Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein herausragender Labortier in einer wachsenden Zahl von wissenschaftlichen Disziplinen verwendet, einschließlich, aber nicht Entwicklungsgenetik, Toxikologie, Verhalten, Aquakultur, Regenerationsbiologie und der Modellierung von vielen menschlichen Erkrankungen 1 begrenzt - 5. Obwohl die Spezies ist relativ einfach im Labor zu erhalten, gibt es eine Anzahl von Management-Herausforderungen mit ihrer Kultur 6 verbunden. Der prominenteste von ihnen ist Larvenaufzucht, vor allem, wenn der Fisch zuerst beginnen zu füttern im Anschluss an Gasblase Inflation 7. Unter normalen, kontrollierten Bedingungen erfolgt diese Entwicklungs Ereignis bei ~ 5 Tage nach der Befruchtung (DPF), mit den folgenden 3-5 Tagen Wachstum besonders kritisch 7. Die zentrale technische Schwierigkeit in dieser Phase ist es, die ernährungsphysiologischen Anforderungen der ersten Fütterung Larven adäquat zu begegnen - Futterteile müssen von geeigneter Größe sein, Digesvereinbar, attraktiv, und auf einem nahezu kontinuierlichen Basis, ohne dass übermäßige Abfälle in Kultivierungstanks. Historisch gesehen hat sich in der Regel durch die Bereitstellung von zahlreichen kleinen Futtermengen, um die Fische in Tanks, zusammen mit Routine Wasseraustausch 8,9 erreicht. Während diese Methoden sind zu einem gewissen Grad erfolgreich, sind sie ineffizient, erfordern einen hohen Arbeitseinsatz, und kehren nur variabel und begrenzten Wachstumsraten und Überlebensrate 10.
In der Natur, Zebrafisch-Larven ernähren sich vermutlich in der Wassersäule 11 reichlich kleines Geschenk Zooplankton. Aus diesem Grund larviculture Protokolle, die Live-Feeds, wie Paramecium, Rädertierchen und Artemia übernehmen in der Regel die effizienteste 7. Im Jahr 2010, Top und Co-Autoren gezeigt, dass es möglich war, Larven Zebrafisch in statischen, Brackwasser sowie Salzwasserrädertierchen für die ersten 5 Tage exogene Fütterung 12 wachsen. Dieser Ansatz, der nutzbares die natürliche hohe Produktivität der Rädertierchen Kulturen zu reichlich, sehr nahrhaft Beute belasten das Wasser nicht zu schaffen, die Renditen sehr hohe Larven Wachstum und Überleben mit niedrigen Arbeitseinsatz 12,13. In den letzten Jahren haben immer mehr Labors auf der ganzen Welt Variationen dieses Protokoll anzuwenden sind, und viele jetzt Kultivierung Rädertierchen in einer kontinuierlichen Weise in den Kindergarten-Systeme 14 zu unterstützen.
In den vergangenen Jahren wurden Methoden für die beiden Rädertierchen / Zebrafisch polyculture und Rädertierchen Produktion verfeinert und verbessert, um mehr standardisiert und leicht skalierbar sein. Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für 1) stetig und robust Rädertierchen Produktion und 2) die Einrichtung der Rädertierchen / Zebrafisch Polykultursystems verwendet werden, um ein robustes Wachstum der Fische für die ersten 5 Tage von exogenen Zuführung zu unterstützen.
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Protocol
1. Rädertier Kultur
- Grundkomponenten eines Kultursystem mit einem 100 l Kulturgefäß
- Sammeln Sie alle Komponenten für die Rädertierchen Kultur Setup. Die Rotatorien Kultur Aufbau besteht aus einem Kulturgefäß (CV), um die Rotatorien wachsen; ein ähnliches Gefäß Zuführkopf Rädertierchen (Zuführkopf Kulturgefäß, FCV) aufrecht zu erhalten; ein Rundbrut jar (Feed-Reservoir, FR) für die Lagerung der Algen Futtermischung (AFM); eine Luftzufuhr (AS), um den Lebenslauf, FCV und der FR belüften; eine peristaltische Pumpe mit einem Messtimer (PMT), die Lieferung von Algen Zufuhr in den Lebenslauf und FCV zu steuern; und eine Zahnseide Partikelfilter (FPF), die innerhalb der CV sitzt.
HINWEIS: Eine vollständige Liste mit Verbrauchsmaterialien und Komponenten in der Materialliste zur Verfügung gestellt.
- Sammeln Sie alle Komponenten für die Rädertierchen Kultur Setup. Die Rotatorien Kultur Aufbau besteht aus einem Kulturgefäß (CV), um die Rotatorien wachsen; ein ähnliches Gefäß Zuführkopf Rädertierchen (Zuführkopf Kulturgefäß, FCV) aufrecht zu erhalten; ein Rundbrut jar (Feed-Reservoir, FR) für die Lagerung der Algen Futtermischung (AFM); eine Luftzufuhr (AS), um den Lebenslauf, FCV und der FR belüften; eine peristaltische Pumpe mit einem Messtimer (PMT), die Lieferung von Algen Zufuhr in den Lebenslauf und FCV zu steuern; und eine Zahnseide Partikelfilter (FPF), die innerhalb der CV sitzt.
- Konfiguration
- Heben die CV und FCV auf einem Ständer oder Tisch, so dass die Kulturen können bequem über eine Ablaufarmatur in einer Sammlung cont geerntet werdenainer (Abbildung 1). Verwenden flexible Luftzufuhrschlauch an den AS zu einer Länge von starren Rohr in jedem Kulturgefäß zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch lang genug ist, um Luft in den Boden des CV oder FCV zu liefern.
- Verwenden Sie einen kleinen Leistungsluftleitung, um die AS auf eine Länge von starren Rohrleitung, die auf dem Boden der FR, die die AFM enthält sich zu verbinden. Installieren Sie ein Ventil in jedem Luftlinie um den Luftstrom zu regulieren. Verbinden Sie den FR in die PMT mit Futterförderrohr, und führen Sie den Schlauch von der PMT in ein Loch in der Seite des CV / FCV gebohrt, in der Nähe der Spitze. Abbildung 1.
- Anfang
- Füllen Sie das Kulturgefäß zu 90% des verfügbaren Volumens mit Umkehrosmose (RO). Wenn RO nicht verfügbar ist, verwenden Sie saubere, dechloriert kommunale Wasser; jedoch sollte ein biosecurity Risikobewertung durchgeführt werden, damit keine potentiell pathogenen Organismen im Quellwasser vorhanden sind. HINWEIS: Eine solche Analyse durchgeführt werden kannvon jedem qualifizierten Wasser Prüflabor.
- Dosieren Sie das Kulturgefäß mit Wasser Aquarium Salz in einem Salzgehalt von 15 g / l zu erreichen. Gesetzt den Luftstrom in das Gefäß, so daß sie eine "roll boil" aufrechterhält und dann langsam die gemessene Menge an Salz zu dem Kulturgefäß, bis sie vollständig durch die Belüftung gelöst. Weiterhin Belüften des Wassers für> 1 h, um sicherzustellen, dass sie vollständig mit Sauerstoff angereichert wird.
- Machen Sie das Algenfuttermischung. Bis 3 l sauberem, frischem dechloriert (0 ppm) Wasser mit 100 g NaHCO 3 und 100 g Ammoniakneutralisationsmittel (Natrium hydroxymethylsulfonat). Diese letzte Reagenz bietet den zusätzlichen Vorteil, jede gegen restlichem Chlor aus dem Leitungswasser oder Bleich Rückstände aus Desinfektionskulturtechnik. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, daß diese Verbindungen vollständig gelöst. Dann fügen Sie 1 l Algenkonzentrat (Biomasse Trockengewicht ~ 15%). Fügen Sie die Futtermischung an den FR und bei 4 ° C.
- Fügen Sie eine Starterkultur von 5-10000000
- Schalten Sie das PMT und beginnen Pumpen des Algen-Feed in das Rädertierchen Kulturgefäß. Verwendung des Zeitgebers Merkmal der PMT, setzen die Förderrate der Algen Futtermischung, so daß ~ 1,6 ml Algenbeschickungsmischung pro Million Rotatorien in der Kultur pro Tag geliefert. Verteilen der Fütterungen in kleinen Portionen in regelmäßigen Abständen über den Verlauf eines 24-Stunden-Zeitraum; desto häufiger Fütterungen, desto besser.
- Kalibrieren der Fördermenge der Pumpe durch manuelles Einschalten der PMT für einen bestimmten Zeitraum (beispielsweise 1 min) und sammle die Algen, die es während dieser Zeit in einen Messzylinder oder Becherglas pumpt. Zum Beispiel, wenn die PMT Dosen 5 ml von Algen in 1 min, dann wird die Dosisleistung wäre5 ml Algen / min.
- Berechnen Sie die erforderliche tägliche Förderrate durch Multiplikation der Zahl der anwesenden Rädertierchen, in Mio., um 1,6 ml. Zum Beispiel würde ein rotifer Kultur mit einer Populationsgröße von 100 Millionen Rotatorien ~ erfordern 160 ml Futter pro Tag (100 x 1,6 ml).
- Stellen Sie die PMT, um die gesamte tägliche Futterbedarf in regelmäßigen Abständen während einer 24-Stunden-Zeitraum zu dosieren. Zum Beispiel könnte Lieferung einer gesamten täglichen Futtermenge von 160 ml in Portionen zugeführt werden, wenn alle 3 h über einen Zeitraum von 24 h unter Verwendung einer PMT Set mit einer Dosierpumpe Geschwindigkeit von 5 ml / min für 4 min, 8 Mal täglich (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 Fütterungen = 160 ml).
- Lassen Sie die Kultur für 48 wachsen, bis es die gewünschte Population erzeugt, in der Regel - 72 h vor der Ernte. Bei 24 Stunden nach der Inbetriebnahme, die Zahnseide Partikelfiltern in den Kulturgefäß und beginnen normale Wartung.
- Instandhaltung
HINWEIS: Die Kultur arbeitet auf einer kontinuierlichen Basis und erfordert routine Wartung, die im Idealfall zur gleichen Zeit jeden Tag durchgeführt werden, in der folgenden Reihenfolge.- Füllen Sie den FCV zu 90% der zur Verfügung stehende Volumen mit sauberen, dechloriert frisches Wasser, mit 10 g / l Aquarien Salze dosiert. Sicherzustellen, daß das Wasser gut vermischt, und das gesamte Salz völlig aufgelöst ist. Stellen Sie den Luftstrom in den Behälter, so dass es eine "rollenden kochen" unterhält. Messen Sie den Salzgehalt mit einem Refraktometer und sicherzustellen, dass der Salzgehalt 10 g / l. Es ist kritisch, um dieses Ziel zu erreichen und es nicht zu überschreiten.
- Probieren Sie die Rädertierchen im Lebenslauf: Stellen Sie sicher, dass die Kultur ist gut gemischt, dann sammeln Sie 3 Proben eines 2 - 3 jeweils mit einer Transferpipette oder autopipettor ml, aus verschiedenen Teilen der Kultur. Kombinieren Sie diese Proben in einem Rohr oder Fläschchen praktische Größe (zB 10 ml).
- Transfer 1-2 ml der kombinierten Probe auf eine Petri-Schale, so dass es unter einem Präpariermikroskop visualisiert werden. Prüfen Sie die Qualität der Kultur (Schwimmverhalten derRädertierchen, Gegenwart abgelöst Eier, verunreinigen Protozoen).
- Immobilisieren Rotiferen in dem verbleibenden kombinierten Probe durch Zugabe von 100 ul 50% Lugols Jodlösung auf die Probe. Innerhalb von Sekunden nach der Zugabe der Lugols, beachten Sie die Rädertierchen zum Schwimmen zu stoppen. Nun, leicht zu zählen die Rädertierchen.
HINWEIS: Ethanol, verdünnte Bleichmittel, oder Essig kann anstelle von Lugols verwendet werden. Essig (2 Tropfen / 10 ml) hat den Vorteil, dass nicht gefährliche, Stärke nicht zu verlieren bei der Lagerung als Bleich und Jod-Lösungen, und nicht die Herstellung der Rädertierchen Vertrag, so dass die Korona der Zilien und der "Fuß" bleiben ausgefahren und der Tiere natürlicher aussehen. - Stellen Sie sicher, dass die Probe gut gemischt (immobilisiert Rotatorien schnell absetzen), dann schnell einen ~ 2 ml Teilprobe in einer Plastikpipette und verzichten 1 ml in ein Sedgewick-Rafter Zählen Schieber (20 x 50 1-mm-Quadrate) (Abbildung 2 ). Mit Hilfe eines Sezieren oder zusammengesetzten Mikroskop, zählen Sie die intakte Rädertierchen und die tesamtanzahl Eier auf diese Rotatorien befestigt (Figur 2). Zählen Sie so viel von der Folienbereich wie nötig, um zu zählen ~ 100 Rädertierchen. Berechnen Sie die Anzahl der Rädertierchen pro ml, und notieren Sie diese in einer Tabellenkalkulation oder Logbuch.
- Ernte ~ 30% des Volumens der Rädertierchen im Lebenslauf: Entfernen Sie die Luftversorgung und Zahnseide-Filter, das Ventil zu öffnen langsam an der Unterseite des CV und lassen Sie das Wasser in eine Planktonkollektor mit einer 53 & mgr; m Sieb fließen. Sammeln das Wasser nach der Filterung in einen Eimer oder Drain aus der Unterseite des Kollektors fließt. Verwenden Sie einen sanften bis mäßige Strömung um eine Beschädigung der Rädertierchen. Erlauben nicht den Rädertierchen, um auf dem Bildschirm zu trocknen.
- Aus Gründen der Einheitlichkeit ist es ratsam, das FCV mit einem Standard-Anzahl von Rädertierchen jeden Tag zu schaffen. Daher basierend auf der bekannten CV rotifer Dichte und Erntevolumen, einstellen FCV Gesamtvolumen auf eine konsistente Enddichte zu erreichen (z. B. 1.500 Rotatorien / ml). Fügen Sie die geerntet rotifers an den FCV: Behutsam die Rädertiere übertragen aus der Sammlung Bildschirm mit Hilfe einer Waschflasche mit sauberem Salzwasser gefüllt (10 bis 15 g / l). Kehren Sie die Bildschirm über den FCV und waschen Sie die Rädertierchen in den FCV mit einem sanften Strom von Salzwasser. Starten Sie das PMT zur Einspeisung in den FCV liefern (~ 1,57 ml pro Million Rädertiere pro Tag).
- Scrub die gesamte Innenseite der CV mit einem sauberen, weichen Nylonbürste oder Scheuerpad.
- Stellen Sie eine neue Mischung aus 15 g / L Wasser durch Zugabe der entsprechenden Menge des Salzes zu einer gemessenen Menge an sauberem RO-Wasser in einem 5-Gallonen-Eimer zu ersetzen, das Volumen des Wassers verloren bis zur Ernte. Fügen Sie das Salz in das Wasser in den Eimer und rühren Sie kräftig, bis es vollständig gelöst ist, und dann an den CV hinzuzufügen.
- Mit Hilfe eines Hochdruck-Spray in einer Spüle, spülen Sie die Filterwatte, bis es frei von Abfall, und dann schicken Sie es an die CV.
- Passen Vorschubgeschwindigkeiten von Algen an den CV durch Änderung der Dauer der einzelnen Dosierereignis geliefert, nach dem Tageszahl von Rädertierchen / ml.Verwenden der Berechnungen in Schritt 1.3.8 vorgesehen ist, über die entsprechende Futtermenge zugeführt werden zu bestimmen.
- Etwa 24 Stunden später, wiederholen Sie den Vorgang. Starten durch Ernten der in der FCV (die nicht für den vorherigen Tag wurden benötigt) verbleibenden Rotatorien in der gleichen Weise wie oben beschrieben (Schritte 1.4.2 - 1.4.10). Konzentrieren sie in 2 l frischem, sauberem entchlortes Wasser (5 g / l Salz). Diese können bei 4 ° C als Sicherungsteil gespeichert werden, oder zur späteren Stadien von Fischfutter, das hinaus, was in diesem Protokoll beschrieben.
Hinweis: Dieses Protokoll erlaubt bis zu 2 - 3 Tage von reduzierten Kulturpflege (mit normaler automatischer Zuführung), da die Rädertierchen in der CV können Unterlassung der Ernten ohne schwerwiegende Folgen zu tolerieren.
2. Polyculture
- Konfiguration
- Sammeln Zebrafischembryonen aus einem Laichereignis durch Gießen hervorgebracht Embryonen durch ein Teesieb und dann sanft Spülen mit sterilem fish Wasser (oder einem anderen nicht-kontaminierten Quelle entsprechend aufbereiteter Lösung, zB Embryomedium, E3, etc.) aus einer Waschflasche in Petrischalen.
- Die Embryonen bei 25 inkubieren - 28 ° C in Petrischalen in einer Dichte von 40 - 50 Embryonen pro Schale für 5 Tage.
- Beginnen Sie den polyculture Phase am 5. Tag nach der Befruchtung, oder wenn mehr als 90% der geschlüpften Larven aktiv schwimmen in der Wassersäule.
- Impfung
- In 500 ml Rädertierchen Kultur direkt von der FCV zu einem 3,5 L Kindergarten Tank; Einbeziehung von Rädertierchen Kulturwasser bietet Algen Feed, den Nährstoffgehalt der Rädertierchen in polyculture hält.
- Gießen Sie vorsichtig die Larven aus einer Petrischale in die Kinderstube Tank. Stellen Sie sicher, dass keine Larven in der Schale bleiben.
- Gib 500 ml sauberem, konditioniert Fischwasser aus einem Kreislaufsystem oder dedizierten Wasserquelle zu dem Behälter, um ein Endvolumen von 1 l und eine endgültige s erreichenalinity von 5 g / L.
HINWEIS: Dieser Salzgehalt ist kritisch, weil Zebrafischlarven überleben wird negativ beeinflusst, wenn Salzgehalt> 7 g / l und Rädertierchen Überleben wird negativ beeinflusst werden, wenn Salzgehalt <2 g / L.
- Polyculture Phase
HINWEIS: Die Polykultur Phase sollte für bis zu 4 Tage nach der Inokulation dauern (insgesamt 5 Tage, entsprechend 5-9 Tage nach der Befruchtung).- Mindestens einmal pro Tag während dieser Zeit beobachten die Polykultur Tank um sicherzustellen, dass Rädertiere und Fisch anwesend und wachsen. Stellen Sie sicher, dass die Rädertierchen in der gesamten Wassersäule sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die die fishs sind auch sichtbar in der Wassersäule, Schwimmen unter den Rädertierchen.
- Starten normalen Wasserdurchfluss durch den Tank. Legen Sie einen Bildschirm oder Schallwand über die Ablauföffnung, dass die Larven zu gewährleisten sind nicht aus dem Tank ausgespült.
HINWEIS: Am Ende dieser Phase, die Fische groß genug, um größere Beutetiere wie Artemia konsumierenNauplien oder verarbeitet werden Feed-Einträge in einem Größenbereich von 75 bis 125 & mgr; m.
HINWEIS: Die rotifer Populationsdynamik innerhalb eines repräsentativen Polykultursystems Tank wurden durch Abtasten gemessen / gezählt Rotatorien vom Tank in der gleichen Weise wie in den Schritten 1.4.2 - 1.4.5. Dies wurde einmal pro Tag ab dem Beginn des Mischkultur Phase durchgeführt, bis sie abgeschlossen war.
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Representative Results
Die hier beschriebene kontinuierliche Rädertierchen Kultursystem ist dynamisch, und es ist normal, Rädertierchen Nummern zu einem geringen Teil im Laufe der Zeit schwanken, wenn Variationen in der täglichen Fütterung und Ernteraten. Die Bevölkerung der Rädertierchen in einem der aktiven Kulturen in den Aquakulturanlagen an der Boston-Kinderklinik, in der oben beschriebenen Weise gehalten wurde, wurde für 30 Tage (Abbildung 3) überwacht. Die Durchschnittskulturdichte in diesem Zeitraum bei 932 Rotatorien / mL, mit einem Maximum von 1.330 Rotatorien / ml und ein Minimum von 510 Rotatorien / ml. Dies stellt die typische Leistung einer rotifer Kultur in Übereinstimmung mit diesem Protokoll erhalten.
Die Dynamik der Rotatorien Population in einer Mischkultur-Tank mit Zebrafisch ist in Abbildung 4 dargestellt. Ein 3,5 L Fischtank wurde mit 500 ml rotifer Kultur von FCV, 500 ml sterilisiertem f inokuliertish Wasser und 40 5-Tage alten Wildtyp (Tübingen Stamm) Larven, zu demonstrieren, wie Rädertierchen und Zebrafisch durchzuführen in einem typischen polyculture Tank. Die Rotatorien Bevölkerung in der Mischkultur Tank erreichte am zweiten Tag mit einer Dichte von 747 Rotatorien / ml (Figur 4). Die Dichte der Rotiferen in dem Mischkultur Tank sank über die 5 Tage Polykultursystems Periode auf ein Minimum von 481 Rotatorien / ml am Tag 5 Jedoch war die mittlere rotifer Dichte über den gesamten Zeitraum betrug 589,4 Rotatorien / ml, und der Minimalwert von 481 Rotatorien / ml ~ 10-fache der Rotatorien Dichte am Ende der Mischkultur Periode früher veröffentlichten Arbeit 12.
Zebrafisch-Wachstum im Zeitraum von fünf Tagen wird in Abbildung 5 dargestellt. Die Fische zeigten stetiges Wachstum jeden Tag, von einer mittleren Länge von 3,904 mm ± 0,063 SEM, als sie auf die Polykultur Tank auf eine mittlere Gesamtlänge von 5,423 ± 0,063 SEM hinzugefügt amder letzte Tag des polyculture Phase. Überleben war 95% (38/40).
Wasserqualitätsparameter wurden täglich in der repräsentativen Polykultursystems Behälter gemessen und sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Werte dieser Parameter ähnlich wie zuvor veröffentlichten Arbeiten 12 und stellen Bedingungen, die förderlich für das Wachstum und Überleben der beiden Rädertiere und Fische sind während der 5-Tage-Frist der polyculture.
| Tag | Tag | Salzgehalt | BRÄUNEN | NO 2 | NO 3 | pH | Alkalinität | Härte | Temperatur |
| (Tatsächlich) | (nach der Befruchtung) | g / L | mg / L | mg / L | mg / L | mg / L (CaCO 3) | mg / L (CaCO 3) | ° Celsius </ td> | |
| Montag | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| Dienstag | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23,3 |
| Mittwoch | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22,3 |
| Donnerstag | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22,8 |
| Freitag | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
Tabelle 1 Wasserqualitätsparameter ina Vertreter Zebrafisch Polyculture Panzer.
Abbildung 1. Rädertier Kultur Setup-Legende:. Kulturgefäß (KG), Zuführkopf Kultur Fahrzeug (FCV), Luftversorgung (AS), Floss Partikelfilter (FPF), Algenfuttermischung (AFM), Feed-Reservoir (FR), programmierbare Mess Timer (PMT). Gezogenen Linien Algenfutterlieferung. Gestrichelten Linien Luftzufuhr. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Füllen eines Sedgewick Rafter-Counting Slide. Bitte klicken Sie hier, um einen BlickGrößere Version der Figur.
. Abbildung 3. Rotifer Bevölkerungsdynamik in Kultur über einen Zeitraum von 30 Tagen Legende: Die Anzahl der gezählten Rädertierchen (Weibchen Eier +) pro ml ist auf der x-Achse. Die Anzahl der Tage in der Kultur ist auf der y-Achse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Rotifer Bevölkerungsdynamik während einer 5-tägigen Polyculture Legend:. Der Anzahl der gezählten Rädertierchen (Weibchen Eier +) pro ml ist auf der x-Achse. Die Anzahl der Tage in polyculture ist auf der y-Achse. Bitte klicken Sie hier, um view eine größere Version dieser Figur.
. Abbildung 5. Zebrafisch-Wachstum während einer 5-tägigen Polyculture Legende: Werte sind Mittelwerte Gesamtlänge in mm; Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Erfolgreiche Umsetzung der Rädertierchen polyculture Verfahren zum Zuführen frühen Larvenzebrafisch erfordert effektive Protokolle für zwei Aufgaben: die Schaffung und Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Rädertierchen Kultursystem, um die Fische zu füttern und das Züchten der ersten Fütterung Zebrafisch-Larven zusammen mit Rädertierchen in der gleichen Tank.
Die Einrichtung für eine kontinuierliche salz rotifer Produktionssystem für Laboratorien Zebrafisch zuerst von Lawrence und Mitautoren 14 beschrieben wurde modifiziert und in einer Anzahl von Wegen verbessert es sowohl robuster und universell einsetzbar zu machen. Das neue Protokoll beinhaltet Verbesserungen sowohl in der Ausrüstung und Methodik.
Das Speichersystem für die Algenfuttermischung beschäftigt heute Brut Gläser in Wels Produktionssysteme 15 verwendet. Lagerung des Futters in dieser Runddosen erleichtert eine Durchmischung der Algen Vorschub so dass es nicht zu schichten oder verklumpen und zu verstopfenging von Förderleitungen, ein Problem, das häufig geplagt das ursprüngliche Protokoll. Auch die Verwendung eines All-in-one programmierbaren Timer / Dosierpumpe reduziert jedoch die Anzahl der Bauteile und vereinfacht die dosierte Abgabe von Futter an die Rotatorien. Sie erlaubt auch die Dosierung von Beschickung zu Rotatorien stündlich über den Zeitraum von 24 Stunden, was bevorzugt zu weniger größere Fütterungen ist, weil das Futter effizienter assimiliert.
Verfahren zum Zählen von Rädertierchen, die Feinabstimmung der Futtergabe an den Rädertierchen Kultur ermöglicht hat in diesem Protokoll aufgenommen worden. Die Fütterung der Rädertierchen auf der Grundlage einer genauen Echtzeitbewertung ihrer Bevölkerungsgröße stellt sicher, stabil, High-Level-Produktion. Eine Sekundär Zuführkopf Kulturgefäß wurde auch dem Protokoll hinzugefügt. Eine kontinuierliche Kultursystem kann einen täglichen Überschuss von zig Millionen von Rädertierchen hinaus, was selbst für einen großen Kindergarten Betrieb benötigt produzieren, aufgrund von Änderungen in der Baumschule Aktivität. Diese Zuführkopf Culture Fahrzeug wird zur Rädertierchen für die tägliche Inokulation von polycultures zu halten, und die verbleibenden Rädertierchen kann als hochwertige Nahrungsergänzungsmittel, die später Larven und frühen Jugendstadien der Fische gefüttert werden. Das reduziert den Salzgehalt (10 g / l) in der FCV auch vorge acclimates die Rädertierchen auf die Bedingungen in den polyculture Tanks, so dass sie kräftige Schwimmaktivität beizubehalten, wenn überführt.
Wichtiger ist, diese Änderungen an die Rotatorien Kultivierungsprotokoll führen zu Verbesserungen in der Mischkultur Ansatz zu leiten, insbesondere in Bezug auf Arbeitsaufwand. Die bisherige Methode, mit besten und Co-Autoren beteiligt nicht nur eine anfängliche Inokulation von Rädertierchen an Tag 5, aber auch tägliche Zugaben von Rädertierchen, bis die statische polyculture Phase endete am Tag 9 12 veröffentlicht. Die mittlere Rädertierchen Dichten während dieser Zeit ihren Höhepunkt bei 333 Rädertierchen / ml am Tag der Impfung und am Ende unter 50 Rotatorien / ml bei der Beendigung des Mischkultur Phase am Tag 9 12. Im GegensatzDas aktuelle Protokoll hält viel höhere Dichten im gesamten, in der Regel ab ~ 665 Rädertierchen / ml, und endend mit ~ 481 Rädertierchen / ml an Tag 9.
Es gibt zwei Faktoren, so dass diese viel höhere Dichten Rädertierchen. 1) Die Gesamt Robustheit der Rädertierchen Kultur für die Impfung verwendet wird, ist weit größer. Ferner der Schritt des revidierten Inokulieren der Mischkultur mit gleichen Volumina von Algen / Rotatorien bei 10 g / l Salzgehalt und ~ 0 g / l Salzgehalt Fischwasser, zu einer Zwischen Salinität von 5 g / L, die im gesamten Mischkultur gehalten wird. Beginnend mit einem größeren Volumen von Wasser (1 l) auch bessere Rahmenbedingungen für Rädertierchen Wachstum und Überleben in den polyculture Tanks. In der zuvor veröffentlichten Verfahren, niedrigere Anfangsrädertierchen Dichten in einem kleineren Volumen erforderte tägliche Zugaben von Rädertierchen, um Verluste durch Abrieb wieder aufzufüllen (vermutlich wegen der schlechten Wasserqualität) und Konsum durch die Entwicklung von Fischlarven. Die Ergebnisse dieser Anpassungen an den Protokoll dramattisch zu reduzieren Arbeitseinsatz (eine Fütterung über 4 Tage im Vergleich zu 4 Fütterungen in 4 Tage mit der bisherigen Methode). Larvenwachstum und Überleben Leistung über den ersten 5 Tag Polykultursystems Zeit ist vergleichbar mit der zuvor 12 bekannt.
Die Produktivität der Rädertierchen Kulturen wird zwangsläufig durch die Vorschubeingabe beschränkt. Rotatorien Dichten von 2,000 - 3,000 / ml kann bei diesen Verfahren einfach durch Erhöhen der Futterlieferung erreicht werden kann. Wenn Rädertierchen Ertrag pro Einheit von Futter bekannt ist, kann Vorschubgeschwindigkeit eingestellt werden, um die Produktion Rädertierchen projiziert Bedürfnisse anzupassen. An Wochenenden und Feiertagen, können Fütterung vermindert und erntet für ein oder zwei Tage weggelassen ohne Schädigung der Rädertierchen, obwohl ihr Produktionspotenzial wird suboptimal, bis die normale tägliche Fütterung und ernten Routine fortgesetzt.
Wenn es eine unerwartete Notwendigkeit für mehr Rotatorien als üblich, kann ein größerer Teil der Bevölkerung, ohne die cul geerntettur, aber abhängig von der Größe der Ernte die Kultur können eine oder mehrere Tage zu ihrer üblichen Dichte erholen. Wenn rotifer Bedarf für mehr als ein oder zwei Tage verringert werden, wird die Produktion besten durch Verringerung der Futterlieferung statt Verringern der Ernte verringert. Eine Ernte Rate von mindestens 25% / Tag unterhält eine jüngere Rädertierchen Altersprofil, so dass die Rädertierchen sind kräftig und fruchtbar, der Verbesserung ihrer Leistung in den polyculture Tanks.
Dieses Protokoll wird leicht auf kleineren Skalen für kleinere Zebrafisch Einrichtungen angepasst. Zum Beispiel kann ein 15-l-Kultur, die sich in einer Standard-5 US-Gallonen (20 L) Eimer mit der Hand zu füttern zweimal täglich bequem eingestellt werden können, kann leicht zu erreichen eine Dichte von 1,000 Rädertierchen / ml. Verwendung einer Förderpumpe ermöglicht Dichten von 2000-3000 / ml. Eine einzige Schaufel bei 30% / Tag geerntet kann deshalb 5-15000000 Rädertierchen / Tag, genug, um 10 beginnen - 30 polycultures. Zwei Eimer kann in der gleichen CV + FCV-Protokoll, wie beschrieben, verwendet werden, einBove. Ein Algen + Ammoniak-Controller + pH-Puffer-Vormischung Feed ist verfügbar (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Verbrauchsartikel), die praktisch für kleinere Anwendungen ist. Es hat eine ausreichende Viskosität, daß die Algenzellen nicht absetzen und schnell, damit es nicht kontinuierlichem Mischen in der Zuführungsbehälter erforderlich.
Wenn Rädertierchen Kultur Produktivität sinkt, oder eine ungewöhnliche Anhäufung von toten Rädertierchen in der Kultur gefunden, alle Wasserqualitätsparameter (Temperatur, Salzgehalt, pH-Wert, NH3-Konzentration) überprüft werden. Brachionus plicatilis trägt normalerweise seine Eier, bis sie ausbrüten, und die Gegenwart vieler nicht befestigten Eiern (die normalerweise nicht schlüpfen weiß) in der Kultur ist ein Anzeichen von Stress, am häufigsten durch Ansammlung von Ammoniak.
Wenn die Rädertierchen Kultur Wasser ist ein intensiver grüner als sonst, dann entweder die Vorschubgeschwindigkeit ist zu hoch oder die Rädertiere sind nicht dem Konsum von Lebensmitteln in ihrem üblichen Rate. Ist in der Regel diese caentweder durch einen Stressfaktor oder der Kultur verwendet wurde, ohne Anpassung Vorschubrate entsprechend der reduzierten Population overharvested worden. In dichten Kulturen ist es normal, eine Braunfärbung im Wasser anreichern als Algenpigmente werden von den Rädertierchen metabolisiert.
Die Verwendung von Salzwasser-Rädertierchen in der ersten Zuführungsphase wurde in großem Stil über den Zebrafisch-Forschung, da das Verfahren wurde erstmals im Jahr 2010 12 veröffentlicht angenommen. Die an die Polykultur Aufzuchtmethode, die in diesem Protokoll beschriebenen vorgenommen Änderungen werden eine noch größere Anzahl von zu ermöglichen Laboratorien, diesen Ansatz zu übernehmen, unabhängig vom Maßstab. Diese Fortschritte sind rechtzeitige; Entwicklungen in der Gen-Knockout-Technologie (z. B. CRISPR, Talens, etc.) für die Zebrafisch wird straffer und effizienter Aufzucht Protokolle erfordern, um Tausende von neuen Sorten von gentechnisch verändertem Fisch für den Einsatz in verschiedenen Bereichen der Wissenschaft zu wachsen.
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Disclosures
EG Henry wird von Reed Mariculture, Inc., einem Unternehmen, das Rädertiere, Algen Konzentrate und andere Lieferungen stellt der Aquakultur und Fischhobbymärkten beschäftigt.
Acknowledgments
Die Pflege und Nutzung von Fischen in diesem Protokoll beschriebenen repräsentativen Ergebnisse generated in voller Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Boston Kinderkrankenhaus, Protokoll # 14-05-2673R festgelegten Leitlinien durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
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- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
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- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
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- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
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- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
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