Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

doi: 10.3791/53624 Published: March 10, 2016

Abstract

Biz gelişim sırasında kuş embriyolar tarafından besin kullanımı aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için bir Endodermal epitel hücre kültürü modeli (AET) kuruldu. Döllenmiş Japon bıldırcın yumurta 5 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edildi ve daha sonra SAC membranları (YSM) EEC kültür sistemi kurmak için toplandı sarısı edildi. Biz YSM embriyonik endoderm katman izole edilir ve 2'ye membran dilimlenmiş - 3 mm parçalar kısmen 24 oyuklu kültür plakaları içinde, tohumlamadan önce kollajenaz ile sindirilir. EECS dokusu içinde çoğalan ve hücre kültür çalışmaları için hazırdır. Bu EECS, örneğin, in vivo olarak YSM tipik özelliklerini, lipid damlaları birikimine, sterol O-asiltransferaz ve lipoprotein lipaz ekspresyonunu olduğu bulundu. Kısmi sindirim tedavisi önemli ölçüde AET kültürünün başarılı oranı arttı. EECS kullanarak, biz SOAT1 sentezlenmesi cAMP d düzenlenir olduğunu göstermiştirependent protein A ile ilgili yol kinaz. Bu birincil Japon bıldırcın EEC kültür sistemi embriyonik lipid ulaşım incelemek ve kuş embriyonik gelişim sırasında YSM besin kullanımını aracılık yer alan genlerin rolü açıklığa kavuşturmak için bir araçtır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kuş embriyo önemli beslenme kaynağı% 33 lipit,% 17 protein oluşan sarısı, ve% 1 kül. 1 embriyo gelişimi sırasında, sarısı kese zarının (YSM) embriyonik karın boşluğu içinde yetişen ve yavaş yavaş sarısı kapsar yüzey. Embriyonik gün 2 başlayarak, lipit metabolizması ve anjiyojenez ile ilişkili gen ekspresyonu kademeli YSM artar ve YSM yavaş tüy benzeri çıkıntılar geliştirir. 8,9 Bu çıkıntılar embriyo gelişimini desteklemek için sarısı besin emilimini artırır. YSM üç germ katmanları, endoderm, mezoderm ve ektoderm içeren bir extraembryonic dokudur. 14 yolk kesesi ektoderm nazikçe sarısı kesesi kapsayacak şekilde vitellin membran ile albümin ve bağlantılar ile karşı karşıyadır. Endodermal epitel hücreleri Kadm bölünebilir yumurta sarısı doğru doğrudan karşı karşıya ve besin kullanım portalları olarak hizmet vermektedir. 6 YSM genişledikçe, Endodermal epitel hücre (EECS) vardırİki grup, bölge vitelline ve alan vaskulosa içine e ve işlevsellik. 7

Konum Vitellin endodermal hücrelerden oluşan ve embriyo uzak olmaktadır; Konum vaskulosa mezodermal hücrelerden oluşan ve kan damarları ve bağ dokuları ile farklılaştırılmış EECS kapsar. embriyonik gün 5 ile, yumurta sarısı tamamen YSM ve ektoderm ve endoderm ile kaplıdır ve vasküler alan hızla büyüdü. YSM embriyonik dolaşım sistemine (sarısı türetilen çok düşük yoğunluklu lipoprotein) ve proteinler. 9, 2 Bu nedenle, lipit mekanizmaları incelemek için, birincil Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültür sistemi tesis yeniden oluşturur ve serbest bırakır lipidler, emer kuş embriyonik gelişim sırasında YSM içinde kullanımı.

Böyle triaçilgliserol, lesitin, fosfolipid ve kolesterol esteri (CE) olarak lipidler kuş embriyolar için birincil enerji kaynaklarıdır. gelişiminin erken aşamalarında, yumurta sarısı lipidler c vardırsadece% 1.3 CE omposed ve kuş embriyonik gelişim 3 orta vadede% 10-15 yükselir, 11. Kolesterol ester kuş embriyo YSM sterol O-asiltransferaz 1 (SOAT1) tarafından kolesterolden sentezlenir. 4

Kolesterol depo formu CE, CE lipoproteinler taşınır ve lipoproteinler dokulara dolaşımı ile taşınmaktadır. 13 Bir hafta ambar önce kuş embriyoların hızlı bir büyüme var. Yaklaşık sarısı kalan lipit içeriğinin% 68, bu aşamada emilir. 10 lipidler bir AET araştırma modeli ile açıklık kazanabilir kullanılmaktadır sarısı hangi mekanizma. Bir tavuk EEC kültürü protokolü bu araştırma hedefe ulaşmak için kurulmuştur. 2, 9 Ancak, gelişmiş AET hücre kültürü prosedürü ile besin kullanımını aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için gerekli doku eksplant düşük başarı oranına gelişimi sırasında kuş embriyolar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not:.. Bu prosedür ve Bauer ve ark, 2013 ve Nakazawa ve arkadaşları, 2011 tarafından geliştirilen 2,9 tavuk modeli Kültür Protokolü bir modifikasyonudur

1. Sağlıklı Embriyonik Gün 5 embriyolar Japon Bıldırcınlarında gelen hazırlayın

  1. Aynı kafeste birlikte 1 erkek ve 3 kadın cinsel olgun Japon bıldırcın yerleştirin. Besleme yem ve su ad libitum verilmiştir. Işığın 14 saat ve karanlığın 10 saat hayvan odasında ışık ayarlayabilirsiniz.
  2. öğleden sonra her gün plastik torbalarda döllenmiş yumurta toplamak ve embriyoların büyüme hızını yavaşlatmak için bir 16 ° C buzdolabında saklayın.
  3. İki haftalık bir süre içinde yumurta yeterli sayıda topladıktan sonra, beş gün boyunca iyi bir havalandırma ile 37 ° C inkübatör döllenmiş yumurta kuluçkaya yatmaktadır.

2. Bazal Orta ve Yıkama Çözümleri hazırlayın

  1. Büyüme ortamı olarak (pH 7.2 a ayarlanmıştır), DMEM / F-12 ortamı kullanın, ve ek% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NBCs) ve% 1 Pen-Strep Ampho ile. Çözelti (PSA, penisilin, 10 5 birim / L streptomisin, 100 mg / l; amfoterisin B, 0.25 mg / L).
  2. depolama için 10x konsantrasyonda fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın; yıkamak için (pH 7.2 ayarlamak, KCI, 2,667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM;; Na 2 HPO 4 -7 2 O, 8.06 mM NaCl, 137,93 mM içeren) ve yolk kesesi membran süre nemlendirin 1x PBS çözümü kullanın yumurta sarısı ve albümin gelen endoderm ayıran.
  3. endoderm pelet yeniden askıya (pH 7.2 a ayarlanmıştır) DMEM ortamı kullanın.

Japon Bıldırcın YSMs Primary EECS 3. Koleksiyonu

  1. 5 gün (adım 1.3) için toplanan yumurta kuluçkaya yatmaktadır. normal embriyonik gelişmeyi teyit etmek için bir yumurta Candler tarafından yumurta inceleyin.
    NOT: embriyonik 5. günde, YSM mezodermin sınır çok net ve 3 embriyonik tabakalar daha az birbirine sıkıca bağlı olan, bu nedenle ob kolaydırtain Endoderm. Sadece YSM koleksiyonları normal kapiller dolaşımı gelişim gösteren yumurta kullanın.
  2. dikkatle taze su ve% 75 etanol kullanarak kabuğu temizleyin. nazikçe, bir makas ile hava hücre konumundan yumurta kabuğu açın dışarı soyun ve 37 ° C 1x PBS ile dolu bir 10 cm kültür çanak forseps ve yerine göre bütün YSM toplamak.
  3. bir makas embriyo, yumurta sarısı ve yumurta beyazı kaldırmak ve nazikçe 1x PBS ile YSM yıkayın üç kez ve 10 cm kültür çanak PBS çözüm YSM yerleştirin kullanma.
  4. YSM gelen ektoderm kaldırmak için forseps ve bir makas kullanın. 2 forseps kullanabilir, bir sıkıca endodermal hücre tabakası tutmak için, ve diğer kılcal mezoderm tutun.
  5. bir mikroskop altında ayrı çekin ve embriyo doğru yönde mezodermin kenarından endoderm ayırın. 37 ° C wat büyüme ortamına, 15 ml bir damlalık ve yer kullanarak 50 ml santrifüj tüplerine açık sarı endoderm toplamaker banyosu tüm doku koleksiyonları tamamlanana kadar.

Kollajenaz Sindirim tarafından Endoderm Dilimleri 4. Sindirim

  1. Taze DMEM, 10 ml tip IV kollajenaz 6.5 birim çözülür.
  2. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 130 x g'de 50 ml tüpler (3.4) santrifüjleyin. orta aspire ve bir pipet kullanarak 6 cm kültür çanak tüm endoderm yerleştirin. Bu kültür kabı 1 ml kolajenaz çözeltisi ekleyin.
  3. Her dilimin büyüklüğüne kadar kavisli bir makasla 2 bıldırcın embriyolardan alınan endoderm dilimleyin yaklaşık 2 ila 3 mm. Bir damlalık kullanarak taze kolajenaz çözeltisi 9 ml ile birlikte bir 50 ml santrifüj tüpüne tüm dilimleri toplar.
  4. 175 rpm'de 37 ° C'de ve çalkalama su banyosunda 30 dakika boyunca kolajenaz ile doku Digest. kollajenaz ile Bu kısmi sindirim eksplant hücre çoğalmasını iyileştirmek için kullanılır.
  5. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj ve yavaşça bir pipet kullanılarak süpernatan fraksiyonu kaldırma. 20 ml DMEM içinde süspansiyon pelet yıkayın ve 3 dakika boyunca 130 x g santrifüj sonra süpernatan fraksiyonu çıkarın.
  6. Yeniden askıya büyüme ortamında (% 10 NBCs ve% 1 PSA DMEM / F12) 12 ml pelet ve 24 oyuklu bir plakaya yavaşça ve eşit (her bir 500 ul hücre çözelti) tohum.
  7. Hücreler doku üzerinden çoğalmaya izin 2 gün boyunca havada% 5, 37 ° C'de CO2 doku eksplantlarında inkübe edin.
  8. Başka bir 2 gün boyunca inkübe hücreleri ve hücre canlılığı tahlil protokolü tarafından hücre canlılığı için karakterize eder. 15
    NOT: Yaşayan hücreler sitoplazmada içinde bir indirgeyici bir ortam sağlamak. Resazurin, aktif terkip maddesi, mavi renkte ve hemen hemen floresan olmayan bir toksik-olmayan, hücre geçirgen bir bileşiktir. hücre kültürlerine eklendiğinde, resazurin mitokondriyal enzimlerin sitosolde resorufine azaltılır. Resorufm kırmızı renkte ve oldukça floresan olduğunu. Canlı hücreler sürekli resazurin Resorufm dönüştürmek, artışlarlahücreleri çevreleyen kültür ortamının genel floresans ve renk asing.
  9. Açıklandığı gibi transkripsiyon ve PCR marker geni mRNA kantitatif gerçek zamanlı ters endoderm epitel hücresi total RNA izolasyonu gerçekleştirin. 16,17
    1. SOAT1 mRNA tespit etmek için ters transkriptaz PCR kullanarak (sens: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisens: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3' PCR ürünü = 168 bp) EEC hücreleri için bir özgün bir işaret olarak. Bir temizlik geni ve iç kontrol olarak β-Aktin mRNA (PCR ürünü = 151 bp: ';; 5'-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 anlamsız' 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 duygusu) kullanın.
    2. RT-qPCR ürün boyutunu tespit etmek için jel elektroforezi kullanın. % 1 agaroz jeli hazırlayın ve 2 ul yükleme boyası 10 ul qPCR karıştırın. Yük 10 ul de% 1 agaroz jeli içinde her birine Karışım 30 dakika süre ile 100V ile jel üzerinde çalıştırıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

tutarlı ve yararlı bir hücre modeli oluşturulması amaca ulaşmak için, biz uzanan ve çoğalma hızı ve avyan EECS performansını stabilize etmek gerekir. Bu kısmen, kolajenaz ya da kollajenaz artı dispase 0.6 U gibi proteolitik enzimler ile sindirilmiş endoderm ile bir enzimi sindirimi ile endoderm doğrudan inkübasyon karşılaştırıldı. Dispase polar olmayan amino asit kalıntılarının N-terminal peptid bağlarını hidrolize bir amino-endopeptidazdır. Proteaz sindirimi tedavileri Resim sindirim (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında, hücre çoğalması artmıştır ise, hücre büyümesi beş gün inkübe edildikten (Şekil 2) sonra iki enzim muameleleri arasında belirgin bir farklılık göstermemiştir. Bununla birlikte, kolajenaz işleme daha iyi bir büyüme eğrisi sağladı ve EECS 6-9 gün (Şekil 2) için istikrarlı bir şekilde prolifere gösterdi. Bu durumda, kısmen kolajenaz sindirimden EECS büyümesini geliştirilmişEx vivo eksplantlar ve yeterli ve fonksiyonel EEC elde edilmesi için tavsiye edilir.

4 gün inkübasyondan sonra, EECS kültür hücrelerinin doğru fizyolojik özelliklerini öne formalin fiksasyonu ve Petrol-Kırmızı O boyama (Şekil 3) sonra tespit bir adiposit gibi bir görünüm vardı.

(IBMX, cAMP bozulmasını azaltmak için) siklik adenosin monofosfat (cAMP), bir transkripsiyon düzenleyici madde, cAMP fosfodiesteraz inhibitörü olan 3-izobutil-1-metilksantin varsayıldı ve adenil siklaz aktivatörü forskolin (cAMP sentezini artırmak için) hem 24 saat tedavi (Şekil 4) sonra SOAT1 mRNA ekspresyonunu uyarmıştır. Yüzey proteini markör o Bu tedaviler de SREBP2, bir kolesterol sentez düzenleyici bir transkripsiyon faktörünün ifadesi artmış, forskolin perilipin-2 (PLIN2) ekspresyonunu artırmıştırf lipid damlacıkları (Şekil 5). Gerçek zamanlı PCR ile ölçülmüştür lipojenik genler için AT mRNA bulunmaktadır (Şekil 5) adipositlerce benzerdir.

Şekil 1
Şekil 1. Endodermal epitel hücrelerindeki Kısmi kollajenaz sindirimi Etkisi. Doku eksplantlarında hücrelerin doku üzerinden çoğalmaya izin 2 gün inkübe edildi. Biz gözlenen ve başarılı yetiştirilen EECS sayısını hesapladı. Sayılar, kısmen kolajenaz ile sindirilir Resim sindirim ve hücreler ile hücre için hesaplandı; hem 24-çukurlu tablalarda büyütülmüştür. Y-ekseni 24 oyuklu hücre kültürü plakasının başarıyla çoğaldı EECS iyi bir sayıdır. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu. Analizler ikili t-testi ile belirlenmiştir. P <0.0001. TıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

şekil 2
Kısmi Enzim Sindirim sonra EECS Hücre Büyüme Performansı 2. Şekil. proliferasyon hızı hücre canlılığı deneyi ile tespit edilmiştir. Deney ihtiva resazurin, zayıf bir floresans ve resazurin bir mavi bileşim hücreleri girdikten sonra resorufine azaltılır. Canlı hücreler sürekli hücreleri çevreleyen ortamın genel floresan ve renk artan Resorufm için resazurin dönüştürmek. Canlı hücreler, 600 nm'de normalizasyonlu 570 nm'de absorbans ile tespit edildi. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu. Analiz Bonferroni son test (; kolajenaz + dispaz grubu N = 11 kolajenaz grubu n = 10) ile birlikte iki yönlü ANOVA ile belirlenmiştir. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Lütfen cliBu rakamın büyük halini görmek için buraya ck.

Şekil 3,
Şekil 3. Kültür EECS Morfoloji. 4 gün inkübasyondan sonra, EECS formalin fiksasyonu ve Petrol-Kırmızı O boyamadan sonra tespit bir adiposit gibi bir görünüm vardı. Soldan sağa: AET aydınlık alanda 100X büyütme ile, 200X büyütme ile aydınlık alanda ve 200X büyütme Petrol-kırmızı O ve hematoksilen ile boyandıktan sonra. En soldaki rakam soldaki karanlık nokta kısmen sindirilmiş endoderm (membran) 'dir. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. SOAT1 TranscAMP aktivatörleri ile işlemden EECS arasında cription. Bu 24 saat süre ile 5. günde IBMX konsantrasyonlarını ya da forskolin artan EECS işlemden geçirildi. Bu muamele edilmiş hücrelerden mRNA özütlendi ve ters transkripsiyon PCR ile cDNA'ya RNA'nın dönüştürülür. Biz gerçek zamanlı kantitatif PCR ile transkripsiyon seviyeleri analiz ettik. β-aktin ev bakıcısı geni olarak kullanılmıştır. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu. Analizler Tukey post-testi ile tek yönlü ANOVA ile (n = 6) (* p≤ 0.05, ** p≤ 0.01). IBMX, hücre içi cAMP yükseltir PKA aktive TNF-alfa ve lökotrien sentezini inhibe iltihap ve doğal bağışıklığı azaltan ve seçici olmayan bir adenozin reseptör antagonisti olan bir rekabetçi seçici olmayan fosfodiesteraz inhibitörüdür. Forskolin, yaygın cAMP seviyelerini yükseltmek için kullanılan ökaryotik adenilat siklaz bir yerde aktivatörü olduğunu. Bu figu büyük halini görmek için tıklayınızyeniden.

Şekil 5,
Şekil 5 beş gün boyunca EEC'nin yetiştirilmiş mRNA ekspresyonu, sonra. 24 saat cAMP aktivatörleri ile işlemden Şekil 4'te cDNA en kantitatif PCR, gerçek-zaman gen ekspresyon düzeyleri analiz etmek için kullanıldı. β-aktin temizlik gen olarak kullanılan ve iç kontrol olarak görev almıştı. Veri Ortalama ± SEM olarak sunuldu. Analizler kontrol tedavileri karşılaştırmak için Tukey post-testi (n≤ 6) ile tek yönlü ANOVA ile idi. SREBP2, sterol düzenleyici elementi bağlayan protein 2; LPL, lipoprotein lipaz; PLIN2, perilipin-2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Önceki kültürü sistemi, sadece sınırlı bir başarı olduğundan, daha iyi bir kültür sistemi gereklidir. Japon bıldırcın YSM endoderm gibi ex-vivo eksplant daha iyi bir büyüme performansı elde etmek için hücre-hücre kavşakları gevşetmek için kollajenaz gibi proteolitik enzimlerle tedavi gerektirir. Verilerimiz kısmi sindirimi tedavi hücre sayısı 2 gün sonra (Şekil 1) için tohumlama sonra sindirilmemiş doku kültüründen daha fazla olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, kısmi proteolitik sindirim YSM hücre verimini artırmak için kritik bir adımdır.

Geçerli kültür protokolü kritik değişiklik kısmi proteolitik sindirim olduğunu. Bu tedavi büyük hücre verimi canlı EECS elde başarı oranını artırmıştır. aşırı sindirim dokusu hücreleri ayıracak ve hücreler, plaka takmak çünkü altında sindirim az hücre verimi ile sonuçlanmıştır oysa sindirim süresi çok kritikDoku eksplantlar. Yukarıda tarif edilen koşullar kullanılarak 30 ila 40 dakika sindirim uygun olduğu bulunmuştur.

Geçerli protokol EECS elde etmek için yüksek teknik eğitim gerektirir. EECS toplama zamanı noktası, örneğin, biz sadece embriyonik 5. günde EECS toplamak sınırlıdır nedeni kuş embriyoları büyüdükçe, yumurta sarısı kese zarında katmanları arasındaki bağlantılar daha karmaşıktır ve toplama başarılı oranını azaltır olduğunu EECS. Protokol erken evre embriyo EECS fakat geç aşama embriyolar elde etmek için kullanılabilir. Geç evre EECS doğrudan araştırma olanağını sınırlandırmaktadır.

SOAT1 ve lipoprotein lipaz ve lipid birikimin sentezleme YSM 4,5,11 özellikle EECS temel özelliğidir. Bu çalışmada, SOAT1, LPL ve 2 (PLN2) mRNA perilipin doğru fizyolojik charact hücreleri oluşturabilir kültür sistemi gösteren, EECS son derece olarak ifade edilmiştireristics. Mevcut teknik, primer EECS büyük miktarda üretti. Önceki tarif edilen prosedür 9 kullanıldığında, EEC kültür başarı oranı 24-çukurlu, mevcut protokolü EECS oluşturulan ise neredeyse% 100'lük bir başarı oranı hücre kültür plakaları içinde, yaklaşık% 60 idi.

Sarısı kese zarının, böylece gelişimi sırasında embriyolar yumurta sarısı besin aktarmak için saptanmıştır, proteinler, lipidler, ve yumurta sarısı kolesterol absorbe temel bir dokudur. Kolesterol ester oluşumu için temel bir enzimdir SOAT1. 11 büyük kolesterol esterifikasyon 4 oluştuğunda SOAT1 avian embriyonik gelişim geç evrelerinde önemli ölçüde artar, Kültür haline EECS özelliklerini değerlendirmek için işaretleyici gen olarak SOAT1 mRNA ekspresyonunu kullanılır. Biz bu birincil AET kültür sistemi fizyolojik özelliklerini beklenen üretilen olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, AET kültür sistemi embryo incelemek için değerli bir araç olabiliric lipit ulaşım kuş embriyonik gelişim sırasında YSM besin kullanımını aracılık yer alan genlerin rolü açıklığa kavuşturmak ve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Mevcut protokolün geliştirilmesi için finansman özellikle Ulusal Tayvan Üniversitesi, Tayvan (hibe ID-104R350144) yanı sıra, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (hibe kimliği "Top Üniversitesi Planı Amaç" tarafından desteklenmektedir: EN 104 -2313-B-002-039-My3). Biz özellikle mevcut çalışma için bir hayvan odası ve laboratuar alanı sağlamak için Ulusal Tayvan Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by Life technologies 12800-017 10 X 1 L For wash the EECs pellets
D-MEM/F-12 Gibco by Life technologies 12400-024 10 X 1 L As the basal medium in culturing EECs
NBCS Gibco by Life technologies 16010-159 As the supplyment serum in culturing EECs
Pen-Strep Ampho. Solution BI (Biological Industries) 03-033-1B 100 ml For attenuating the possible infection 
Collagenase Type IV Gibco by Life technologies 17104-019 1 g  Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.
24-well plate FALCON® REF-353047 For EECs to attach and extension
50 ml PP centrifuge tubes Corning® CentriStarTM 430829 For transportion of membranes and enzyme digestion
50 ml Conical bottomed Tube with Cap PRO TECH CT-50-PL-TW For transportion of membranes and enzyme digestion
Reciprocal shaking bath DEAGLE SB302 For better enzymatic digestion on membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92, (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288, (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74, (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79, (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81, (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35, (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155, (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160, (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240, (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29, (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28, (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91, (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129, (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46, (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014, (1), 310981 (2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).More

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter