Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

मानव जमे हुए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल नमूनों से सीडी 90+ तंतुकोशिका / पेशीतंतुकोशिकाएं का अलगाव

Published: January 31, 2016 doi: 10.3791/53691
Automatic Translation
1, 3, 1, 2, 1, 2
1Surgery, University of Texas Medical Branch, 2Internal Medicine, University of Texas Medical Branch, 3Molecular Genetics and Microbiology, University of New Mexico

Abstract

Fibroblasts / myofibroblasts (एमएफ) रोगजनन में उनकी भूमिका और ट्यूमर microenvironment के दोनों घाव भरने और संवर्धन के लिए उनके योगदान के लिए बढ़ती ध्यान प्राप्त किया गया है। वर्तमान में जठरांत्र (सैनिक) ऊतकों से म्यूचुअल फंड के अलगाव के लिए कई तकनीकों हैं, वहीं इस प्रोटोकॉल जमे हुए ऊतकों से इन stromal कोशिकाओं के अलगाव के एक उपन्यास तत्व का परिचय। सैनिक ऊतक नमूनों बर्फ़ीली न केवल दुनिया भर में सहयोगियों, biobanks, और वाणिज्यिक विक्रेताओं से नमूने प्राप्त करने के लिए शोधकर्ता यह भी ताजा नमूनों की देरी प्रसंस्करण परमिट की अनुमति देता है। वर्णित प्रोटोकॉल लगातार मार्कर CD90, α-SMA और vimentin कि एक्सप्रेस एमएफ phenotype के साथ विशेषता धुरी के आकार की कोशिकाओं निकलेगा। इन कोशिकाओं को रोगी के नमूनों से प्राप्त कर रहे हैं के रूप में, प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग भी रोग राज्यों-अर्थात् कैंसर और सूजन आंत्र रोग से बारीकी से नकल उतार मुचुअल फंड का लाभ प्रदान करता है। इस तकनीक को मधुमक्खी हैएन आमाशय, छोटी आंत, और colonic एमएफ प्राथमिक संस्कृति पीढ़ी में मान्यता प्रदान की। प्राथमिक एमएफ संस्कृतियों पारित होने के एक नंबर पर प्रयोगों की एक विशाल सरणी में इस्तेमाल किया जा सकता है और उनकी पवित्रता दोनों immunocytochemistry के द्वारा मूल्यांकन और विश्लेषण के प्रवाह cytometry।

Introduction

पेशीतंतुकोशिकाएं / fibroblasts (एमएफ) जठरांत्र (सैनिक) म्यूकोसा में कोशिकाओं की एक प्रचुर मात्रा में आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये stromal कोशिकाओं सिर्फ उपकला के नीचे स्थित है और पेट में श्लैष्मिक पटल Propria भीतर एक परस्पर नेटवर्क के रूप में कर रहे हैं। म्यूचुअल नहीं बाह्य मैट्रिक्स के बयान के लिए ही जिम्मेदार हैं, लेकिन पैराक्राइन विनियमन के माध्यम से सटे उपकला 1, 2 की इलेक्ट्रोलाइट परिवहन, क्षतिपूर्ति, और बाधा समारोह को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, म्यूचुअल सूजन और ऊतकों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है 3, 4 remodeling। पेशीतंतुकोशिकाएं वे भी कैंसर से जुड़े fibroblasts के रूप में जाना जाता है जहां ट्यूमर microenvironment, का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं, और ट्यूमर कोशिकाओं के विकास में योगदान और कैंसर स्टेम कोशिकाओं 3 के लिए एक जगह के रूप में सेवा करते हैं। उभरते डेटा म्यूचुअल फंड के रूप में भी स्थानीय प्रतिजन कोशिकाओं सेवा कर सकते हैं कि पता चलता है। इसके अतिरिक्त, म्यूचुअल समारोह सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में महत्वपूर्ण नियामकों, उत्पादों होगासाइटोकिन्स और वृद्धि कारकों 5 की एक किस्म cing।

स्वस्थ व्यक्तियों में, म्यूचुअल कोशिकाओं इन कोशिकाओं को भी vimentin के लिए सकारात्मक रहे हैं। Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से अलग है और उनके कोशिका की सतह, mesenchymal मार्कर, CD90 3, 5 पर व्यक्त करने के लिए माना जाता है, लेकिन उपकला और hematopoietic सेल मार्कर, EpCAM और CD45 के लिए नकारात्मक , क्रमशः। पेशीतंतुकोशिकाएं fibroblasts की एक सक्रिय रूप हो सुझाव दिया है और α-एसएमए 5 की अभिव्यक्ति द्वारा गैर सक्रिय fibroblasts से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

पिछले एक दशक के दौरान, मानव colonic म्यूकोसा से पेशीतंतुकोशिकाओं के अलगाव के लिए एकाधिक दृष्टिकोण प्रकाशित-ज्यादातर मूल रूप महीदा एट अल। 5-8 से वर्णित विधि के आधार पर की गई है। व्यक्तिगत अध्ययनों विभिन्न पेट म्यूकोसा, कई सैनिक पथ के क्षेत्रों (यानी, गैस्ट्रिक, छोटे और एल से म्यूचुअल फंड के अलगाव के लिए कोई सार्वभौमिक प्रोटोकॉल से अलगाव प्रक्रियाओं की रिपोर्ट जबकिARGE आंत्र mucosa) प्रकाशित किया गया है। इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का परीक्षण किया है और सफलतापूर्वक ऊपर उल्लेख ऊतक के सभी तीन प्रकार के लिए इस्तेमाल किया गया है। । इसके अलावा, जमे हुए सैनिक म्यूकोसा से म्यूचुअल फंड को अलग-थलग करने के लिए प्रक्रियाओं की सूचना नहीं किया गया है।

यहाँ, हम enzymatic पाचन पर आधारित है, जो एक अनुकूलित विधि, वर्तमान और समवर्ती संस्कृति के लिए मानव आंत श्लैष्मिक म्यूचुअल फंड के अलगाव के लिए अनुमति देता है और हौसले से पचा, एकल कोशिका, श्लैष्मिक तैयारी में प्रवाह cytometry विश्लेषण। इस तकनीक को मज़बूती से एक एमएफ phenotype के साथ प्राथमिक संस्कृतियों पैदावार। इसके अलावा, एक ही तरीके के रूप में अच्छी तरह से आमाशय और छोटी आंतों के ऊतकों के जमे हुए नमूनों से म्यूचुअल फंड को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ताजा सैनिक ऊतक से पेशीतंतुकोशिकाओं के अलगाव पहले से वर्णित किया गया है; हालांकि, जमे हुए नमूनों के उपयोग के कई लाभ प्रस्तुत करता है। अर्थात्, शोधकर्ताओं capabi है, जो दुनिया भर में सहयोगियों के किसी भी नंबर से इकट्ठा करने और दुकान के ऊतकों करने में सक्षम होगाlity जमे हुए ऊतकों के नमूनों जहाज करने के लिए। इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने अपने वर्तमान प्रयोग अनुसूची के साथ संघर्ष करने के अलगाव के लिए ऊतक प्रसंस्करण ऑपरेटिंग कमरे और / या एंडोस्कोपी सूट और तत्काल से खारिज कर दिया ऊतक का संग्रह मिल सकता है। इसके अलावा, सर्जरी की अप्रत्याशित प्रकृति के कारण, ऊतक खरीद प्रसंस्करण ऊतक के लिए छोड़ दिया है समय सीमित कर देगा, जो बहुत देर से दिन में हो सकती है। बाद में प्रसंस्करण के लिए ऊतक ठंड इन चुनौतियों उन्नति होगी।

अन्त में, इन तरीकों में सफलतापूर्वक ऐसी कोलोरेक्टल कार्सिनोमा और सूजन आंत्र रोग के रूप में रोग राज्यों में, colonic आमाशय और छोटी आंतों पेशीतंतुकोशिकाओं के अलगाव में उपयोग किया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

त्याग मानव शल्य चिकित्सा रोगियों से ऊतक और प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल टेक्सास चिकित्सा शाखा और न्यू मैक्सिको संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। मानव ऊतकों के नमूनों की खरीद के लिए सामान्य आवश्यकताओं को नीचे वर्णित है। म्यूचुअल जमे हुए ऊतक, biobanks और वाणिज्यिक विक्रेताओं से अलग किया जा सकता है के बाद से भी व्यवहार्य विकल्प हैं कि ध्यान दें।

1. मानव ऊतक प्राप्त

  1. अनुमोदन के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड के लिए मानव पेट के ऊतक प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल को जमा करें।
  2. अनुसंधान के लिए मानव ऊतक प्राप्त करने के क्रम में सामान्य सर्जन और / या कोलोरेक्टल सर्जनों के साथ सहयोग स्थापित करना। वे निदान के लिए आवश्यक नहीं है और अनुसंधान के लिए नामित किया जा सकता है कि ऊतक का निर्धारण किया जाएगा, के रूप में पैथोलॉजी विभाग के सहयोग से भी अनिवार्य है।
  3. Grossl तो सूजन से ऊतक प्रदान करने के लिए पैथोलॉजिस्ट को सलाहट्यूमर से Y सामान्य म्यूकोसा कम से कम 5 सेमी। तुरंत ठंडा धोने मीडिया में नमूने जगह और बर्फ पर जगह है। रोगविज्ञानी सुरक्षित रूप से अनुसंधान के लिए दिया जा सकता है कि ऊतक की राशि का निर्धारण करेगा। एमएफ अलगाव के लिए आवश्यक न्यूनतम ऊतक 1.5 मिमी 2 है।
  4. भविष्य अलगाव के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक संस्कृतियों या फ्रीज और जगह स्थापित करने के लिए प्राप्त ऊतक या तो तुरंत प्रयोग करें।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज मीडिया (देखें नीचे), और दुकान के 1 मिलीलीटर के साथ एक क्रायोजेनिक ट्यूब में जगह है, 2 मिमी 2 टुकड़े - बाद में अलगाव के लिए ठंड, तो लगभग 1 में ऊतक में कटौती। नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग, 4 साल के लिए जमे हुए ऊतकों से म्यूचुअल फंड के सफल अलगाव देखा गया है।

2. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. कोलेजिनेस समाधान के लिए: सीए 2 के साथ हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) में 100 यू / एमएल कोलैजिनेज़ मैं, द्वितीय और चतुर्थ तैयार / 2 मिलीग्राम + (सामग्री तालिका देखें
  2. 10 मिलीग्राम / एमएल (3.55 यूए / मिलीग्राम) पर जल आधारित DNase शेयर समाधान तैयार है।
  3. धो मीडिया तैयार: (सदस्य: 89 मिलीलीटर, एंटीबायोटिक antimycotic, 100x: 1 मिलीलीटर; गर्मी निष्क्रिय एफसीएस: 10 मिलीलीटर)
  4. सदस्य: fibroblast वृद्धि मीडिया तैयार 500 मिलीलीटर की बोतल; एल glutamine (200 मिमी): 5 मिलीलीटर; सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 100x समाधान: 5 मिलीलीटर; सिप्रोफ्लोक्सासिन एचसीएल (10 मिलीग्राम / एमएल): 570 μl; एंटीबायोटिक antimycotic, 100x समाधान: 10 मिलीलीटर; सोडियम पाइरूवेट (100 मिमी): 5 मिलीलीटर; गर्मी निष्क्रिय एफसीएस: 50 मिलीलीटर
  5. रुक मीडिया तैयार: fibroblast वृद्धि मीडिया के 10% के अलावा डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के साथ (अभिकर्मक 2.4), तो फिल्टर Sterएक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ ilize।

3. enzymatically डाइजेस्ट मानव ऊतक

  1. ऊतक गर्म (~ 37 डिग्री सेल्सियस) पानी में फ्रीज मीडिया, जगह cryovial में जम गया था तो ऊतक और मीडिया thawed है जब तक।
  2. 4 के लिए - ऊतक 2 मिमी 2 टुकड़े के 5, सीए 2/2 मिलीग्राम + बिना दो बार HBSS के 10 मिलीलीटर के साथ ऊतक धो लें।
  3. ऊतक गंभीरता से बसे है, एक बार ध्यान से नमूना कताई बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. नमूने के लिए कोलैजिनेज़ समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें और के साथ एक बाँझ, DNase / RNase मुक्त ट्यूब में ऊतक समाधान मिश्रण हस्तांतरण में निर्मित नमूना हदबंदी के लिए रोटार। उपकला कोशिकाओं के बेसल पहलू के चारों ओर और श्लैष्मिक पटल Propria की गैर सेलुलर अंश रूपों जो बाह्य मैट्रिक्स अलग कर देना कोलैजिनेज़ का प्रयोग करें।
  5. कसकर बंद ट्यूब और dissociator (जैसे, GentleMACs) की आस्तीन पर यह उल्टा देते हैं। लैब टी के लिए उपयोग नहीं है, तोवह उपकरण aforementioned तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक पाचन कदम के समय में वृद्धि।
  6. कार्यक्रम h_tumor_01 चलाने के लिए, एक पूर्व निर्धारित प्रोफ़ाइल मशीन (- रन प्रति 268 राउंड के साथ 4,000 आरपीएम लेकर रुक-रुक कर दालों के साथ 36 सेकंड की कुल अवधि, 1000 से) के साथ शामिल थे।
  7. कार्यक्रम की समाप्ति के बाद, dissociator से ट्यूब अलग।
  8. 140 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर निरंतर रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए नमूना सेते हैं। नोट: ऊतकों के नमूनों की मात्रा बदलती के लिए, पाचन के समय आनुपातिक कम या बढ़ाया जा सकता है (यानी, ऊतक की बड़ी मात्रा में अतिरिक्त समय की आवश्यकता हो सकती है)।
  9. Dissociator की आस्तीन पर उल्टा ट्यूब संलग्न।
  10. (- रन प्रति 235 राउंड के साथ, 4000 आरपीएम 1000 से लेकर रुक-रुक कर दालों के साथ, 37 सेकंड की कुल अवधि) चुनें और कार्यक्रम h_tumor_02 चलाते हैं।
  11. कार्यक्रम की समाप्ति के बाद, dissociator से ट्यूब अलग।
  12. DNase शेयर समाधान के 50 μl जोड़ें। / अलग कर देना मृत कोशिकाओं और clumping सेल की ओर जाता है कि सेलुलर मलबे के डीएनए अंश को हटाने के लिए DNase का प्रयोग करें।
  13. 60 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर निरंतर रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
  14. फिर dissociator की आस्तीन पर उल्टा ट्यूब संलग्न।
  15. (- रन प्रति 168 राउंड के साथ, 4000 आरपीएम 1000 से लेकर रुक-रुक कर दालों के साथ, 37 सेकंड की कुल अवधि) चुनें और कार्यक्रम h_tumor_03 चलाते हैं।
    नोट: ऊतक पूरी तरह से पचा नहीं है, तो 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 250 × छ पर अपकेंद्रित्र, सेल हदबंदी समाधान के 2 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, resuspend त्यागने और 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  16. बाँझ 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं।
  17. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 250 × छ पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला।
  18. धो सेल सीए 2/2 मिलीग्राम + बिना दो बार HBSS के 25 एमएल के साथ गोली और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  19. पिछले करने से पहले थाज, प्रयोगशाला में उपलब्ध एक स्वचालित सेल गिनती प्रणाली का उपयोग कर या मैन्युअल hemocytometer का उपयोग सेल संख्या गिनती। एमएफ प्राथमिक संस्कृति पीढ़ी के लिए विश्लेषण के लिए, कदम 3.19.1 के लिए आगे बढ़ना या कदम 3.19.2 के लिए आगे बढ़ना प्रवाह cytometry का उपयोग म्यूचुअल फंड की छँटाई।
    1. अलगाव और शुद्ध एमएफ संस्कृति के विकास (चित्रा 1) के लिए, मीडिया के 3 मिलीलीटर में 4 एक्स 10 6 कोशिकाओं को बीज के लिए जरूरत fibroblast अलगाव मीडिया की उचित मात्रा में पिछले centrifugation, resuspend सेल गोली से सतह पर तैरनेवाला त्यागें प्रति कुएं में 6 अच्छी तरह से, सेल संस्कृति का इलाज प्लेटें। 3.20 कदम आगे बढ़ें।
    2. विश्लेषण के लिए या प्रवाह cytometry 24 में fibroblast अलगाव मीडिया के 2 मिलीलीटर में 2 एक्स 10 6 तक को जगह ठीक है, कम-बाध्यकारी थाली और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते का उपयोग कर म्यूचुअल फंड की छँटाई। इस enzymatic प्रक्रिया से प्रभावित हो सकता है कि कोशिका की सतह एपिटोप्स बहाल करने के लिए है। फिर सेल निलंबन इकट्ठा करने और बरामद कोशिकाओं की गिनती और आगे बढ़ेंऔर immunostaining के लिए विश्लेषण 8 प्रवाह cytometry।
  20. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित। 80% मिला हुआ एमएफ monolayer ~ का गठन (चित्रा -1 ई) तक - 3 दिन हर 2 मीडिया बदलें।
  21. पारित होने के 6 अच्छी तरह से थाली से अनुपात 1 पर साथ T25 बोतल में कोशिकाओं: 1 और ~ 10 के लिए विकसित - 100% confluency - fibroblast वृद्धि मीडिया में 14 दिनों में 80 को प्राप्त करने के लिए।
  22. 2: 1 के अनुपात में T75 कोशिकाओं को T25 से कोशिकाओं passaging द्वारा संस्कृति का विस्तार करें। कोशिकाओं confluency तक पहुँचने के बाद, पहले 5 वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा उपयोग कर अलग एमएफ पवित्रता के विश्लेषण के लिए एक कुप्पी का उपयोग करें। 3: 1 के अनुपात में एमएफ संस्कृति का एक और T75 कुप्पी रुक या मार्ग।
    नोट: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentin + α-एसएमए + CD90 +: प्रवाह cytometry से विश्लेषण करते हैं, यह mesenchymal मूल के सैनिक म्यूकोसा स्ट्रोमल एमएफ संस्कृति में बढ़ निम्नलिखित फेनोटाइप होगा जब कि उम्मीद है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस enzymatic पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम लगातार अलग-थलग और सैनिक शल्य नमूनों और बायोप्सी (चित्रा 1) से एमएफ आबादी पेट CD90 + श्लैष्मिक स्ट्रोमल कोशिकाओं को विकसित करने में सक्षम है। 6 अच्छी तरह प्लेटें (चित्रा 1 ए-बी) में मोनोन्यूक्लियर सेल निलंबन बोने के बाद 5 - दिखाई एमएफ कॉलोनी प्रसार 2 दिन पर मनाया जा सकता है। एमएफ प्राथमिक संस्कृतियों तक पहुँचने ~ 50 - 11 (चित्रा 1C-डी) - दिन 7 से 70% संगम।

आकृति 1
जमे हुए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऊतक से अलग 1. प्राथमिक पेशीतंतुकोशिकाएं (एमएफ) चित्रा। मानव म्यूचुअल फंड के एक 20x बढ़ाई मानव colonic म्यूकोसा की जमी नमूना से अलग किया। (ए) दिवस stromal कोशिकाओं की 2. पक्षपाती समूहों मौजूद हैं। (बी) के दिनों 4. विशेषता spindle- या stellate-सेल आकृति विज्ञान विकसित की है और आसानी से स्पष्ट है। fibroblast का घनत्व 14 दिन तक (सी) दिवस 7 और (डी) दिवस 10 (ई) पर बढ़ाने के लिए जारी, म्यूचुअल फंड की एक पूरी तरह से मिला हुआ monolayer नहीं है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

शल्य नमूनों (~ 10%, 1 टेबल) की ठंड पर श्लैष्मिक एकल कोशिका तैयार करने की व्यवहार्यता में मामूली कमी आई है। हालांकि, ठंड के साथ, ऊतक के जीवाणु / फंगल संक्रमण में कमी वहाँ भी मनाया जाता है और इसके परिणामस्वरूप, म्यूचुअल फंड संस्कृति पीढ़ी की दक्षता में वृद्धि हुई है।

सैनिक श्लैष्मिक पेशीतंतुकोशिकाएं के स्रोत Mucosa एकल कक्ष निलंबन तैयारी (एन = 11) की व्यवहार्यता * </ टीडी> एमएफ अलगाव क्षमता (एन = 11)
ताज़ा 88.32 ± 2.369 11 (82%) के 8 बाहर
फ्रोजन 78.64 ± 4.174 11 (100%) में से 11
* 0.4% trypan नीले समाधान धुंधला निम्नलिखित स्वचालित सेल काउंटर द्वारा निर्धारित रूप में व्यवहार्यता।

तालिका 1 व्यवहार्यता और Myofibroblast वसूली की क्षमता। जमे हुए ऊतकों बनाम ताजा।

कोशिकाओं अन्य श्लैष्मिक कोशिकाओं द्वारा कोई संदूषण सुनिश्चित करने के क्रम में, दो मार्ग के लिए कम से कम प्रचारित किए जाने के बाद उत्पन्न एमएफ संस्कृति की पवित्रता विश्लेषण किया गया था। Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, यह म्यूचुअल mesenchymal सेल वंश CD90 और vimentin, और ए एल एस के मार्कर के लिए सकारात्मक थे कि प्रदर्शन किया गयाओ α-SMA, विभेदित mesenchymal कोशिकाओं के एक मार्कर (चित्रा 2)।

चित्र 2
चित्रा 2 अलग कक्षों में पहले 9 वर्णित के रूप में तंतुकोशिका आकार और पृथक एमएफ monolayer के एक्सप्रेस एमएफ मार्करों। Immunostaining, 1% paraformaldehyde के साथ तय immunostained और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया संस्कृति में कम से कम दो बार passaged है। Vimentin नीले रंग में और CD90 ((लाल रंग में एमएबी, क्लोन RV202 द्वारा पता लगाया, के रूप में) द्वारा पता लगाया, के रूप में:, और mesenchymal मार्कर (murine एमएबी क्लोन 1A4 द्वारा पता लगाया, के रूप में हरे रंग में) अलग कक्षों myofibroblast के एक मार्कर, एक-एसएमए व्यक्त murine एमएबी, क्लोन 5E10)। मर्ज किए गए छवि में, नारंगी / पीले कोशिकाओं को एक-एसएमए और vimentin के सह स्थानीयकरण प्रतिनिधित्व करते हैं; बैंगनी vimentin और CD90 के सह स्थानीयकरण का प्रतिनिधित्व करता है। दलीलों ई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस डाटा प्रवाह cytometry विश्लेषण (चित्रा 3) द्वारा पुष्टि की गई। जैसा कि पहले बताया, सैनिक म्यूकोसा से अलग सामान्य म्यूचुअल भी hematopoietic निर्माताओं CD45 और CD31, साथ ही उपकला मार्कर, EpCAM 3, 5, 9 के लिए नकारात्मक रहे थे।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्राथमिक Myofibroblast (एमएफ) संस्कृतियों की प्ररूपी विशेषता। स्टडीज colonic म्यूकोसा से अलग प्राथमिक म्यूचुअल फंड पर प्रदर्शन किया और संस्कृति में कम से कम दो बार के passaged थे। Immunostaining, प्रवाह cytometry विश्लेषण के द्वारा पीछा किया, अलग कक्षों एमएफ phenotype है, α-SMA, और CD90 vimentin के लिए समान रूप से सकारात्मक रहे हैं कि पुष्टि की। उचित निर्धारण नियंत्रण अध्ययन में शामिल किया गया।arge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल एक संभावित कैंसर शकुन बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में stromal कोशिकाओं के महत्वपूर्ण बढ़ते महत्व के प्रकाश में, केवल अनुसंधान आवेदन के लिए विकसित किया गया था, वहीं बाद में उपयोग के लिए "" कार्यात्मक biospecimens फ्रीज करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। यह व्यक्तिगत दवा 10, 11 के विकास के लिए अग्रिम की सेवा के रूप में अतिरिक्त उपकरण काम आ सकता है, नैदानिक ​​biorepository के निर्माण के लिए एक अनूठा लाभ का प्रतिनिधित्व करता है। पहले से जमे हुए स्ट्रोमल संवहनी अंश से अलग वसा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के लिए रिपोर्ट के निष्कर्षों के लिए इसी प्रकार, हमने किया मार्करों और proliferative / प्रतिरक्षा / भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और म्यूचुअल फंड की चयापचय क्रिया जमे हुए श्लैष्मिक नमूनों से पृथक में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं देखा गया। 12 बहरहाल, हम इस तरह के बाह्य मार्कर बयान के रूप में गैर-परीक्षण प्रतिक्रियाओं में से कुछ, आदि भिन्न हो सकते हैं कि बाहर नहीं करते । इस प्रकार, अज्ञात के साथ काम करने का उन मामलों में / unreरखी घटनाओं, जांचकर्ताओं म्यूचुअल एक ही व्यक्ति के जमे हुए हैं और ताजा ऊतक से अलग करने में विशेष समारोह पक्ष द्वारा साइड परीक्षण किया जाएगा, जिसमें एक तुलना प्रयोग सेट कर सकते हैं।

myofibroblast अलगाव के तरीकों के लिए तकनीक के बहुमत या तो chelating एजेंट के साथ इलाज [ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), डीएल-dithiothreitol (डीटीटी)] या कोलेजनोलिटिक और एंजाइमों 13-14 के साथ संयुक्त ऊतक के यांत्रिक नख़रेबाज़ के उपयोग पर तो आधारित हैं । यह पहले से पेट से म्यूचुअल फंड की उस पीढ़ी की सूचना मिली थी, छोटी आंत और पेट के शुरू में यांत्रिक नख़रेबाज़ और chelating एजेंट 5, 6 के आवेदन पर आधारित है, जो महीदा एट अल द्वारा वर्णित परिणाम विधि का उपयोग कर कुशल था। इधर, एक अतिरिक्त एंजाइमी जमे हुए ऊतक नमूनों से म्यूचुअल फंड के प्राथमिक संस्कृतियों की पीढ़ी की अनुमति देता है कि विधि की सूचना दी है। तकनीक-परिणाम और enzymatic दोनों पाचन-कर रहे हैं जबकिआमाशय, छोटी आंत और colonic ऊतक से प्राथमिक पेशीतंतुकोशिकाओं के अलगाव में समान रूप से प्रभावशाली है, अभी भी संवर्धित कोशिकाओं उनके vivo फेनोटाइप की रक्षा पर कि क्या वैज्ञानिक समुदाय के भीतर वहाँ बहस है। इस पांडुलिपि में सूचना तकनीक प्राथमिक एमएफ संस्कृति का न केवल उत्पादन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी सैनिक म्यूकोसा 15-17 में प्रस्तुत अलग सेल आबादी के पूर्व vivo विश्लेषण परमिट। इस ऊतक और वे व्यक्त मार्कर के साथ उनके रिश्तेदार बहुतायत का निर्धारण भी शामिल है, लेकिन यह भी कार्यात्मक assays (जैसे, enzymatic गतिविधि या साइटोकाइन उत्पादन) में उपयोग के लिए। ऊतक के भीतर म्यूचुअल फंड के रिश्तेदार बहुतायत एक की तुलना में जब (अर्थात्, EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentin + α-एसएमए + CD90 +) म्यूचुअल फंड और उनकी उपस्थिति बढ़ाता लिए अद्वितीय मार्करों के आधार पर कोशिकाओं छँटाई द्वारा FACS का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता अगर जरूरत हो तो सभी का कुल हौसले से एक अलग प्रकार की कोशिकाओं के साथ तुलनात्मक अनुपात ऐसा करके, कोशिकाओं को अलग किया या। प्रभावकारिता के बावजूदव्यवहार्य सेल अलगाव की, enzymatic पाचन के आधार पर इस और अन्य प्रोटोकॉल का एक उल्लेखनीय सीमा है कि कोशिका की सतह एपिटोप्स बदल सकता कार्यरत एंजाइम की प्रोटिओलिटिक गतिविधि। इस पर काबू पाने के लिए, हम एपिटोप्स उनकी predigested राज्य को इसी तरह से फिर से व्यक्त किया जा करने के लिए कोशिकाओं क्रम में हे / एन ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं।

हम लगातार सेल व्यवहार्यता का कम से कम नुकसान के साथ जमे हुए ऊतकों से एमएफ संस्कृति पैदा करने में सक्षम हो गया है। जमे हुए नमूना से इन संस्कृतियों ठीक करने की क्षमता शोधकर्ताओं हेरफेर और बेहतर रात के दौरान या नियमित रूप से काम के घंटे के बाहर प्राप्त शल्य चिकित्सा और / या इंडोस्कोपिक ऊतक नमूनों को संरक्षित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, कारण जमने की प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरियल और / या फंगल contaminants के लिए खरीदे, उपयोगी ऊतक के नुकसान में कमी के लिए एक अतिरिक्त लाभ के रूप में कार्य करता है। जो संवर्धन के बाद मानक asepti का उपयोग जारी रखने चाहिए, 3 अंश - अलगाव के बाद, एंटीबायोटिक का उपयोग केवल पहले 2 तक ही सीमित होना चाहिएसी तकनीक और विरोधी mycotic / विरोधी माइकोप्लाज्मा एजेंट मुक्त मीडिया। सेलुलर संस्कृति में इन एजेंटों के नियमित प्रयोग cytoxic प्रभाव, अर्थात् सेल के विकास, सेलुलर अध: पतन, और इस अवसर पर, मृत्यु 18 लागू करने के लिए दिखाया गया है।

प्रतिरक्षा कोशिकाओं, उपकला कोशिकाओं, और म्यूचुअल फंड: सहित सैनिक पटल Propria में मौजूद कई सेल आबादी निकलेगा enzymatic पाचन। पहले पारित होने के बाद, केवल म्यूचुअल रहेगा और, साथ ही मार्कर विश्लेषण (CD90, एक-SMA, और vimentin सकारात्मक की सेल विशिष्ट पैनल के माध्यम से उनके अद्वितीय फेनोटाइप (चित्रा 1) से पहचाना जा सकता है, लेकिन उपकला और hematopoietic के लिए नकारात्मक यह व्यापक रूप से myofibroblasts ऐसे जीर्ण सूजन और कैंसर जैसे रोग राज्यों में, सामान्य मेजबानी में mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से पैदा होती है कि स्वीकार कर लिया है, वहीं मार्कर) 3, 5, 9।, म्यूचुअल फंड की एक उप-जनसंख्या एक्सप्रेस उपकला या hematopoietic मार्कर 3 दिखाया गया है। इन निष्कर्षों को संभवतः होने का सुझाव दिया गया हैकोशिकाओं immunostained और ऊपर चर्चा मार्करों के लिए फ्लो से विश्लेषण कर रहे हैं, तो उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT) या hematopoietic वंश 3, 19 से निकाली गई fibrocytes की भर्ती का नतीजा है। इसके अलावा, अतिरिक्त सावधानी से किया जाना चाहिए। हम कोशिकाओं गैर पक्षपाती प्लेटों में incubated हौसले से पचा ऊतक से हे / एन ठीक करने के लिए अनुमति देने के बाद एक मुद्दा होना मिलान नुकसान नहीं मिला है, वहीं की टुकड़ी के दौरान trypsin या किसी अन्य प्रोटिओलिटिक एंजाइम का उपयोग करते समय, एपिटोप्स का नुकसान कर सकते हैं होता थाली से कोशिकाओं। इस प्रकार, इस समस्या से बचने के लिए, हम पक्षपाती एमएफ संस्कृतियों प्रवाह cytometry विश्लेषण के द्वारा पीछा immunostaining के लिए इरादा कर रहे हैं जब इस तरह के EDTA के रूप में chelating एजेंट के साथ एक सेल हदबंदी समाधान का उपयोग करने के लिए सलाह देते हैं। पेशीतंतुकोशिकाओं के एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना की है, के बाद कोशिकाओं को फिर फ्रीज मीडिया में जमे हुए हैं और तरल नाइट्रोजन में संग्रहित किया जा सकता है। 15 - इन कोशिकाओं को 14 लगभग जब तक इन विट्रो प्रयोगों की एक सरणी में इस्तेमाल किया जा सकतामार्ग, जो समय के बाद कोशिकाओं senesce और खारिज किया जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEM, 1x Corning MT-10-010-CV
Hanks' Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H6648
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
Antibiotic-Antimycotic, 100x Gibco 15240-062
Ciprofloxacin HCl Corning 61-277-RF
L-Glutamine, 100x Corning 25-005-CI
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-CI
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max Sigma-Aldrich D2650
DL-Dithiothreitol solution (DTT) Sigma-Aldrich 646563
0.5 M EDTA, pH 8.0 Cellgro 46-034-CI
DNAse Worthington LS002139
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I Sigma-Aldrich C1639
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II Sigma-Aldrich C1764
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV Sigma-Aldrich C5138
Accumax cell dissociation solution Sigma-Aldrich A7089
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
Cell Strainer (70 µm) Corning 352350
PE Mouse Anti-Human Vimentin BD Biosciences 562337 Clone RV202
FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma-Aldrich F3777 Clone 1A4
APC Mouse Anti-Human CD90 BD Biosciences 559869 Clone 5E10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
  2. Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
  3. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
  4. Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
  5. Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
  6. Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
  7. Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
  8. Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
  9. Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
  10. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  11. Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
  12. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
  13. Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).
  14. Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).
  15. Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
  16. Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
  17. Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
  18. Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
  19. Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 107, जमे हुए जठरांत्र संबंधी मार्ग मानव mesenchymal stromal कोशिकाओं
मानव जमे हुए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल नमूनों से सीडी 90+ तंतुकोशिका / पेशीतंतुकोशिकाएं का अलगाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, P., Beswick, E. J., Chao,… More

Johnson, P., Beswick, E. J., Chao, C., Powell, D. W., Hellmich, M. R., Pinchuk, I. V. Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens. J. Vis. Exp. (107), e53691, doi:10.3791/53691 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter