La completa y actualizada "rotífero policultivo Método" para la educación de primer pez cebra Alimentación
Summary
Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This “polyculture” strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an “on-demand”, nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) es un animal de laboratorio por excelencia utilizado en un número cada vez mayor de las disciplinas científicas, incluyendo pero no limitado a la genética del desarrollo, la toxicología, la conducta, la acuicultura, biología regenerativa, y el modelado de muchos trastornos humanos 1 – 5. Aunque la especie es relativamente fácil de mantener en el laboratorio, hay una serie de retos de gestión asociados con su cultura 6. El más destacado de ellos es la cría de larvas, particularmente cuando primero los peces comienzan a alimentarse con posterioridad a la inflación de la vejiga de gas 7. En condiciones normales, controlados, este evento evolutivo ocurre en ~ 5 días después de la fertilización (dpf), con los siguientes 3 - 5 días de crecimiento es particularmente crítica 7. La dificultad técnica central durante esta etapa es satisfacer adecuadamente las demandas nutricionales de las primeras larvas de alimentación – artículos de alimentación deben ser de tamaño adecuado, Digestible, atractivo, y está disponible de forma casi continua, sin crear residuos excesivos en los tanques de cultivo. Históricamente esto se ha logrado típicamente mediante la entrega de numerosas pequeñas cantidades de alimento a los peces en los tanques, junto con la rutina de cambio de agua de 8,9. Si bien estos métodos son en cierto grado de éxito, son ineficientes, requieren insumos de trabajo elevadas, y vuelven única variable y tarifas limitadas de crecimiento y supervivencia 10.
En la naturaleza, las larvas de pez cebra, presumiblemente, se alimentan de abundantes pequeño zooplancton presente en la columna de agua 11. Por esta razón, los protocolos de larvicultura que incorporan transmisiones en vivo tales como Paramecium, rotíferos, Artemia y son típicamente más eficiente 7. En 2010, Best y co-autores demostraron que era posible cultivar larvas de pez cebra en agua salobre estática junto con rotíferos de agua salada para los primeros 5 días de alimentación exógena 12. Este enfoque, que aprovechares la alta productividad natural de los cultivos de rotíferos para proporcionar amplia, presa de alto valor nutritivo sin contaminar el agua, produce altas tasas de crecimiento de las larvas y la supervivencia con la entrada de baja laboral 12,13. En los últimos años, un número creciente de laboratorios de todo el mundo han adoptado variaciones de este protocolo, y muchos ahora están cultivando rotíferos de forma continua para apoyar los sistemas de vivero 14.
En los últimos años, los métodos para ambos rotíferos / policultivo pez cebra y la producción de rotíferos se han refinado y mejorado para ser más estandarizada y fácilmente escalable. Este artículo ofrece paso a paso las instrucciones para 1) la producción de rotíferos continuo y robusto y 2) el establecimiento del sistema de policultivo de rotíferos / pez cebra utilizado para apoyar un crecimiento robusto de los peces durante los primeros 5 días de alimentación exógena.
Protocol
Representative Results
Discussion
La implementación exitosa del método de policultivo de rotíferos para la alimentación temprana larvas de pez cebra requiere protocolos efectivos para dos tareas: la creación y mantenimiento de un sistema de cultivo de rotíferos continua para alimentar a los peces y el cultivo de primera alimentación de larvas de pez cebra junto con rotíferos en el mismo tanque.
La configuración de un sistema de producción de rotíferos agua salada continua para los laboratorios de pez cebra primero…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El cuidado y la utilización de peces generados para obtener resultados representativos descritos en este protocolo se realizó en plena conformidad con las directrices establecidas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Hospital Infantil de Boston, el protocolo # 14-05-2673R.
Materials
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 Liter Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
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