderme, mesoderme e ectoderme. 14 do ectoderma saco vitelino enfrenta a clara e links com a membrana vitelina para cobrir suavemente o saco vitelino. As células epiteliais da endoderme são confrontados diretamente para a gema de ovo e servir como portais de utilização de nutrientes. 6 À medida que a ADM se expande, células epiteliais endodérmico (EECS) pode ser dividido por shape e funcionalidade em dois grupos, a área vitelínicas e vasculosa área. 7

vitelina área é composta por células da endoderme e está distante do embrião; vasculosa área é composta por células mesodérmicas e cobre EECS diferenciadas com vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos. Por dia embrionário 5, a gema é totalmente coberta por ectoderma e endoderma de YSM ea área vascular tem crescido rapidamente. O YSM absorve, recompõe e liberta lípidos (como-gema derivado lipoproteína de muito baixa densidade) e proteínas no sistema circulatório embrionário. 9, 2 Assim, foi estabelecido um embrionário sistema de codorniz japonesa primária endodérmica epitelial de cultura de células, para estudar os mecanismos de lípido utilização em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

Os lípidos tais como triglicerídeos, lecitina, de fosfolípidos e ésteres de colesterol (CE) são as fontes de energia primárias para embriões de aves. Nas fases iniciais de desenvolvimento, lípidos da gema são Composed de apenas 1,3% do CE e ele sobe para 10-15% a meio do período de desenvolvimento embrionário aviária 3, 11. éster de colesterol é sintetizado a partir do colesterol, esteróis O-aciltransferase 1 (SOAT1) em YSM embrião aviária. 4

A forma de armazenamento de colesterol é CE, CE é realizada nas lipoproteínas e lipoproteínas são transportados pela circulação para os tecidos. 13 Uma semana antes escotilha há um crescimento rápido dos embriões de aves. Aproximadamente 68% do conteúdo de lípidos restantes na gema são absorvidos durante esta fase. 10 O mecanismo pelo qual a gema de lípidos são utilizados pode ser clarificada por um modelo de pesquisa CEE. Um protocolo de cultura de frango CEE foi estabelecido para atingir este objectivo de pesquisa. 2, 9 No entanto, devido à baixa taxa de sucesso de explantes de tecidos, um processo de cultura de células CEE melhorada é necessária para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de a utilização de nutrientes pelos embriões de aves durante o desenvolvimento.

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Protocol

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NOTA: Este procedimento é uma modificação de um protocolo de cultura modelo de galinha desenvolvido por Bauer et al 2013 e Nakazawa et al, 2011. 2,9..

1. Prepare Healthy Embryonic Dia 5 embriões de codorniz japonesa

  1. Coloque 1 do sexo masculino e 3 do sexo feminino sexualmente maduros codornas japonesas juntos na mesma gaiola. Alimentação de alimentação e água ad libitum. Ajustar a luz na sala de animal para 14 horas de luz e 10 horas de escuridão.
  2. Recolher os ovos fertilizados em sacos de plástico a cada dia no período da tarde e mantê-los em um 16 ° C geladeira para retardar a taxa de crescimento dos embriões.
  3. Após recolha de um número suficiente de ovos dentro de um período de duas semanas, incubar os ovos fertilizados de uma incubadora a 37 ° C com bom arejamento durante cinco dias.

2. Prepare Basal Médio e soluções de lavagem

  1. Use DMEM / F-12 (ajustado a pH 7,2) como meio de crescimento, e completá-locom o novo 10% de soro vitelo recém-nascido (NBCS) e 1% de Pen-Strep Ampho. Solução (PSA; penicilina, 10 5 unidades / L; estreptomicina, 100 mg / l; anfotericina B, 0,25 mg / L).
  2. Preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração 10x para o armazenamento; usar a solução 1x PBS (contendo NaCl, 137,93 mM; KCl, 2.667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM; Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; acertar a pH 7,2) para lavar e umedecer o tempo membrana saco vitelino separação da endoderme de gema de ovo e albumina.
  3. Use meio DMEM (ajustado para pH 7,2) para re-suspender as pelotas endoderme.

3. Recolha de EECS primária de japoneses codorniz YSMs

  1. Incubar os ovos recolhidos durante 5 dias (passo 1.3). Examine os ovos por um candler ovo para confirmar o desenvolvimento embrionário normal.
    NOTA: No dia embrionário 5, o limite da YSM mesoderme é muito clara e as 3 camadas embrionárias são menos bem-ligados entre si, por isso é fácil de obendoderme Tain. Utilize apenas os ovos que apresentem o desenvolvimento normal circulação capilar para coleções YSM.
  2. Limpar a casca de ovo com cuidado usando água doce e 75% de etanol. Abra a casca de ovo a partir da posição das células de ar por um par de tesouras, descascar delicadamente fora e recolher toda a YSM por uma pinça e coloque em um prato de cultura 10 centímetros preenchido com 37 ° C 1x PBS.
  3. Utilizando um par de tesouras remover o embrião, gema e clara de ovo, e lavar cuidadosamente o YSM com 1x PBS três vezes e colocar YSM em solução de PBS numa placa de cultura de 10 cm.
  4. Use uma pinça e um par de tesouras para remover o ectoderme de YSM. Use 2 fórceps, um para segurar firmemente a camada de células endoderme, e a outra para segurar o mesoderme capilar.
  5. Sob um microscópio de dissecação, separar e separar a endoderme a partir da borda da mesoderme em direcção ao embrião. Recolhe-se o endoderme amarelo claro em 50 ml de tubos de centrífuga usando um conta-gotas e o lugar em 15 ml de meio de crescimento numa Wat 37 ° Cbanho er até que todas as coleções de tecidos estão concluídas.

4. A digestão do Endoderma fatias por digestão de colagenase

  1. Recentemente dissolver 6,5 unidades de colagenase tipo IV em 10 ml de DMEM.
  2. Centrifugar os tubos de 50 ml (3,4) a 130 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o meio e colocar toda a endoderme em uma placa de cultura de 6 centímetros, usando uma pipeta. Adicionar solução de colagenase 1 ml a esta placa de cultura.
  3. Cortar a endoderme recolhidos a partir de 2 embriões de codorniz com um par de tesouras curvas até que o tamanho de cada fatia é de aproximadamente 2 a 3 mm. Usar um conta-gotas, recolher todas as fatias para um tubo de centrífuga de 50 ml, juntamente com 9 ml de solução de colagenase fresco.
  4. Digerir o tecido com colagenase durante 30 minutos num banho de água com agitação a 37 ° C a 175 rpm. Esta digestão parcial com colagenase é utilizado para melhorar a proliferação de células dos explantes.
  5. Centrifugar a 130 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente e suavemente remover a fracção do sobrenadante utilizando uma pipeta. Lava-se a pelete por suspensão em 20 ml de DMEM e remover a fracção do sobrenadante após a centrifugação de 130 x g durante 3 min.
  6. Re-suspender o sedimento com 12 ml de meio de crescimento (DMEM / F12 com 10% de NBCS e 1% de PSA) e sementes suavemente e igualmente numa placa de 24 poços (cada poço uma solução de células com 500 ul).
  7. Incubar explantes de tecido a 37 ° C em 5% de CO 2 em ar durante 2 dias para permitir que as células a proliferar para fora dos tecidos.
  8. Incubar as células por mais 2 dias e caracterizar quanto à viabilidade celular por um protocolo de ensaio de viabilidade celular. 15
    NOTA: Living células manter um ambiente de redução dentro do citoplasma. Resazurina, o ingrediente activo, é, de um composto não-tóxico permeável célula que é azul em cor e virtualmente não fluorescente. Quando adicionado a culturas de células, a Resazurina é reduzida a resorufina no citosol por enzimas mitocondriais. Resorufina é de cor vermelha e altamente fluorescente. As células viáveis ​​converter continuamente resazurina a resorufina, increasing a fluorescência global e cor do meio de cultura de células circundante.
  9. Realizar endoderme célula epitelial de isolamento de ARN total, a transcrição e quantitativa PCR em tempo real de expressão de ARNm de gene marcador reversa como descrito 16,17.
    1. Use de PCR de transcriptase reversa para detectar SOAT1 ARNm (sentido directo: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; anti-sentido: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; produto de PCR = 168 pb) como um marcador específico para as células CEE. Use β-actina de ARNm (sentido directo: 5'-TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; anti-sentido: 5'-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; produto de PCR = 151 pb), como um gene de manutenção e o controlo interno.
    2. Use electroforese em gel para detectar o tamanho do produto de RT-qPCR. Prepare 1% de gel de agarose, e misturam 10 jil do produto qPCR com 2 ul de corante de carga. Carga de 10 ul de mistura em cada poço em gel de agarose a 1%, e executar o gel por 100V durante 30 minutos.

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Representative Results

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A fim de alcançar o objetivo de estabelecer um modelo de celular consistente e útil, nós precisamos de alargar e estabilizar a taxa de proliferação e desempenho dos EECS aviária. Comparamos a incubação directa da endoderme sem digestão com enzima endoderme parcialmente digerido com enzimas proteolíticas, tais como colagenase ou colagenase mais 0,6 L de dispase. Dispase é um amino-endopeptidase que hidrolisa as ligações peptidicas N-terminais de resíduos de aminoácidos não-polares. Considerando que os tratamentos de digestão da protease do aumento da proliferação celular em comparação com nenhuma digestão (Figura 1), o crescimento celular não foi significativamente diferente entre os dois tratamentos enzimáticos após cinco dias de incubação (Figura 2). No entanto, o tratamento com colagenase resultou em uma melhor curva de crescimento e mostraram que EECS proliferaram de forma constante durante 6-9 dias (Figura 2). Assim, a digestão de colagenase parcial o aumento do crescimento de EECS doexplantes ex-vivo e é recomendado para obter CEE suficiente e funcional.

Após 4 dias de incubação, tinham uma aparência EECS-adipócito como detectada após fixação em formalina e óleo vermelho-ó coloração (Figura 3), sugerindo características fisiológicas correcção das células cultivadas.

Colocámos a hipótese de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é um agente de transcrição reguladora, o inibidor de fosfodiesterase AMPc, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX; para diminuir a degradação do AMPc) e o activador de adenilciclase, forscolina (para aumentar a síntese de cAMP) tanto estimulada a expressão de ARNm SOAT1 após 24 horas de tratamento (Figura 4). Estes tratamentos também aumentou a expressão de SREBP2, um factor de transcrição regulador da síntese de colesterol, e forscolina aumentou a expressão de perilipin-2 (PLIN2), a superfície de marcador de proteína Sf gotículas de lípidos (Figura 5). Os perfis de mRNA de genes CEE lipogênicas quantificados por PCR em tempo real são semelhantes aos adipócitos (Figura 5).

figura 1
Figura 1. Efeito de digestão parcial de colagenase em células endodérmicas epitélio. Explantes de tecido foram incubadas durante 2 dias para permitir que as células a proliferar para fora do tecido. Observamos e calculou os números dos EECS cultivadas com sucesso. Números foram calculados para células sem células digestão e parcialmente digerido com colagenase; ambas foram cultivadas em placas de 24 poços. O eixo dos Y é o número do poço EECS proliferaram com sucesso em placa de cultura celular de 24 poços. Os dados foram apresentados como média ± SEM. Análise foram determinadas pelo teste t emparelhado. P <0,0001. Por favor clique aquipara ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. O desempenho da célula Crescimento de EECS Após parcial digestão enzimática. A taxa de proliferação celular foi detectada por ensaio de viabilidade celular. O ensaio continha resazurina, um composto azul que tem fluorescência fraca e resazurina é reduzido a resorufina ao entrar em células. As células viáveis ​​converter continuamente resazurina para resorufina, aumentando a fluorescência geral ea cor dos media células circundantes. As células viáveis ​​foram detectados por absorvância a 570 nm com normalização a 600 nm. Os dados foram apresentados como média ± SEM. Análise foram determinados por ANOVA de duas vias com Bonferroni pós-teste (colagenase grupo n = 10; colagenase + dispase grupo n = 11). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Por favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. A morfologia do Cultivadas EECS. Após 4 dias de incubação, EECS tinha uma aparência adipócito-like detectado após coloração fixação formalina e Oil-O vermelho. Da esquerda para a direita: CEE do no campo brilhante com ampliação de 100X, no campo luminoso, com uma ampliação de 200X e 200X após coloração com O Óleo-vermelho e hematoxilina. A mancha escura na esquerda da figura à esquerda é a endoderme parcialmente digerido (membrana). Barra de escala representa 200 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. A SOAT1 Transcrição de EECS tratados com o acampamento de ativadores. Nós tratada EECS com concentrações crescentes de IBMX ou forskolin no dia 5, durante 24 horas. Foram extraídos os mRNAs a partir de células tratadas e convertido o ARN em ADNc por PCR de transcrição inversa. Foram analisados ​​os níveis de transcrição por PCR em tempo real quantitativo. β-actina foi utilizado como o gene de manutenção. Os dados foram apresentados como média ± SEM. As análises foram de one-way ANOVA com pós-teste de Tukey (n = 6) (* p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01). IBMX é um inibidor da fosfodiesterase não selectivo competitiva o que aumenta o AMPc intracelular, activa PKA, inibe o TNF-alfa e a síntese de leucotrienos, reduz a inflamação e a imunidade inata e é um antagonista do receptor de adenosina não selectivo. Forskolin é um activador onipresente da guanilato ciclase eucariótica, comumente usado para elevar os níveis de cAMP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figuré.

Figura 5
Figura 5. O ARNm de Expressões crescidas de CEE durante cinco dias, depois tratou-se com Activadores de cAMP durante 24 horas. O cDNA do na Figura 4 foram usados ​​para analisar os níveis de expressão de genes por PCR em tempo real quantitativa. β-actina foi utilizado como o gene de manutenção e serviu como o controlo interno. Os dados foram apresentados como média ± SEM. As análises foram por ANOVA de uma via com o pós-teste de Tukey (n≤ 6) para comparar os tratamentos com o controlo. SREBP2, esterol reguladora proteína 2 de ligação ao elemento; LPL, lipoproteína lipase; PLIN2, perilipin-2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Uma vez que o sistema de cultura anterior tem apenas um sucesso limitado, é necessário um sistema de cultura melhor. A endoderme codornizes YSM japonesa requer tratamento com enzimas proteolíticas tais como a colagenase para soltar as junções célula-célula para alcançar um melhor desempenho do crescimento nos explantes ex-vivo. Os nossos dados mostram que o número de células de tratamento digestão parcial foi maior do que a partir da cultura de tecido não digerido após a sementeira, durante 2 dias (Figura 1). Portanto, a digestão proteolítica parcial é um passo crítico para aumentar o rendimento de células a partir do ADM.

A modificação crítica na cultura protocolo actual é a digestão proteolítica parcial. Este tratamento melhorou substancialmente o rendimento celular e a taxa de sucesso de obtenção EECS vivo. O tempo de digestão é muito crítico, porque o excesso de digestão vai separar as células do tecido e as células não irá anexar à placa, enquanto sub-digestão resultou em menor produção de células doexplantes de tecido. Verificou-se que 30 a 40 min de digestão utilizando as condições descritas acima é óptima.

O protocolo atual exige uma formação de alto nível técnico para obter EECS. O ponto de tempo da recolha EECS é limitado, por exemplo, apenas recolhe EECS no dia embrionário 5. A razão é que, como embriões de aves crescem, as ligações entre as camadas na membrana vitelina são mais complexos e diminui a taxa de sucesso de recolha EECS. O protocolo pode ser usado para obter EECS de embriões em estágio inicial, mas não de embriões em estágio final. Isso limita a possibilidade de pesquisa direta sobre os EECS fase tardia.

A expressão de SOAT1 e lipoproteína lipase, acumulação de lípidos e são características essenciais da YSM 4,5,11, especialmente o EECS. No estudo atual, SOAT1, LPL e perilipin 2 (PLN2) mRNA foram expressos altamente na EECS, sugerindo que o sistema de cultura pode gerar células com o charact fisiológica corretaeristics. A técnica corrente produzida uma grande quantidade de EECS primárias. Quando foi utilizado o procedimento descrito anterior 9, a taxa de sucesso da cultura CEE foi de aproximadamente 60% ​​em placas de cultura celular de 24 poços, enquanto que o protocolo de corrente gerada EECS na taxa de sucesso de quase 100%.

membrana saco vitelino é o tecido principal para absorver as proteínas, lípidos e colesterol a partir de gema, funcionando, assim, a transferência de nutrientes a partir de gema de embriões durante o desenvolvimento. A principal enzima para a formação de éster de colesterol é SOAT1. 11 Porque SOAT1 aumenta drasticamente nos últimos estágios do desenvolvimento embrionário das aves quando maciça esterificação do colesterol ocorre 4, usamos a expressão do mRNA SOAT1 como o gene marcador para avaliar as características do EECS cultivadas. Nós demonstramos que este sistema de cultura CEE primário produzido esperado características fisiológicas. Portanto, o sistema de cultura CEE pode ser uma ferramenta valiosa para estudar embriãotransporte lipídico ic e clarificar o papel dos genes envolvidos na mediação de utilização de nutrientes em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.

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Acknowledgments

O financiamento para o desenvolvimento de protocolo atual é particularmente apoiada por "Aim para o Plano Universidade Top", da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan (concessão ID-104R350144), bem como o Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (ID concessão: a maioria dos 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente o Centro de Biotecnologia da Universidade Nacional de Taiwan para fornecer uma sala de animais e espaço de laboratório para o estudo atual.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by Life technologies 12800-017 10 X 1 L For wash the EECs pellets
D-MEM/F-12 Gibco by Life technologies 12400-024 10 X 1 L As the basal medium in culturing EECs
NBCS Gibco by Life technologies 16010-159 As the supplyment serum in culturing EECs
Pen-Strep Ampho. Solution BI (Biological Industries) 03-033-1B 100 ml For attenuating the possible infection 
Collagenase Type IV Gibco by Life technologies 17104-019 1 g  Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.
24-well plate FALCON® REF-353047 For EECs to attach and extension
50 ml PP centrifuge tubes Corning® CentriStarTM 430829 For transportion of membranes and enzyme digestion
50 ml Conical bottomed Tube with Cap PRO TECH CT-50-PL-TW For transportion of membranes and enzyme digestion
Reciprocal shaking bath DEAGLE SB302 For better enzymatic digestion on membranes

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References

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Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões
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Cite this Article

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).More

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).

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