Abstract
Fibroblastlar / miyofibroblastlar (MFS) patogenezinde rolleri ve tümör mikro hem yara iyileşmesi ve promosyon katkıları için artan ilgi kazanmaktadır. Şu anda mide-bağırsak (GI) dokulardan MFS izolasyonu için bir çok teknik vardır, ancak bu protokol, dondurulmuş dokudan bu stromal hücrelerin izolasyonu için yeni bir elemanı getirmektedir. GI doku örneklerinin Donma sadece dünya işbirlikçileri, biyobankalar ve ticari satıcılardan örnekleri elde etmek için araştırmacı, aynı zamanda taze örneklerin gecikmeli işleme izin verir. Açıklanan protokol sürekli belirteçleri CD90, α-SMA ve vimentin ifade MF fenotip ile karakteristik iğ şekilli hücreler verecektir. Bu hücreler, hasta örneklerinden türetilmiş olarak, pil kullanımı aynı zamanda hastalık durumlarında-, yani kanser ve enflamatuar barsak hastalıkları arasından yakın taklit MFS'de yararı kazandırmaktadır. Bu teknik arı vardırn mide, ince bağırsak, kolon ve MF primer kültür nesil valide. Birincil MF kültürleri pasaj bir dizi üzerinden deney geniş bir dizi de kullanılabilir ve bunların saflığı hem immünositokimya değerlendirilmiş ve akış sitometri analizine.
Introduction
Miyofibroblastlar / fibroblastlar (MFS), gastrointestinal (Gİ) mukoza hücrelerinin bol nüfusu temsil etmektedir. Bu stromal hücreler sadece epiteli altında bulunan ve bağırsaktaki mukozal lamina propria içinde birbirine bir ağ oluştururlar. MFS olmayan hücre dışı matrisin birikmesine sadece sorumludur, ancak parakrin düzenleme içinden geçen bitişik epitel 1, 2 elektrolit taşıma, iadesini ve bariyer işlevini etkileyebilir. Dahası, MFS enflamasyon ve doku önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir 3, 4 biçimlenme. miyofibroblastlar onlar da kanserle ilişkili fibroblastlar olarak bilinir tümör mikro, kritik bir parçası olan ve tümör hücre büyümesine katkı ve kanser kök hücreleri 3 için niş olarak hizmet vermektedir. Ortaya çıkan veriler, MFS ayrıca yerel antijen sunan hücreler hizmet olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, MFS işlevi doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerinin önemli düzenleyiciler, süredensitokinler ve büyüme faktörleri 5 çeşitli dans ediyorum.
Sağlıklı bireylerde, MFS hücreleri Bu hücreler aynı zamanda vimentin için pozitif. Mezenkimal kök hücrelerinden ayırt ve hücre yüzeyinde, mezenkimal marker, CD90 3, 5 tarihinde ifade inanılmaktadır, ancak epitelyal ve hematopoetik hücre belirteci, EpCAM ve CD45 negatif sırasıyla. Miyofibroblastların fibroblastlar aktive edilmiş bir şekli olması önerilmektedir ve α-SMA 5 ifadesi ile aktif olmayan fibroblastlardan ayırt edilebilir.
Geçtiğimiz on yıl içinde, insan kolon mukozasının gelen miyofibroblastlar izolasyonu için birden yaklaşımlar yayınlanan-çoğunlukla başlangıçta Mahida ve ark., 5-8 açıklanan yönteme dayalı olarak oylandı. Bireysel çalışmalar, çeşitli bağırsak mukozasında, çoklu gastrointestinal alanlar (yani, mide, küçük ve l'den MFS izolasyonu için hiçbir evrensel protokolü izolasyon prosedürleri rapor ederkenARGE intestinal mukoza) yayınlanmıştır. Bu tarifnamede sunulan protokol test edilmiş ve başarılı bir şekilde, yukarıda belirtilen dokuların her üç tip kullanılmaktadır. . Ayrıca, dondurulmuş GI mukozasından MF oranı pratisyen izole edilmesi için prosedürlerin rapor edilmemiştir.
Burada, enzimatik sindirimi dayalı optimize edilmiş bir yöntem sunmak ve aynı zamanda kültür için insan bağırsak mukozal MFS izolasyonu sağlar ve taze sindirilmiş, tek hücre, mukozal hazırlıkları analiz akım sitometri. Bu teknik, güvenilir bir şekilde bir MF fenotipi olan primer kültürleri elde edilir. Bundan başka, aynı yöntemler yanı sıra, mide ve ince bağırsak dokularının dondurulmuş örneklerden MF oranı pratisyen izole etmek için kullanılabilir. Taze GI dokusundan rolü in izole edilmesi, daha önce tarif edilmiştir; Bununla birlikte, dondurulmuş örneklerin kullanımı birçok avantaj sunar. Yani, araştırmacılar capabi sahip dünya çapında işbirlikçileri herhangi bir sayıda toplamak ve depolamak dokuları mümkün olacaktırlity dondurulmuş doku örnekleri gemi. Ayrıca, araştırmacılar, mevcut deney programı ile çatışmaya izolasyon doku işleme ameliyathane ve / veya endoskopi paketi ve acil atılır doku toplama bulabilirsiniz. Ayrıca, cerrahi öngörülemeyen doğası nedeniyle, doku tedarik işleme doku için kalan süre sınırı, hangi çok geç gün oluşabilir. Daha sonra işlenmek için doku Donma bu zorlukları hafifleten.
Son olarak, bu yöntemler, başarılı şekilde kolorektal karsinom ve iltihaplı bağırsak hastalıkları gibi hastalık durumlarında, kolon, mide ve ince bağırsak rolü in izolasyon kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Atılan insan cerrahi hastaların doku ve primer kültürlerinde kurulmasını elde etmek için protokol Texas Medical Branch ve New Mexico Kurumsal İnceleme Kurulları Üniversitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. İnsan doku örneklerinin alımı için genel şartlar aşağıda açıklanmıştır. MFS donmuş dokunun, biyobankalar ve ticari satıcılardan izole edilebilir çünkü bu da uygun bir seçenek olduğuna dikkat edin.
1. İnsan Dokusu edinin
- Onay için kurumsal inceleme kuruluna insan kolon dokusu elde etmek için bir protokol gönderin.
- Araştırma için insan dokusu elde etmek amacıyla, genel cerrahlar ve / veya kolorektal cerrah ile işbirliği kurmak. Onlar tanı için gerekli değildir ve araştırma için belirlenmiş olabilir doku belirleyici olacak gibi patoloji bölümü ile işbirliği de zorunludur.
- Grossl sonra neoplazma doku sağlamak ve patolog önerintümörden y, normal mukoza en az 5 cm. Hemen buz soğukluğunda yıkama ortamı örnekleri yerleştirin ve buz üzerine yerleştirin. Patolog güvenli araştırma için verilebilir doku miktarını belirleyecektir. MF izolasyonu için gerekli olan minimum doku 1,5 mm 2 'dir.
- Gelecekteki izolasyonu için -80 ° C 'de primer kültürler ya da dondurma ve yeri oluşturmak için elde edilen doku ya hemen kullanın.
- -80 ° C'de dondurularak ortam (aşağıya bakınız), ve mağaza 1 ml kriyojenik bir tüp içine yerleştirin 2 mm 2 adet - daha sonra izole edilmesi için dondurma ise, yaklaşık 1 doku kesmek. Not: Bu protokol kullanarak, 4 yılı aşkın süredir donmuş dokudan MFS başarılı izolasyon gözlenmiştir.
2. Reaktifler hazırlayın
- Kollajenaz çözümü için: Ca2 + ile Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 100 U / ml kollajenaz I, II ve IV Hazırlama / Mg2 + (Malzeme bakınız Tablo
- 10 mg / ml (3.55 UA / mg) Su bazlı DNase stok çözelti hazırlayın.
- Yıkama ortamı hazırlayın: (MEM: 89 ml, antibiyotik antimikotik, 100x: 1 ml ısı ile inaktive edilmiş FCS: 10 mi)
- MEM: Fibroblast büyüme ortamı hazırlayın 500 ml şişe; L-glutamin (200 mM): 5 mi; MEM esansiyel olmayan amino asitler, 100x çözeltisi: 5 mi; siprofloksasin HCI (10 mg / ml): 570 ul; Antibiyotik antimikotik, 100x çözeltisi: 10 mi; sodyum piruvat (100 mM): 5 mi; ısı ile inaktive edilmiş FCS: 50 mi
- Dondurulmuş ortamı hazırlayın: Fibroblast büyüme ortamı,% 10 ilave Dimetil Sülfoksit (DMSO) ile (reaktif 2.4), daha sonra filtre edilir-ster0.22 um filtre ile ilize.
3. enzimatik Digest İnsan Doku
- Doku ılık (~ 37 ° C) suda donma medya, yer cryovial donmuş ise doku ve medya çözülmüş kadar.
- 4 için - doku 2 mm 2 adet 5, Ca2 + / Mg2 + olmaksızın iki kez HBSS 10 ml doku yıkayın.
- Doku yerçekimi tarafından yerleşmiş sonra, dikkatlice numuneyi sıkma yapmadan süpernatant atın.
- Örnek kolajenaz çözeltisi 10 ml ilave edilir ve steril bir DNase / RNase içermeyen bir tüp içine doku çözelti karışımı transferi yerleşik örnek ayrılması için rotorlar. Epitel hücrelerinin bazal yönünü çevreleyen ve mukozal lamina propria hücresel olmayan kısmını oluşturan hücre dışı matriks ayırmak için kollajenaz kullanın.
- Sıkıca kapatın tüp ve dissociator (örneğin, gentleMACS) koluna üzerine baş aşağı ekleyin. Laboratuar t erişimi yoksaO, ekipman yukarıda değindiğimiz karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için her sindirim aşamasının süresini artırın.
- Program h_tumor_01 çalıştırın önceden ayarlanmış profil makinesi (- vadede başına 268 mermi ile 4000 rpm, değişen aralıklı darbeleri ile 36 saniyelik toplam süresi, 1000 dan itibaren) ile birlikte.
- Programın sona ermesinden sonra, dissociator tüp ayırın.
- 140 rpm'de çalkalayıcı üzerinde sürekli dönme altında 37 ° C 'de 45 dakika boyunca örnek inkübe edin. Not: doku örnekleri değişen miktarlarda için, sindirim zaman orantılı olarak azaltılabilir veya arttırılabilir (yani, doku daha fazla miktarlar ise ek süre gerektirebilir).
- Dissociator koluna üzerine baş aşağı tüp takın.
- (- Vadede başına 235 mermi ile, 4000 rpm 1000 arasında değişen aralıklı darbeleri ile, 37 sn toplam süresini) seçin ve Program h_tumor_02 çalıştırın.
- Programın sona ermesinden sonra, dissociator tüp ayırın.
- DNaz stok solüsyonu 50 ul ekleyin. / Ayırmak ölü hücreleri ve topaklanma hücre açan hücresel enkaz DNA kısmını kaldırmak için DNAz kullanın.
- 60 rpm'de çalkalayıcı üzerinde sürekli dönme altında 37 ° C'de 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
- Yine dissociator koluna üzerine baş aşağı tüp takın.
- (- Vadede başına 168 mermi ile, 4000 rpm 1000 arasında değişen aralıklı darbeleri ile, 37 sn toplam süresini) seçin ve Program h_tumor_03 çalıştırın.
Not: doku tamamen sindirilmiş değilse, 20 ° C 'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj hücre ayrışma çözeltisi 2 ml süpernatant, tekrar süspansiyon atmak ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. - Steril 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin.
- 20 ° C 'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüje hücre süspansiyonu. Aspire tamamen süpernatanlarına.
- Yıkama hücresi Ca2 + / Mg2 + olmaksızın iki kez HBSS 25 ml pelet ve supernatant atın.
- Son öncesinde olduh laboratuvarda mevcut otomatik hücre sayım sistemi kullanılarak ya da elle hemasitometre kullanarak hücre sayısını. MF primer kültür nesil için analiz için adım 3.19.1 sürmesine veya adım 3.19.2 sürmesine akım sitometri kullanılarak MFS sıralama.
- Izolasyon ve saf MF kültürünün büyüme (Şekil 1) için, ortam 3 ml 4 x 10 6 hücre kadar tohum için gerekli fibroblast izolasyon ortamının uygun miktarda Son santrifüjleme, tekrar süspansiyon hücre topağından süpernatan atılır well başına 6 de, hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar. 3.20 adıma geçin.
- Analizi için veya flow sitometri 24 fibroblast izolasyon medyanın 2 ml 2 x 10 6 yerleştirebilirsiniz iyi, düşük bağlama plakası ve% 5 CO 2 ile 37 ° C O / N inkübe kullanarak MFS sıralama. Bu enzimatik prosedür ile etkilenebilir hücre yüzey epitoplarını sağlamaktır. Sonra hücre süspansiyonu toplamak ve kurtarılan hücrelerin sayısı ve devamve immün analiz 8 akım sitometri.
- % 5 CO2 ile 37 ° C 'de hücreler büyütün. % 80 confluent MF tek tabaka ~ oluşumu (Şekil 1D-E) kadar 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek.
- Passage 6 plaka dan oranını 1 ile T25 matara hücreleri: 1 ve ~ 10 büyümeye -% 100 confluency - fibroblast büyüme medyada 14 gün 80 elde etmek.
- 2: 1 oranında at T75 hücreleri T25 hücreleri Pasajlanması kültür genişletin. Hücreler konfluense ulaştıktan sonra, daha önce tarif edildiği gibi 5 akış sitometresi ile kullanılarak izole edilmiş MF saflık analizi için bir şişesi kullanın. 3: 1 oranında MF kültürünün başka T75 balon dondurmak veya geçit.
Not: EpCAM-, CD31, CD45-, vimentin +, α-SMA +, CD90 +: flow sitometri ile incelendiğinde, mezenkimal kökenli GI mukoza stromal MF kültüründe büyüyen aşağıdaki fenotip olacak o zaman bekleniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu enzimatik sindirim protokolü kullanarak, sürekli izole ve GI cerrahi örneklerin ve biyopsi (Şekil 1) MF nüfus gut CD90 + mukozal stromal hücreler büyümeye mümkün olmuştur. 6 yuvalı plakalar (Şekil 1A-B) tek çekirdekli hücre süspansiyonları tohumlama sonra 5 - Görünür MF koloni proliferasyon günde 2 gözlenebilir. MF primer kültürlerinde ulaşmak ~ 50-11 (Şekil 1C-D) - 7. günde% 70 izdiham.
Dondurulmuş Gastrointestinal Doku İzole 1. İlköğretim miyofibroblastlar (MFS) Şekil. İnsan MFS A 20X büyütme insan kolon mukozasının donmuş örnekten izole edilmiştir. (A) Gün stromal hücrelerin 2. Yapışık kümeleri bulunur. (B) Gün 4. karakteristik iğ veya stellate-Hücre morfolojisi geliştirilen ve hali hazırda belirgindir etti. Fibroblast yoğunluğu Gün 14 ile (C) Gün 7 ve (D) Gün 10. (E) artmaya devam MFS tamamen konfluent tek tabaka vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Cerrahi numuneler (~% 10, Tablo 1) dondurma üzerine mukozal tek hücre hazırlık canlılığı hafif bir azalma var. Bununla birlikte, dondurma ile, doku bakteri / mantar kirlenme bir azalma ayrıca izlenir ve sonuç olarak MF kültürü üretimi verimliliğinde bir artış.
| GI mukozal miyofibroblastlar Kaynağı | Mukoza Tek Hücre Süspansiyon Hazırlama (n = 11) ve Canlılık * </ td> | MF İzolasyon Verimliliği (n = 11) |
| Taze | 88.32 ± 2,369 | 11 (% 82) 8 takım |
| Dondurulmuş | 78,64 ± 4,174 | 11 (% 100) üzerinden 11 |
| *% 0.4 tripan mavisi lekelemesinden sonra çözelti, otomatik hücre sayacı ile tespit edildiği üzere Canlılık. | ||
Tablo 1. Canlılık ve miyofibroblast Kurtarma Verimlilik. Dondurulmuş Dokularda vs Taze.
Hücreleri diğer mukozal hücrelerin kontaminasyon sağlamak amacıyla, iki geçit en az çoğaltılmıştır sonra üretilen MF kültür saflığı analiz edilmiştir. Konfokal mikroskopi kullanılarak, bu MFS mezenkimal hücre soyu CD90 ve vimentin ve als marker için pozitif olduğu gösterilmiştiro α-SMA, farklılaşmış mezenkimal hücreler bir işaretleyici (Şekil 2).
Şekil 2. İzole hücreler daha önce tarif edildiği gibi, 9 Fibroblast şekil ve izole MF tek tabaka Express MF İşaretleyiciler. Immün,% 1 paraformaldehit ile sabitlendi boyanmış ve konfokal mikroskopi ile analiz edilmiştir kültür içinde en az iki kez pasajlandı yazıldı. Vimentin, mavi ve CD90 ((kırmızı mAb klon RV202 ile tespit edilen,) tarafından tespit edilen,:, ve mezenkimal belirteçleri (sıçangil mAb klon 1A4 ile tespit edilen, yeşil) izole edilmiş hücreler miyofibroblastm bir işaretleyici, a-SMA eksprese Sıçangil mAb klon 5E10). Birleştirilen resimde, sarı / turuncu hücreler SMA ve vimentin ko-lokalizasyonunu temsil eder; mor vimentin ve CD90 ko-lokalizasyonunu temsil eder. pleas e bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Bu veriler, akış sitometri analizi (Şekil 3) ile teyit edilmiştir. Önceden bildirildiği gibi, GI mukozasından izole Normal MFS ayrıca hematopoetik yapımcıları CD45 ve CD31 yanı sıra epitel işaretleyici, EpCAM 3, 5, 9 negatif idi.
Şekil 3. Birinci miyofibroblast (MF) Kültürlerin fenotipik karakterizasyonu. Çalışmalar, kolon mukozadan izole edilmiş primer MFS'de üzerinde gerçekleştirilmiştir ve kültür, en az iki defa geçirilmiştir. Immün, akış sitometri analizi, ardından izole edilen hücreler MF fenotipine sahip, α-SMA ve CD90 vimentin eşit olumlu olduğunu doğruladı. Uygun izotip kontrolleri çalışmaya dahil edildi.arge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, potansiyel bir kanserli prognostik biyolojik ve terapötik bir hedef olarak stromal hücrelerin kritik önemi giderek artan ışığında, sadece araştırma uygulamaları için geliştirilen birlikte, daha sonra kullanılmak üzere "işlevsel" biospecimens dondurma kabiliyeti önemli bir avantaj sunmaktadır. Bu kişiselleştirilmiş tıp 10, 11 gelişimini ilerletmek için hizmet olarak ek araçlar hizmet edebilir, hangi klinik biorepository yaratılması için benzersiz bir avantaj oluşturmaktadır. Daha önce dondurulmuş stromal vasküler parçasından izole adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücreler için bildirilen bulgulara benzer olarak, yaptığımız belirteçler ve çoğalma / immün / inflamatuvar yanıt ve MFS metabolik aktivitesi donmuş mukozal örneklerden izole önemli bir değişiklik gözlenmedi. 12 Ancak, bu tür hücre dışı işaretleyici birikimi olmayan test tepkilerin bazıları, vb değişebilir dışlamayın . Bu durumda, bilinmeyen bir çalışma durumlarda / unreportlu olaylar, araştırmacılar MFS aynı bireyin Dondurulmuş ve taze dokusundan izole özellikle fonksiyon yan yana test edileceği bir karşılaştırma deneyi kurabilir.
Miyofibroblast yalıtım yöntemleri için tekniklerin çoğunluğu ya kenetleme maddeleri ile muamele [etilendiamintetraasetik asit (EDTA), DL-ditiyotreitol (DTT)] veya kolajenolitik ve proteolitik enzimler ile bir araya 13-14 dokunun mekanik kıyma haline gelme kullanımına da dayanmaktadır . Bu, daha önce mideden MF üretilmesiyle bildirilmiştir, ince bağırsak ve kolon, ilk mekanik kıyma haline gelme ve kenetleme maddeleri 5, 6 uygulanmasına dayanır Mahida ve arkadaşları tarafından tarif edilen sonucudur yöntemi kullanarak etkili oldu. Burada, ek enzimatik dondurulmuş doku örneklerinden MFS'de primer kültürlerinde nesil olanak sağlayan bir yöntem bildirilmiştir. Teknikleri-akıbet ve enzimatik hem sindirim-olmakla birliktemide, bağırsak, küçük ve kolon dokusundan birincil miyofibroblastlar izolasyonunda eşit derecede etkili, hala kültür hücreleri in vivo fenotip korumak konusunda bilimsel topluluk içinde orada tartışma olduğunu. Bu yazıda bildirilen tekniği birincil MF kültürünün sadece nesil için izin verir, ama aynı zamanda GI mukoza 15-17 sunulan farklı hücre popülasyonlarının ex vivo analizi izin verir. Bu doku ve ifade işaretleri ile görece bolluk belirlenmesini içerir, aynı zamanda işlevsel tahlillerde (örneğin, enzim aktivitesi veya sitokin üretimi) kullanım için. Doku içinde MFS Bağıl bolluğu bir karşılaştırıldığında (yani, EpCAM-, CD31, CD45-, vimentin +, α-SMA +, CD90 +) MFS ve varlıklarını miktarının özgü belirteçler dayalı hücreler sıralayarak FACS kullanılarak değerlendirilebilir gerekirse bütün toplamı taze ayrı hücre tipleri ile karşılaştırmalı oranını yaparak, hücreleri izole veya. Etkinliğine rağmencanlı hücre izolasyonu, enzimatik sindirim dayanarak bu ve diğer protokoller kayda değer bir sınırlama olduğunu hücre yüzey epitopları değiştirebilir kullanılan enzimin proteolitik aktivitesinin. Bunun üstesinden gelmek için, epitoplar da önceden sindirilmiş duruma benzer şekilde yeniden ifade edilmesi için hücreler için O / N kurtarmak için izin verir.
Biz sürekli hücre canlılığı kaybıyla donmuş dokudan MF kültürünü oluşturmak mümkün olmuştur. Dondurulmuş örnekten bu kültürleri kurtarmak için yetenek araştırmacılar manipüle etmek ve daha iyi gece boyunca veya normal iş saatleri dışında elde edilen cerrahi ve / veya endoskopik doku örnekleri koruma sağlar. Dahası, dondurma işlemi sırasında bakteriyel ve / veya mantar kirletici maddeleri tedarik, kullanışlı doku kaybı azalması Ek bir avantaj olarak hizmet vermektedir. Hangi kültür daha sonra standart asepti kullanmaya devam etmelidir, 3 pasajlar - izolasyon ardından, antibiyotik kullanımı sadece ilk 2 sınırlı olmalıdırc tekniği ve anti-mantar / anti-mikoplazma ajan-ücretsiz medya. Hücresel kültüründe bu ajanların rutin kullanımı sitotoksik etkileri, yani hücre büyümesi, hücre dejenerasyonu ve vesilesiyle, ölüm 18 sarfetmek gösterilmiştir.
Bağışıklık hücreleri, epitel hücreleri ve MFS: dahil olmak üzere GI lamina propria bulunan çoklu hücre popülasyonlarının verecektir enzimatik sindirim. İlk geçişten sonra, yalnızca MFS kalacak ve yanı sıra, markör analizi (CD90, a-SMA, vimentin pozitif hücreye özel panel boyunca eşsiz fenotip (Şekil 1) tarafından tespit edilebilir, ancak epitelyal ve hematopoietik negatif yaygın miyofibroblastlar, kronik inflamasyon ve kanser gibi hastalık durumlarında, normal bir konukçuda mezenkimal kök hücrelerden ortaya olduğu kabul edilmekle birlikte işaretleri) 3, 5, 9., MFS bir alt popülasyonu ifade eden epitelyal veya hematopoietik işaretleri 3 gösterilmiştir. Bu bulgular muhtemelen olduğu öne sürülmüştürHücreler boyanmış ve yukarıda belirtilen belirteçler için akış sitometrisi ile analiz edilirse, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) veya hematopoietik soy 3, 19 türetilmiş fibrositlerinin işe bir sonucu. Bundan başka, ilave dikkatli kullanılmalıdır. Biz hücreler yapışmayan plakalar içinde inkübe taze sindirilmiş dokudan O / N kurtarmak için izin verildikten sonra, bir sorun olmaya epitop kaybını bulunamadı olsa da kopması esnasında tripsin ya da başka herhangi bir proteolitik enzim kullanıldığında, epitopların kaybı olabilir oluşur plakasından hücreleri. Bu nedenle, bu sorunu önlemek için, biz yapışık MF kültürleri Akışkan sitometri analizi ile takip immün yönelik olması durumunda EDTA gibi şelatlama ajanları ile bir hücre ayrışma çözeltisi kullanılması tavsiye edilir. Miyofibroblastlann bir birincil hücre kurulduktan sonra, hücreler daha sonra dondurularak ortam içinde dondurulmuş ve sıvı azot içinde saklanır. 15 - Bu hücreler, 14 yaklaşık kadar in vitro deneylerde, bir dizi kullanılabilirpasajlar, bu süreden sonra, hücreler senesce ve atılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
