Abstract
Fibroblaster / myofibroblasts (MFS) har vært å få økt oppmerksomhet for sin rolle i patogenesen og deres bidrag til både sårheling og promotering av svulsten mikromiljøet. Mens det i dag flere teknikker for isolering av MFS gastrointestinale (GI) vev, innfører denne protokollen et nytt element i isolering av disse stromale celler fra frosset vev. Frysing GI vevsprøver ikke bare tillater forskeren å skaffe prøver fra hele verden kollaboratører, biobanker, og kommersielle leverandører, også tillater det forsinket behandlingen av ferske prøver. Den beskrevne protokollen konsekvent vil gi karakteristiske spindelformede celler med MF fenotype som uttrykker markørene CD90, α-SMA og vimentin. Når disse cellene er avledet fra pasientprøver, bruk av primære celler gir også fordelen av nært etterligner MFS av sykdomstilstander, nemlig cancer og inflammatoriske tarmsykdommer. Denne teknikken har been validert i mage, tynntarm, og colonic MF primære kultur generasjon. Primære kulturer MF kan brukes i en lang rekke forsøk i løpet av en del av passasjen, og deres renhet bestemt ved både immunocytokjemi og strømningscytometri-analyse.
Introduction
Myofibroblasts / fibroblaster (MFS) representerer et rikt populasjon av celler i gastrointestinal (GI) slimhinnen. Disse stromale celler er plassert like under epitel og danner et sammenkoplet nettverk innen mucosal lamina propria i tarmen. MFS er ikke bare ansvarlig for avsetning av den ekstracellulære matrise, men gjennom parakrine regulering kan påvirke elektro transport, restitusjon, og barrierefunksjon av tilstøtende epitel 1, 2. Videre har MFS vist seg å spille en nøkkelrolle i betennelse og vev remodeling 3, 4. myofibroblasts er en kritisk del av svulsten mikromiljøet, hvor de er også kjent som kreft-assosiert fibroblaster, og bidra til at tumorcellevekst, og tjene som en nisje for kreft stamceller 3. Emerging data antyder at MFS kan også fungere som lokale antigenpresenterende celler. I tillegg MFS funksjon som viktige regulatorer av medfødte og ervervede immunresponser, procing et utvalg av cytokiner og vekstfaktorer 5.
Hos friske individer, er MFS celler antas å skille fra stamceller og uttrykker på sin celle overflaten, mesenchymale markør, CD90 3, 5. Disse cellene er også positivt for vimentin, men negativt for epitel og blodkreft cellemarkør, EpCAM og CD45 hhv. Myofibroblasts er foreslått å være en aktivert form av fibroblaster, og kan skilles fra ikke-aktiverte fibroblaster ved ekspresjon av α-SMA-5.
I løpet av det siste tiåret, flere tilnærminger for isolering av myofibroblasts fra menneskelige colonic slimhinnene er publisert-hovedsakelig basert på metoden opprinnelig beskrevet av Mahida et al. 5-8. Mens individuelle studier rapporterer isoleringsprosedyrer fra forskjellige tarmslimhinnen, ikke universell protokoll for isolering av MFS fra flere områder av mage-tarmkanalen (dvs. mage, liten og large tarmslimhinnen) har blitt publisert. Protokollen som presenteres her er testet og med hell anvendt for alle tre typer vev som er nevnt ovenfor. . Videre prosedyrer for å isolere MFS fra frosne GI slimhinnen har ikke blitt rapportert.
Her presenterer vi en optimalisert metode, som er basert på enzymatisk fordøyelse, og samtidig gjør det mulig for isolering av humane tarmslimhinne MFS for kultur og strømningscytometri-analyse i fersk-fordøyd, encellede, slimhinne preparater. Denne teknikken pålitelig gir primærkulturer med en MF fenotype. Videre kan de samme metoder benyttes for å isolere MFS fra frosne prøver av mage og tynntarms vev i tillegg. Isolering av myofibroblasts fra friskt vev GI er tidligere beskrevet; Men utnyttelsen av frosne prøver presenterer mange fordeler. Nemlig, vil forskerne kunne samle inn og lagre vev fra en rekke samarbeidspartnere over hele verden som har capabiheten til å sende frosne vevsprøver. Videre kan forskerne finne innsamling av kasserte vev fra operasjonsstuen og / eller endoskopi suite og umiddelbar behandling av vev for isolering til konflikt med sin nåværende eksperimentering tidsplan. Også, på grunn av uforutsigbare natur kirurgi, kan vev anskaffelser forekomme svært sent på dagen, noe som vil begrense tid igjen til behandling vev. Frysing vev for senere behandling vil lindre disse utfordringene.
Til slutt, har disse fremgangsmåter blitt anvendt i isoleringen av kolon, mage og tynntarms myofibroblasts i sykdomstilstander så som kolorektal karsinom og inflammatoriske tarmsykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for å få forkastet menneskelig vev fra kirurgiske pasienter og etablering av primærkulturer ble godkjent av University of Texas Medical Branch og University of New Mexico Institutional Review Boards. De generelle krav til innkjøp av menneskelige vevsprøver er beskrevet nedenfor. Merk at siden MFS kan isoleres fra frosset vev, biobanker og kommersielle leverandører er også levedyktige alternativer.
1. Få menneskelig vev
- Send en protokoll for å oppnå menneskelig kolon vev til Institutional Review Board for godkjenning.
- Etablere samarbeid med generell kirurgi og / eller kolorektal kirurger for å oppnå humant vev for forskning. Samarbeid med patologi Avdelingen er også obligatorisk som de skal bestemme vev som ikke er nødvendig for diagnose og kan betegnes for forskning.
- Råde patologen å gi vev fra svulst og deretter grossly normal slimhinne minst 5 cm fra tumor. Umiddelbart plassere prøvene i iskalde vaske media og legg på is. Patologen vil bestemme mengden av vev som kan trygt gis til forskning. Den minimale vev er nødvendig for MF isolasjon er 1,5 mm 2.
- Bruk oppnådde vev enten umiddelbart å etablere den primære kulturer eller fryse og plasseres ved -80 ° C for fremtidig isolasjon.
- Hvis frysing for senere isolasjon, kuttet vevet inn i ca 1 - 2 mm 2 stykker, legg inn en kryogenisk rør med 1 ml fryse media (se nedenfor), og oppbevar ved -80 ° C. Merk: Utnytte denne protokollen, har vellykket isolering av MFS fra vev frosset i over 4 år blitt observert.
2. Forbered Reagenser
- For Kollagenase løsning: Fremstill 100 U / ml kollagenase I, II og IV i Hanks balanserte saltløsning (HBSS) med Ca2 + / Mg2 + (se Materialer tabell
- Forbered Vannbasert DNase stamløsning 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
- Forbered Wash media: (MEM: 89 ml, Antibiotika-fungal, 100x: 1 ml; varmeinaktivert FCS: 10 ml)
- Forbered fibroblast vekstmedier: MEM: 500 ml flaske; L-glutamin (200 mM): 5 ml; MEM ikke-essensielle aminosyrer, 100x løsning: 5 ml; ciprofloksacin HCl (10 mg / ml): 570 mikroliter; Antibiotika-fungal, 100x løsning: 10 ml; natriumpyruvat (100 mM): 5 ml; varmeinaktiverte FCS: 50 ml
- Forbered Freeze middel: Fibroblast vekstmedier (Reagens 2,4) med tilsetning av 10% dimetylsulfoksid (DMSO), og deretter filtrere-sterilize med en 0,22 mikrometer filter.
3. Enzymatisk Digest menneskelig vev
- Hvis vevet ble frosset i frysemedier, sted kryoampulle i varm (~ 37 ° C) vann inntil vevet og media er tint.
- 4 - 5 av 2 mm to stykker av vevet, vevet vaskes to ganger med 10 ml HBSS uten Ca2 + / Mg2 +.
- Når vevet har avgjort av tyngdekraften, nøye kast supernatanten uten å spinne prøven.
- Tilsett 10 ml av kollagenase løsning til prøven, og overføre vev-løsningsblandingen inn i en steril, DNase / RNase-frie rør med innebygd rotorer for prøve dissosiasjon. Bruk kollagenase å dissosiere den ekstracellulære matriks som omgir den basale aspekt av epitelceller og danner ikke-cellulær fraksjon av slimhinne lamina propria.
- Tett tett rør og legge det opp ned på ermet av dissociator (f.eks GentleMACs). Hvis laboratoriet ikke har adgang til than tidligere nevnte utstyr, øke tiden for hver fordøyelsen steg for å få sammenlignbare resultater.
- Kjør Program h_tumor_01, inkludert en pre-set profil med maskinen (total varighet på 36 sek, med intermitterende pulser som strekker seg fra 1000 - 4000 rpm, med 268 runder per løp).
- Etter avslutning av programmet, løsne røret fra dissociator.
- Inkuber prøven i 45 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotasjon på rystemaskin ved 140 rpm. Merk: For varierende mengder av vevsprøver, kan tidspunktet for fordøyelsen reduseres proporsjonalt eller økt (dvs. større mengder vev kan kreve ekstra tid).
- Fest røret opp ned på ermet av dissociator.
- Velg og kjør programmet h_tumor_02 (total varighet på 37 sek, med intermitterende pulser som strekker seg fra 1000 - 4000 rpm, med 235 runder per løp).
- Etter avslutning av programmet, løsne røret fra dissociator.
- Tilsett 50 ul av stamløsningen DNase. Bruk DNAse å distansere / fjerne døde celler og DNA brøkdel av mobilnettet rusk som fører til celle klumper.
- Inkubere prøven i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotasjon på rystemaskin ved 60 rpm.
- Fest røret opp ned på ermet av dissociator igjen.
- Velg og kjør programmet h_tumor_03 (total varighet på 37 sek, med intermitterende pulser som strekker seg fra 1000 - 4000 rpm, med 168 runder per løp).
Merk: Hvis vevet ikke blir fullstendig brutt, sentrifuger ved 250 x g i 10 minutter ved 20 ° C, kast supernatant, resuspender i 2 ml celledissosiasjon løsning og inkuberes ved romtemperatur i 10 min. - Passere cellesuspensjonen gjennom sterile 70 mikrometer celle sil.
- Sentrifuger cellesuspensjon ved 250 x g i 10 minutter ved 20 ° C. Aspirer supernatanten helt.
- Vask cellepelleten to ganger med 25 ml HBSS uten Ca2 + / Mg2 + og kast supernatant.
- Før den siste varh, telle celle nummer ved hjelp av en automatisert celletelling systemet tilgjengelig i laboratoriet eller manuelt med hemocytometer. For MF primære kultur generasjon fortsette for trinn 3.19.1, til analyse eller sortering av MFS ved hjelp av flowcytometri fortsette for trinn 3.19.2.
- For isolering og vekst av ren MF kultur (figur 1), forkaste supernatanten fra siste sentrifugeringen, resuspender cellepelleten i passende mengde fibroblast isolasjonsmedier som trengs for å seede opp til 4 x 10 6 celler i 3 ml av media per brønn i 6 godt, cellekultur-behandlede plater. Gå videre til trinn 3.20.
- For analyse eller sortering av MFS ved hjelp av flowcytometri, plassere opptil 2 x 10 6 i 2 ml fibroblast isolasjon media i 24 vel, lav bindingsplate og inkuberes O / N ved 37 ° C med 5% CO 2. Dette er for å gjenopprette celleoverflaten epitoper som kan bli berørt av den enzymatiske prosedyren. Så samle cellesuspensjonen og telle gjen celler og fortsettfor farging og strømningscytometri-analyse 8.
- Dyrke cellene ved 37 ° C med 5% CO2. Endre media hver 2 - 3 dager før dannelsen av ~ 80% sammenflytende MF enkeltlag (figur 1D-E).
- Passage celler i T25 kolber med fra seks brønn plate med forholdet 1: 1 og vokse for ~ 10 - 14 dager i fibroblast vekstmedier for å oppnå 80-100% confluency.
- Utvide kultur ved aging celler fra T25 til T75 cellene ved forholdet 1: 2. Når cellene når konfluens, bruke en kolbe for analyse av isolert MF renhet ved hjelp av flow cytometri som beskrevet tidligere 5. Fryse eller passasje annen T75 kolbe MF kultur på forholdet 1: 3.
Merk: Når analysert av flowcytometri, er det forventet at GI slimhinnen stromal MF av mesenchymale opprinnelse når det vokser i kultur vil ha følgende fenotype: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentin +, α-SMA +, CD90 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne enzymatisk fordøyelse protokollen, vi har gjennomgående vært i stand til å isolere og dyrke MF populasjon tarm CD90 + slimhinne stromale celler fra GI kirurgiske prøver og biopsier (figur 1). Synlig MF koloni spredning kunne observeres på dag 2 - 5 etter seeding mononukleære cellesuspensjoner inn i 6 brønners plater (Figur 1A-B). MF primærkulturer nå ~ 50 - 70% samløpet av dagen 7. - 11. (figur 1C-D).
Figur 1. Primære myofibroblasts (MFS) isolert fra Frozen Gastrointestinal Tissue. En 20X forstørrelse av menneskelig MFS isolert fra frosne eksemplar av menneskets tarmslimhinnen. (A) Dag 2. Adherente klynger av stromale celler er til stede. (B) Days 4. Den karakteristiske spindle- eller stellate-cellemorfologi har utviklet og er lett synlig. Tettheten av fibroblast fortsette å øke på (C) Dag 7 og (D) Dag 10. (E) By Day 14, er det en helt konfluent monolag av MFS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Det er en liten nedgang i levedyktigheten for mukosal enkeltcellepreparat ved frysing av kirurgiske prøver (~ 10%, tabell 1). Imidlertid, med frysing, er det også en reduksjon i det bakterielle / soppforurensning av vevet observert, og følgelig en økning i effektiviteten av MF kulturen generasjon.
| Kilde til GI slim myofibroblasts | Levedyktighet * av Mucosa enkelt celle Suspension preparat (n = 11) </ td> | MF Isolation Effektivitet (n = 11) |
| Fersk | 88,32 ± 2,369 | 8 av 11 (82%) |
| Frossen | 78,64 ± 4,174 | 11 av 11 (100%) |
| * Levedyktighet bestemt ved automatisert celleteller følgende 0,4% trypanblått-oppløsning farging. | ||
Tabell 1. Livskraftig og effektivitet av Myofibroblast Recovery. Fresh vs. frosset vev.
Renheten av genererte MF kultur ble analysert etter celler ble formert i det minste for to passeringer, for å sikre at ingen forurensning av andre slimhinneceller. Ved hjelp av konfokal mikroskopi, ble det vist at MFS var positive for den markør av mesenchymale cellen avstamning CD90 og vimentin, og also α-SMA, en markør for den differensierte mesenchymale celler (figur 2).
Figur 2. isolerte celler Har Fibroblast Shape og Express MF Markers. Farging av isolert MF monolag, passaged minst to ganger i kultur ble fiksert med 1% paraformaldehyde, immunostained og analysert av konfokalmikroskopi som tidligere beskrevet ni. Isolerte celler uttrykte en markør for myofibroblast, a-SMA (i grønt, som oppdaget av murine mAb klone 1A4), og mesenchymale markører: vimentin (i rødt, som oppdaget av mAb'et, klone RV202) og CD90 (i blått, som oppdaget av murine mAb'et, klone 5E10). I det sammenslåtte bildet, orange / gule celler representerer samlokalisering av a-SMA og vimentin; lilla representerer samlokalisering av vimentin og CD90. Pleas e Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Disse data ble bekreftet ved strømningscytometri-analyse (Figur 3). Som tidligere rapportert, normale MFS isolert fra mage-slimhinnen var også negative for hematopoetiske ende CD45 og CD31, samt epithelial markør, EpCAM 3, 5, 9.
Figur 3. Fenotypisk Karakterisering av primær Myofibroblast (MF) kulturer. Studier ble utført på primær MFS isolert fra tarmslimhinnen og passert minst to tid i kultur. Farging, etterfulgt av strømningscytometri-analyse bekreftet at den isolerte cellene har MF fenotype er jevnt positive for vimentin, α-SMA, og CD90. Passende isotype kontroller ble inkludert i studien.arge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens denne protokollen ble utviklet for forskning programmet kun i lys av økende kritiske viktigheten av stromale celler som et potensielt kreft prognostiske biomarkører og terapeutisk mål, evne til å fryse "funksjonelle" biospecimens for senere bruk gir en betydelig fordel. Dette representerer en unik fordel for etablering av klinisk biorepository, som kan tjene som ekstra verktøy som tjener til å fremme utviklingen av personlig medisin 10, 11. I likhet med funn tidligere rapportert for adipose-avledet mesenchymale stamceller isolert fra frosset stromal vaskulær brøkdel, vi gjorde ikke observert noen signifikante endringer i markører og proliferative / immun / betennelsesresponser og metabolsk aktivitet i MFS isolert fra frosne slimhinneprøver. 12 Men vi utelukker ikke at noen av ikke-testet responser som ekstracellulært markør deponering, etc. kan variere . Derfor, i de tilfeller jobbe med ukjent / unreMeldte hendelser, kan forskere sette opp et sammenligningsforsøk, hvor den bestemte funksjon vil bli testet side-ved-side i MFS isolert fra frosset og friskt vev fra det samme individ.
De fleste av teknikkene for myofibroblast isoleringsmetoder er basert enten på bruk av mekanisk hakking av vevet kombinert med behandling enten med chelateringsmidler [ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA), DL-ditiotreitol (DTT)] eller kollagenolytisk og proteolytiske enzymer 13-14 . Det ble tidligere rapportert at generering av MF fra magen, tynntarmen og tykktarmen var effektiv ved hjelp av utveksten metoden opprinnelig beskrevet av Mahida et al, som er basert på mekanisk hakking og anvendelse av chelateringsmidler 5, 6. Her er en ytterligere enzymatisk fremgangsmåte som tillater generering av primære kulturer av MFS fra frosne vevsprøver er rapportert. Mens både teknikker-utvekst og enzymatisk fordøyelse-erlike effektive ved isolering av primære myofibroblasts fra mage, tynntarm, og tarmvev er det fortsatt debatt innenfor fagmiljøet om dyrkede celler bevare sin in vivo-fenotype. Teknikken rapportert i dette manuskriptet muliggjør ikke bare dannelse av primær MF kultur, men også tillater ex vivo analyse av forskjellige cellepopulasjoner som er presentert i GI mucosa 15-17. Dette inkluderer å bestemme deres relative overflod med vev og markørene de uttrykker, men også for bruk i funksjonelle analyser (f.eks enzymatisk aktivitet eller cytokin produksjon). Relative overflod av MFS i vevet kan vurderes ved hjelp FACS ved å sortere cellene basert på markører unike til MFS (nemlig EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentin +, α-SMA +, CD90 +) og kvantifisere deres tilstedeværelse i forhold til en summen av alle nylig isolerte celler eller, om nødvendig, ved å gjøre sammenlignende forhold med forskjellige celletyper. Til tross for effektenav levedyktige celleisolasjon, er en bemerkelsesverdig begrensning av denne og andre protokoller basert på enzymatisk fordøyelse at den proteolytiske aktiviteten av enzym som anvendes, kan forandre celleoverflate epitoper. For å overvinne dette, lar vi cellene til å gjenopprette O / N for at epitoper for å bli re-uttrykkes på samme måte som deres predigested tilstand.
Vi har vært i stand til konsekvent å generere MF kultur fra frosset vev med minimalt tap av celle-levedyktighet. Muligheten til å gjenopprette disse kulturene fra frosne prøven tillater forskerne å manipulere og bedre bevare kirurgiske og / eller endoskopiske vevsprøver innhentet i løpet av natten eller ut av vanlige arbeidstimer. Videre reduksjon i tap av anskaffet, brukbare vev på grunn av bakterie- og / eller sopp forurensninger under fryseprosessen tjener som en ytterligere fordel. Etter isolasjon bør antibiotika bruk begrenses til kun de første 2 - 3 passasjer, hvoretter dyrking bør fortsette å bruke standard aseptic teknikk og anti-mykotisk / anti-mykoplasma middel-frie medier. Rutinemessig bruk av disse midlene i cellekultur har vist seg å utøve cytotoksiske effekter, nemlig cellevekst, celle degenerasjon, og til tider, død 18.
Enzymatisk fordøyelse vil gi flere cellepopulasjoner stede i GI lamina propria inkludert: immunceller, epitelceller og MFS. Etter den første passasje, vil bare MFS forbli og kan identifiseres ved deres unike fenotype (figur 1), så vel som gjennom celle-spesifikke panel av markør analyse (CD90, a-SMA, og vimentin positiv, men negativ for epitelisk og hematopoietiske markører) 3, 5, 9. Mens det er allment akseptert at myofibroblasts oppstå fra stamceller i normal vert, i sykdomstilstander som kronisk betennelse og kreft, har en undergruppe av MFS vist ekspress epitel eller blodkreft markører tre. Disse funnene har vært foreslått å muligens væreet resultat av epitelial-mesenchymale overgang (EMT) eller rekruttering av fibrocytt avledet fra blodkreft avstamning 3, 19. Videre bør ekstra forsiktighet brukes hvis cellene er immunostained og analysert av flowcytometri for markørene omtalt ovenfor. Selv om vi ikke har funnet epitope tapet til å være et problem etter at cellene til å gjenopprette O / N fra ferske fordøyd vev inkuberes i ikke-heftende plater, kan tapet av epitoper oppstår ved bruk av trypsin eller annen proteolytisk enzym under avløsning av celler fra platen. Derfor, for å unngå dette problemet, anbefaler vi å bruke i en celle dissosiasjon løsning med chelateringsmidler som EDTA når tilhenger MF kulturer er ment for farging, etterfulgt av flowcytometri analyse. Etter en primær kultur av myofibroblasts er etablert, kan cellene deretter frosset i frysemedier og lagret i flytende nitrogen. Disse celler kan anvendes i en rekke in vitro forsøk til ca. 14 - 15passasjer, etter som tiden cellene senesce og skal kastes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
