Introduction
El pez cebra (Danio rerio) es un animal de laboratorio por excelencia utilizado en un número cada vez mayor de las disciplinas científicas, incluyendo pero no limitado a la genética del desarrollo, la toxicología, la conducta, la acuicultura, biología regenerativa, y el modelado de muchos trastornos humanos 1 - 5. Aunque la especie es relativamente fácil de mantener en el laboratorio, hay una serie de retos de gestión asociados con su cultura 6. El más destacado de ellos es la cría de larvas, particularmente cuando primero los peces comienzan a alimentarse con posterioridad a la inflación de la vejiga de gas 7. En condiciones normales, controlados, este evento evolutivo ocurre en ~ 5 días después de la fertilización (dpf), con los siguientes 3 - 5 días de crecimiento es particularmente crítica 7. La dificultad técnica central durante esta etapa es satisfacer adecuadamente las demandas nutricionales de las primeras larvas de alimentación - artículos de alimentación deben ser de tamaño adecuado, Digestible, atractivo, y está disponible de forma casi continua, sin crear residuos excesivos en los tanques de cultivo. Históricamente esto se ha logrado típicamente mediante la entrega de numerosas pequeñas cantidades de alimento a los peces en los tanques, junto con la rutina de cambio de agua de 8,9. Si bien estos métodos son en cierto grado de éxito, son ineficientes, requieren insumos de trabajo elevadas, y vuelven única variable y tarifas limitadas de crecimiento y supervivencia 10.
En la naturaleza, las larvas de pez cebra, presumiblemente, se alimentan de abundantes pequeño zooplancton presente en la columna de agua 11. Por esta razón, los protocolos de larvicultura que incorporan transmisiones en vivo tales como Paramecium, rotíferos, Artemia y son típicamente más eficiente 7. En 2010, Best y co-autores demostraron que era posible cultivar larvas de pez cebra en agua salobre estática junto con rotíferos de agua salada para los primeros 5 días de alimentación exógena 12. Este enfoque, que aprovechares la alta productividad natural de los cultivos de rotíferos para proporcionar amplia, presa de alto valor nutritivo sin contaminar el agua, produce altas tasas de crecimiento de las larvas y la supervivencia con la entrada de baja laboral 12,13. En los últimos años, un número creciente de laboratorios de todo el mundo han adoptado variaciones de este protocolo, y muchos ahora están cultivando rotíferos de forma continua para apoyar los sistemas de vivero 14.
En los últimos años, los métodos para ambos rotíferos / policultivo pez cebra y la producción de rotíferos se han refinado y mejorado para ser más estandarizada y fácilmente escalable. Este artículo ofrece paso a paso las instrucciones para 1) la producción de rotíferos continuo y robusto y 2) el establecimiento del sistema de policultivo de rotíferos / pez cebra utilizado para apoyar un crecimiento robusto de los peces durante los primeros 5 días de alimentación exógena.
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Protocol
1. rotífero Cultura
- Componentes básicos de un sistema de cultivo utilizando un recipiente de 100 L de Cultura
- Reúna todos los componentes para la configuración de cultivo de rotíferos. La configuración de cultivo de rotíferos consiste en un recipiente de cultivo (CV) para crecer los rotíferos; un recipiente similar a mantener rotíferos feedout (recipiente de cultivo feedout, FCV); un frasco de fondo redondo de eclosión (RSS Embalse, FR) para el almacenamiento de la mezcla de alimentación algas (AFM); un suministro de aire (AS) para airear el CV, FCV y el FR; una bomba peristáltica con un temporizador de medición (PMT) para controlar el suministro de alimento de algas en el CV y FCV; y un filtro de partículas hilo (FPF) que se encuentra dentro de la CV.
NOTA: Una lista completa de suministros y componentes se proporciona en la Lista de materiales.
- Reúna todos los componentes para la configuración de cultivo de rotíferos. La configuración de cultivo de rotíferos consiste en un recipiente de cultivo (CV) para crecer los rotíferos; un recipiente similar a mantener rotíferos feedout (recipiente de cultivo feedout, FCV); un frasco de fondo redondo de eclosión (RSS Embalse, FR) para el almacenamiento de la mezcla de alimentación algas (AFM); un suministro de aire (AS) para airear el CV, FCV y el FR; una bomba peristáltica con un temporizador de medición (PMT) para controlar el suministro de alimento de algas en el CV y FCV; y un filtro de partículas hilo (FPF) que se encuentra dentro de la CV.
- Configuración
- Eleve la CV y FCV en un soporte o mesa para que las culturas pueden ser fácilmente recolectados a través de un accesorio de drenaje en un cont colecciónAiner (Figura 1). Use tubería de suministro de aire flexible para conectar los AS a una longitud de tubería rígida en cada recipiente de cultivo. Asegúrese de que el tubo es lo suficientemente largo para suministrar aire a la parte inferior de la CV o FCV.
- Utilice una línea de aire de pequeña capacidad para conectar los AS a una longitud de tubo rígido que se extiende a la parte inferior de la FR que contiene el AFM. Instale una válvula en cada línea de aire para regular el flujo de aire. Conectar el FR a la PMT con un tubo de entrega de alimentación, y ejecutar el tubo de la PMT en un agujero perforado en el lado de la CV / FCV, cerca de la parte superior. Figura 1.
- Puesta en marcha
- Llenar el recipiente de cultivo a 90% del volumen disponible con agua de ósmosis inversa (RO). Si RO no está disponible, utilice agua limpia, sin cloro municipal; Sin embargo, una evaluación de riesgos de bioseguridad se debe realizar para asegurar que no hay organismos potencialmente patógenos presentes en el agua de la fuente. NOTA: Este tipo de análisis se puede realizarpor cualquier laboratorio de análisis de agua calificado.
- Dosificar el agua recipiente de cultivo con sal de acuario para alcanzar una salinidad de 15 g / L. Ajuste el flujo de aire en el recipiente de modo que mantiene un "punto de ebullición" y, a continuación añadir lentamente la cantidad medida de sal al recipiente de cultivo hasta que esté completamente disuelta por la aireación. Continuar airear el agua durante> 1 hora para asegurarse de que está totalmente oxigenada.
- Hacer la mezcla de alimentación algas. Para 3 L de limpio, sin cloro (0 ppm) de agua dulce 100 g de NaHCO3 y 100 g de neutralizador de amoniaco (hydroxymethylsulfonate de sodio). Este último reactivo ofrece el beneficio adicional de neutralizar el cloro residual a partir de residuos de agua del grifo o de blanqueo de desinfección de los equipos de la cultura. Es fundamental asegurarse de que estos compuestos se disuelven completamente. A continuación, añadir 1 litro de concentrado de algas (biomasa en peso seco ~ 15%). Añadir la mezcla de alimentación a la FR y almacenar a 4 ° C.
- Añadir un cultivo iniciador de 5 a 10.000.000
- Encienda el PMT y comenzar a bombear el alimento de algas en el recipiente de cultivo de rotíferos. Mediante la función de temporizador de la PMT, ajuste la velocidad de suministro de mezcla de alimentación algas para que ~ 1,6 ml de mezcla de alimentación algas se entrega por millón de rotíferos en la cultura, por día. Distribuir las comidas en porciones pequeñas a intervalos regulares en el transcurso de un período de 24 h; las más frecuentes las comidas, mejor.
- Calibre el caudal de la bomba girando manualmente en el PMT durante un período determinado (por ejemplo, 1 min) y recoger las algas que bombea durante este intervalo en un cilindro o vaso graduado. Por ejemplo, si las dosis PMT 5 ml de algas en 1 min, a continuación, la tasa de dosis sería5 ml algas / min.
- Calcular la tasa de alimentación diaria requerida de multiplicar el número de rotíferos presentes, en millones, en 1,6 ml. Por ejemplo, un cultivo de rotíferos con un tamaño de la población de 100 millones de rotíferos requeriría ~ 160 ml de alimento por día (100 x 1,6 ml).
- Establezca la PMT para dosificar el requisito de alimentación total diaria a intervalos regulares durante un período de 24 horas. Por ejemplo, la entrega de una cantidad de alimentación total diaria de 160 ml se podría entregar en porciones una vez cada 3 horas durante un período de 24 horas utilizando un conjunto PMT con una tasa de bomba de dosificación de 5 ml / min durante 4 min, 8 veces al día (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 comidas = 160 ml).
- Deje que la cultura crezca hasta que se genera la población requerida, por lo general de 48 a 72 horas, antes de la cosecha. A las 24 h después de la puesta en marcha, agregue los filtros de partículas de seda en el recipiente de la cultura y comenzar el mantenimiento normal.
- Mantenimiento
NOTA: La cultura opera sobre una base continua y requiere routinmantenimiento e que, idealmente, debe realizarse al mismo tiempo cada día, en la siguiente secuencia.- Llenar el FCV a 90% del volumen disponible con limpio, sin cloro agua dulce, dosificado con 10 g sales de acuario / L. Asegúrese de que el agua se mezcla bien, y que toda la sal se haya disuelto completamente. Ajuste el flujo de aire en el recipiente de modo que mantiene un "punto de ebullición". Mida la salinidad con un refractómetro y asegúrese de que la salinidad es de 10 g / L. Es fundamental para cumplir con este objetivo y que no exceda de la misma.
- Muestra los rotíferos en la CV: Asegúrese de que la cultura es bien mezclada, entonces recoger 3 muestras de un 2-3 ml cada uno usando una pipeta de transferencia o autopipettor, de diferentes partes de la cultura. Combinar estas muestras en un tubo o vial de tamaño conveniente (por ejemplo, 10 ml).
- Transferencia de 1 - 2 ml de la muestra combinada en una placa de Petri de modo que pueda ser visualizado bajo un microscopio de disección. Compruebe la calidad de la cultura (natación comportamiento delrotíferos, la presencia de huevos separados, protozoos contaminante).
- Inmovilizar el rotíferos en la muestra restante combinado mediante la adición de 100 l de solución de yodo Lugols 50% a la muestra. En cuestión de segundos después de la adición de los Lugols, observar los rotíferos para detener la natación. Ahora, contar fácilmente los rotíferos.
NOTA: Etanol, lejía diluida, o vinagre se pueden utilizar en lugar de Lugols. Vinagre (2 gotas / 10 ml) tiene la ventaja de ser no peligrosos, no perder fuerza en el almacenamiento como soluciones de cloro y yodo puede y no hacer el contrato de rotíferos, por lo que la corona de cilios y el "pie" siendo ampliado y la animales parezcan más naturales. - Asegúrese de que la muestra esté bien mezclada (rotíferos inmovilizados se asentarán rápidamente), a continuación, tomar rápidamente un ml submuestra ~ 2 en una pipeta de plástico y prescindir de 1 ml en una diapositiva de contar Sedgewick-Rafter (20 x 50 cuadrados de 1 mm) (Figura 2 ). Usando una disección o compuesto microscopio, contar los rotíferos intactas y la total número de huevos unidos a estos rotíferos (Figura 2). Cuentan tanto de la zona de deslizamiento según sea necesario para contar ~ 100 rotíferos. Calcular el número de rotíferos por ml, y registrar esto en una hoja de cálculo o libro de registro.
- Cosecha ~ 30% del volumen de los rotíferos en la CV: Retire el suministro de aire y el filtro de hilo, abra lentamente la válvula en la parte inferior de su CV y permitir que el agua fluya en un colector de plancton con una pantalla de malla de 53 micras. Recoger el agua que fluye fuera de la parte inferior del colector después de la filtración en un cubo o desagüe. Use un suave para flujo moderado para evitar daños en los rotíferos. No permita que los rotíferos se sequen en la pantalla.
- Por razones de coherencia, es aconsejable establecer el FCV con un número estándar de rotíferos cada día. Por lo tanto, el volumen basa en la densidad de rotíferos CV y la cosecha conocida, ajustar el volumen total FCV para alcanzar una densidad final coherente (por ejemplo., 1.500 rotíferos / ml). Agregue el roti cosechadofers al FCV: transferir suavemente los rotíferos de la pantalla de la colección utilizando una botella de lavado llena con agua salada limpia (10-15 g / L). Invertir la pantalla sobre la FCV y lavar los rotíferos en el FCV con un chorro suave de agua salada. Inicie el PMT para entregar alimentación (~ 1,57 ml por millón de rotíferos por día) a la FCV.
- Frote todo el interior de su CV con un cepillo de nylon suave y limpio o estropajo.
- Hacer una nueva mezcla de 15 g de agua / L por adición de la cantidad apropiada de sal a una cantidad medida de agua RO limpia en un cubo de 5 galones para reemplazar el volumen de agua perdido de la cosecha. Agregue la sal al agua en el cubo y agitar vigorosamente hasta que se disuelva por completo, y luego añadir a la CV.
- El uso de un aerosol de alta presión en un fregadero, enjuague el filtro de hilo hasta que esté libre de escombros, y luego devolverlo a la CV.
- Ajuste velocidades de alimentación de algas entregado a la CV cambiando la duración de cada evento de dosificación, de acuerdo con el recuento diario de rotíferos / ml.Utilice los cálculos previstos en el paso 1.3.8, anteriormente para determinar la cantidad apropiada de alimentación que se entregarán.
- Aproximadamente 24 horas después, repetir el proceso. Comience por la cosecha de los rotíferos que quedan en la FCV (que no se necesita para el día anterior) de la misma manera como se describió anteriormente (pasos 1.4.2 - 1.4.10). Concéntrese en 2 litros de agua sin cloro fresca y limpia (5 g de sal / L). Estos pueden ser almacenados a 4 ° C como una alimentación de reserva, o se utiliza para alimentar a etapas posteriores de peces, más allá de lo que se describe en este protocolo.
NOTA: Este protocolo permite hasta 2 - 3 días de mantenimiento de cultivo reducida (con alimentación automática normal), debido a que los rotíferos en la CV pueden tolerar omisión de cosechas sin consecuencias graves.
2. El policultivo
- Preparar
- Recoger embriones de pez cebra de un evento de desove mediante el vertido de embriones generados a través de un colador de té y luego enjuagar suavemente con fis estérilesh de agua (o cualquier otra fuente no contaminada de la solución apropiadamente acondicionado; por ejemplo, medio de embrión, E3, etc.) a partir de una botella de lavado en placas de Petri.
- Incubar los embriones a 25 - 28 ° C en placas de Petri a una densidad de 40 - 50 embriones por placa durante 5 días.
- Comienza la fase de policultivo en el día 5 después de la fertilización, o cuando más del 90% de las larvas eclosionadas están nadando activamente en la columna de agua.
- Inoculación
- Añadir 500 ml de cultivo de rotíferos directamente desde el FCV a un tanque de vivero 3,5 L; inclusión del agua de cultivo de rotíferos proporciona alimento de algas que mantiene el contenido nutricional de los rotíferos durante policultivo.
- Vierta suavemente las larvas de una placa de Petri en el tanque de vivero. Asegúrese de que no larvas permanecen en el plato.
- Añadir 500 ml de agua peces acondicionado limpia de un sistema de recirculación o fuente de agua dedicado al tanque para llegar a un volumen final de 1 L y una s final dealinity de 5 g / L.
NOTA: Esta salinidad es crítico porque el pez cebra supervivencia larvas se verá afectada negativamente si la salinidad es> 7 g / L y la supervivencia de rotíferos se verán afectados negativamente si la salinidad <2 g / l.
- Fase de policultivo
NOTA: La fase de policultivo debe durar hasta 4 días después de la inoculación (un total de 5 días, que corresponde al día 5-9 después de la fertilización).- Observe el depósito de policultivo al menos una vez por día durante este período para garantizar que los rotíferos y los peces están presentes y en crecimiento. Asegúrese de que los rotíferos son visibles a lo largo de la columna de agua. Asegúrese de que los los Fishs también son visibles dentro de la columna de agua, nadando entre los rotíferos.
- Iniciar el flujo de agua normal a través del tanque. Coloque una pantalla o deflector sobre el puerto de drenaje para garantizar que las larvas no son expulsadas del tanque.
NOTA: Al final de esta fase, los peces serán lo suficientemente grande como para consumir presas más grandes como Artemiaartículos de un feed nauplios o procesados en el rango de tamaño de 75 a 125 micras.
NOTA: La dinámica de población de rotíferos dentro de un tanque de policultivo representante se midieron mediante muestreo / rotíferos contando desde el tanque de la misma manera como se describe en los pasos 1.4.2 - 1.4.5. Esto se hizo una vez por día desde el comienzo de la fase de policultivo hasta que se completó.
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Representative Results
El sistema de cultivo de rotíferos continuo descrito aquí es dinámica, y es normal que los números de rotíferos que fluctúan en una pequeña parte con el tiempo si hay variaciones en las tasas de alimentación y cosecha diarias. La población de los rotíferos en uno de los cultivos activos en las instalaciones de acuicultura en el Hospital de Niños de Boston, mantiene en la forma descrita anteriormente, fue monitoreado por 30 días (Figura 3). La densidad de cultivo media durante este período fue de 932 rotíferos / ml, con un máximo de 1.330 rotíferos / ml y un mínimo de 510 rotíferos / ml. Esto representa el rendimiento típico de un cultivo de rotíferos mantenido de acuerdo con este protocolo.
La dinámica de la población de rotíferos en un tanque de policultivo con el pez cebra se muestran en la Figura 4. Un tanque de peces de 3,5 L se inoculó con 500 ml de cultivo de rotíferos de la FCV, 500 ml de f esterilizadaagua ish, y 40 de 5 días de edad de tipo salvaje (cepa Tübingen) larvas, para demostrar cómo rotíferos y pez cebra realizan en un tanque de policultivo típico. La población de rotíferos en el tanque policultivo alcanzó su punto máximo en el segundo día con una densidad de 747 rotíferos / ml (Figura 4). La densidad de los rotíferos en el tanque policultivo disminuyó durante el período policultivo 5 días a un mínimo de 481 rotíferos / ml en el día 5. Sin embargo, la densidad media de rotíferos lo largo de todo el período fue de 589.4 rotíferos / ml, y el valor mínimo de 481 rotíferos / ml es ~ 10 veces la de la densidad de rotíferos al final del período de policultivo en el trabajo publicado previamente 12.
El crecimiento de pez cebra durante el período de cinco días se muestra en la Figura 5. El pescado mostró un crecimiento constante cada día, a partir de una longitud total media de 3,904 mm ± 0,063 SEM cuando se añadieron al tanque de policultivo a una longitud total media de 5.423 ± 0.063 SEM enla última jornada de la fase de policultivo. La supervivencia fue del 95% (38/40).
Parámetros de calidad de agua se midieron diariamente en el tanque de policultivo representante, y se muestran en la Tabla 1. Los valores de estos parámetros son similares a los trabajos publicados anteriormente 12, y representan las condiciones propicias para el crecimiento y la supervivencia tanto de los rotíferos y los peces durante el período de 5 días del policultivo.
| Día | Día | Salinidad | BRONCEARSE | NO 2 | NO 3 | pH | Alcalinidad | Dureza | La temperatura |
| (Real) | (después de la fertilización) | g / L | mg / L | mg / L | mg / L | mg / L (CaCO 3) | mg / L (CaCO 3) | ° centígrados </ td> | |
| lunes | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| martes | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| miércoles | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| jueves | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| viernes | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
Tabla 1. Parámetros de Calidad del Agua ina Representante pez cebra Tanque policultivo.
Figura 1. Configuración rotífero Cultura Leyenda:. Cultura de buques (CV), Feedout Cultura de buques (FCV), Air Supply (AS), Floss Filtro de partículas (FPF), Algas Alimentación Mezcla (AFM) Apacienta Embalse (FR), Medición programable Timer (PMT). Las líneas continuas representan la entrega de alimentación de las algas. Las líneas discontinuas representan de suministro de aire. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Llenado de una diapositiva Contando Sedgewick-Rafter. Haga clic aquí para ver unaversión más grande de esta cifra.
. Figura 3. rotíferos dinámica de la población en la cultura durante un período de 30 días Leyenda: El número de rotíferos contados (hembras + huevos) por ml es en el eje x. El número de días en la cultura está en el eje y. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. rotíferos dinámica de la población durante un policultivo 5 días Leyenda:. El número de rotíferos contados (hembras + huevos) por ml es en el eje x. El número de días en policultivo está en el eje y. Por favor haga clic aquí para VIew una versión más grande de esta figura.
. Figura 5. Crecimiento de pez cebra durante un policultivo 5 días Leyenda: Los valores son de longitud media total en mm; barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La implementación exitosa del método de policultivo de rotíferos para la alimentación temprana larvas de pez cebra requiere protocolos efectivos para dos tareas: la creación y mantenimiento de un sistema de cultivo de rotíferos continua para alimentar a los peces y el cultivo de primera alimentación de larvas de pez cebra junto con rotíferos en el mismo tanque.
La configuración de un sistema de producción de rotíferos agua salada continua para los laboratorios de pez cebra primero descritos por Lawrence y coautores 14 ha sido modificado y mejorado en un número de maneras de hacer que sea tanto más robusto y de aplicación universal. El nuevo protocolo incorpora mejoras tanto en el equipo y la metodología.
El sistema de almacenamiento de la mezcla de alimentación algas emplea ahora la eclosión frascos utilizados en los sistemas de producción de bagre 15. Almacenamiento de la alimentación en estos frascos de fondo redondo facilita la mezcla a fondo de la alimentación de algas de modo que no se aglutinan o estratificar y conducir a obstruirging de conductos de suministro, un problema que con frecuencia plagado el protocolo original. Del mismo modo, el uso de una bomba / medición all-in-one temporizador programable reduce el número total de los componentes, y simplifica la entrega dosificada de alimentación a los rotíferos. También permite la dosificación de alimentación a los rotíferos sobre una base horaria durante el período de 24-hr, que es preferible a un número menor de alimentación más grandes porque la alimentación es asimilada de forma más eficiente.
Un método para el recuento de rotíferos que permite el ajuste fino de la entrega de alimentación para el cultivo de rotíferos se ha incluido en este protocolo. La alimentación de los rotíferos con base en una evaluación exacta del tiempo, real de su tamaño de la población asegura, la producción constante de alto nivel. Un Buque Feedout Cultura secundaria también se ha añadido al protocolo. Un sistema de cultivo continuo puede producir un exceso diaria de decenas de millones de rotíferos más allá de lo que se necesita, incluso para una operación de gran vivero, debido a las variaciones en la actividad de guardería. Este Feedout Culture Embarcación se utiliza para mantener los rotíferos para la inoculación diaria de policultivos y los rotíferos restantes puede ser alimentado como un suplemento nutricional de alta calidad a los estadios juveniles de larva y principios posteriores de pescado. La salinidad reducida (10 g / L) en el FCV también pre-aclimata los rotíferos a las condiciones en los tanques de policultivo, para que mantengan vigorosa actividad de natación cuando se transfiere.
Es importante destacar que estos cambios en el rotífero plomo protocolo de cultivo a las mejoras en el enfoque policultivo dirigen, en particular con respecto a la entrada de mano de obra. El método anterior publicado por Best y co-autores involucrados no sólo una inoculación inicial de rotíferos en el día 5, pero también adiciones diarias de rotíferos, hasta la fase de policultivo estática terminó el día 9 12. La media de las densidades de rotíferos durante este período alcanzó un máximo de 333 rotíferos / ml en el día de la inoculación y terminó por debajo de 50 ml / rotíferos en la terminación de la fase de policultivo en día 9 12. En contraste, El protocolo actual mantiene densidades mucho más altas a lo largo de, por lo general a partir de ~ 665 rotíferos / ml, y terminando con ~ 481 rotíferos / ml en el día 9.
Hay dos factores que permiten estas densidades de rotíferos mucho más altas. 1) La robustez global del cultivo de rotíferos utilizado para la inoculación es mucho mayor. Por otra parte, el paso revisada de inocular el policultivo con volúmenes iguales de algas / rotíferos a 10 g / L de salinidad y ~ 0 g / l de agua peces salinidad, da como resultado una salinidad intermedia de 5 g / L que se mantiene durante todo el policultivo. A partir de un mayor volumen total de agua (1 litro) también es más propicio para el crecimiento de rotíferos y la supervivencia en los tanques de policultivo. En el método publicado anteriormente, las densidades de rotíferos de partida inferiores en un volumen más pequeño necesitaron adiciones diarias de rotíferos para reponer las pérdidas por desgaste (presumiblemente debido a la mala calidad del agua) y el consumo mediante el desarrollo de larvas de peces. Los resultados de estos ajustes en el protocolo dramatreducir camente insumos de trabajo (uno de alimentación durante 4 días en comparación con 4 tomas en 4 días con el método anterior). El crecimiento de las larvas y el rendimiento de la supervivencia durante el período inicial de policultivo 5 días es comparable a la publicada previamente 12.
La productividad de los cultivos de rotíferos está necesariamente limitada por la entrada de alimentación. Densidades de rotíferos de 2.000 - 3.000 / ml se pueden alcanzar con estos métodos, simplemente mediante el aumento de la entrega de alimentación. Cuando se conoce el rendimiento de rotíferos por unidad de alimento, tasa de alimentación se puede ajustar para que coincida con la producción de rotíferos a las necesidades proyectadas. Durante los fines de semana y días festivos, la alimentación se puede reducir y cosechas omitidos por un día o dos sin dañar los rotíferos, aunque su potencial productivo será subóptima hasta que la alimentación diaria normal y cosechar hojas de vida de rutina.
Cuando hay una necesidad imprevista de rotíferos más de lo habitual, una porción mayor de la población se puede cosechar sin dañar el culture, pero dependiendo del tamaño de la cosecha del cultivo puede requerir un día o más para recuperar su densidad habitual. Si la demanda de rotíferos se reducirá durante más de un día o dos, la producción se redujo mejor mediante la reducción de la entrega de alimentación, en lugar de disminuir la cosecha. Una tasa de explotación de al menos el 25% / día mantiene un perfil de edad más joven de rotíferos para que los rotíferos son más vigorosa y fecunda, la mejora de su rendimiento en los tanques de policultivo.
Este protocolo se adapta fácilmente a escalas más pequeñas para las instalaciones de pez cebra más pequeñas. Por ejemplo, un cultivo 15 L, que puede ser convenientemente configurado en un cubo estándar de 5 galones US (20 L) con la alimentación a mano dos veces por día, puede alcanzar fácilmente una densidad de 1.000 rotíferos / ml. El uso de una bomba de alimentación permite densidades de 2.000-3.000 / ml. Un solo cubo cosecha en 30% / día, por lo tanto puede proporcionar 5-15 millones de rotíferos / día, lo suficiente como para comenzar a 10 - 30 policultivos. Dos cubetas se pueden utilizar en la misma CV + FCV protocolo como se describe unaBove. Un algas + controlador + amoniaco pH alimentación premezcla está disponible (ver Tabla de específico Reactivos / Equipo) que sea conveniente para aplicaciones de pequeña escala. Tiene suficiente viscosidad que las células de las algas no se conforman a cabo de forma rápida y por lo que no requiere mezcla continua en el depósito de alimentación.
Si la productividad disminuye cultivo de rotíferos, o una acumulación inusual de rotíferos muertos se encuentra en la cultura, todos los parámetros de calidad del agua (temperatura, salinidad, pH, NH3 concentración) se deben revisar. Brachionus plicatilis normalmente lleva sus huevos hasta que nacen, y la presencia de muchos huevos no fijados (que por lo general no eclosionan) en la cultura es un signo de estrés, más a menudo debido al amoníaco acumulado.
Si el agua de cultivo de rotíferos es un verde más intenso de lo habitual, entonces o bien la velocidad de avance es demasiado alta o los rotíferos no están consumiendo alimentos a su ritmo habitual. Por lo general, esto es cautilizado ya sea por un factor de estrés, o de la cultura ha sido sobreexplotadas sin ajustar la velocidad de alimentación de acuerdo con la población reducida. En cultivos densos que es normal para una coloración marrón se acumule en el agua como pigmentos de algas son metabolizados por los rotíferos.
El uso de rotíferos de agua salada durante la primera fase de alimentación ha sido ampliamente adoptado en toda la comunidad de investigación pez cebra ya que el método fue publicado por primera vez en 2010 12. Las modificaciones introducidas en el método de cría policultivo que se describe en este protocolo permitirá un mayor número de laboratorios a adoptar este enfoque, independientemente de la escala. Estos avances son oportunas; desarrollos en la tecnología de eliminación de genes (por ejemplo., CRISPR, Talens, etc.) para el pez cebra requerirá protocolos de cría racionales y eficaces para crecer miles de nuevas cepas de peces genéticamente modificados para su uso en diversos campos de la ciencia.
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Disclosures
CE Henry es empleado por Reed Maricultura, Inc., una empresa que ofrece rotíferos, concentrados de algas, y otros suministros a los mercados de aficionados de la acuicultura y de peces.
Acknowledgments
El cuidado y la utilización de peces generados para obtener resultados representativos descritos en este protocolo se realizó en plena conformidad con las directrices establecidas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Hospital Infantil de Boston, el protocolo # 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
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