Abstract
Fibroblastes / myofibroblastes (PDE) ont gagné une attention croissante pour leur rôle dans la pathogenèse et leurs contributions à la fois la cicatrisation des plaies et la promotion du microenvironnement de la tumeur. Bien qu'il existe actuellement de nombreuses techniques pour l'isolement de la MFS de (GI) tissus gastro-intestinaux, ce protocole introduit un élément original de l'isolement de ces cellules stromales de tissu congelé. La congélation des échantillons de tissus de GI non seulement permet au chercheur d'acquérir des échantillons de collaborateurs à travers le monde, les biobanques et les fournisseurs commerciaux, il permet également le traitement retardé d'échantillons frais. Le protocole décrit va toujours produire des cellules fusiformes avec le phénotype caractéristique MF qui expriment les marqueurs CD90, α-SMA et la vimentine. Comme ces cellules sont dérivées à partir d'échantillons de patients, l'utilisation de cellules primaires confère également le bénéfice de la MFS imitant de près depuis des états pathologiques, à savoir le cancer et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cette technique a l'abeillen validée dans l'estomac, l'intestin grêle et du côlon MF génération de culture primaire. MF cultures primaires peuvent être utilisés dans une vaste gamme d'expériences sur un certain nombre de passage et leur pureté évaluées à la fois par immunocytochimie et cytométrie de flux.
Introduction
Myofibroblastes / fibroblastes (PDE) représentent une population abondante de cellules dans gastro-intestinal (GI) muqueuse. Ces cellules stromales sont situés juste en dessous de l'épithélium et forment un réseau interconnecté à l'intérieur de la muqueuse de la lamina propria dans l'intestin. MF ne sont pas seulement responsables pour le dépôt de la matrice extracellulaire, mais par la réglementation paracrine peut influencer le transport de l'électrolyte, la restitution et la fonction de barrière de l'épithélium adjacente 1, 2. En outre, la MFS ont été montré à jouer un rôle clé dans l'inflammation et les tissus remodelage 3, 4. Myofibroblastes sont un élément important du microenvironnement de la tumeur, où ils sont également connus comme les fibroblastes associés au cancer, et de contribuer à la croissance des cellules tumorales et servent comme une niche pour les cellules souches du cancer 3. De nouvelles données suggèrent que MFS peut également servir de cellules présentatrices d'antigènes que locales. En outre, la fonction de FM des régulateurs importants de réponses immunitaires innées et adaptatives, produCing une variété de cytokines et de facteurs de croissance 5.
Chez les individus en bonne santé, des cellules MFs On pense que les différencier des cellules souches mésenchymateuses et d'exprimer sur leur surface cellulaire, le marqueur mésenchymateux, CD90 3, 5. Ces cellules sont également positives pour la vimentine, mais négatif pour épithéliale et le marqueur de cellules hématopoïétiques, EpCAM et CD45 respectivement. Les myofibroblastes sont proposés pour être une forme activée de fibroblastes et peuvent être distingués des fibroblastes non activées par l'expression d'α-SMA 5.
Au cours de la dernière décennie, plusieurs approches pour l'isolement de myofibroblastes de la muqueuse du côlon humain ont été publiés sur la base de la plupart du temps, la méthode décrite à l'origine par Mahida et al., 8.5. Bien que des études particulières signalent des modes opératoires d'isolement de divers muqueuse intestinale, aucun protocole universel pour l'isolement de MFs à partir de plusieurs régions du tractus gastro-intestinal (par exemple, de l'estomac, les petites et lmuqueuse intestinale ARGE) a été publié. Le protocole présenté ici a été testée et utilisée avec succès pour tous les trois type de tissu mentionné ci-dessus. . En outre, les procédures pour isoler les CM de la muqueuse gastro-intestinaux congelés ont pas été signalés.
Ici, nous présentons une méthode optimisée, qui est basé sur la digestion enzymatique, et permet en même temps pour l'isolement de la muqueuse de l'intestin humain MF pour la culture et la cytométrie en flux analyse fraîchement digérés, monocellulaires, préparations muqueuses. Cette technique donne de manière fiable des cultures primaires avec un phénotype MF. En outre, les mêmes méthodes peuvent être utilisées pour isoler les CM à partir de spécimens congelés de tissus intestinaux et gastriques petits ainsi. Isolement de myofibroblastes de tissu frais GI a été décrite précédemment; cependant, l'utilisation des échantillons congelés présente de nombreux avantages. A savoir, les chercheurs seront en mesure de recueillir et de stocker des tissus de tout nombre de collaborateurs à travers le monde qui ont la capacilité à expédier des échantillons de tissus congelés. En outre, les chercheurs peuvent trouver la collection de tissus enlevés de la salle d'opération et / ou salle d'endoscopie et le traitement immédiat du tissu pour l'isolement en conflit avec leur horaire de l'expérimentation en cours. Aussi, en raison de la nature imprévisible de la chirurgie, l'obtention de tissus peut se produire très tard dans la journée, ce qui limitera le temps restant pour le tissu de traitement. Geler les tissus pour un traitement ultérieur sera atténuer ces défis.
Enfin, ces méthodes ont été utilisées avec succès dans l'isolement des myofibroblastes intestinale du côlon, de l'estomac et dans les petits états pathologiques tels que le cancer colorectal et les maladies inflammatoires de l'intestin.
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Protocol
Le protocole pour l'obtention de tissus humains jetés de patients chirurgicaux et la mise en place de cultures primaires a été approuvé par l'Université du Texas Medical Branch et de l'Université du Nouveau-Mexique Institutional Review Board. Les exigences générales pour l'obtention d'échantillons de tissus humains est décrite ci-dessous. Notez que depuis MFS peut être isolé à partir de tissus congelés, les biobanques et de fournisseurs commerciaux sont également des options viables.
1. Obtenir tissus humains
- Proposez un protocole pour obtenir des tissus du côlon humain à la commission d'examen institutionnel pour approbation.
- Établir des collaborations avec des chirurgiens généraux et / ou des chirurgiens colorectaux afin d'obtenir les tissus humains pour la recherche. La collaboration avec le département de pathologie est également obligatoire, car ils seront déterminer les tissus qui ne sont pas requis pour le diagnostic et peut être désigné pour la recherche.
- Conseiller pathologiste de fournir des tissus de la tumeur, puis grosslmuqueuse normale y au moins 5 cm de la tumeur. Placer immédiatement les échantillons dans des milieux de lavage glacées et les placer sur la glace. Le pathologiste de déterminer la quantité de tissu qui peut être administré en toute sécurité pour la recherche. Le tissu minimale requise pour MF isolement est de 1,5 mm 2.
- Utilisez le tissu obtenu soit immédiatement pour établir les cultures primaires ou de gel et lieu à -80 ° C pour l'isolement avenir.
- Si le gel pour l'isolement plus tard, couper le tissu en environ 1 - 2 mm 2 pièces, placer dans un tube cryogénique avec 1 ml de gel des médias (voir ci-dessous), et conserver à -80 ° C. Remarque: En utilisant ce protocole, isolement réussi de la MFS à partir de tissus congelés pendant plus de 4 ans a été observé.
2. Préparer Réactifs
- Pour une solution de collagénase: Préparer 100 U / ml de collagénase I, II et IV dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec Ca2 + / Mg2 + (voir Tableau Matériaux
- DNase solution d'achat d'actions à base d'eau Préparer à 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
- Préparer Laver les médias: (MEM: 89 ml, antibiotiques antimycosique, 100x: 1 ml; FCS inactivé à la chaleur: 10 ml)
- Préparer la croissance des fibroblastes médias: MEM: bouteille de 500 ml; L-glutamine (200 mM): 5 ml; MEM non-acides aminés essentiels, 100x solution: 5 ml; ciprofloxacine HCl (10 mg / ml): 570 ul; Antibiotique-antimycosique, solution 100x: 10 ml; pyruvate de sodium (100 mM): 5 ml; FCS inactivé à la chaleur: 50 ml
- Préparer les médias Gel: les milieux de croissance des fibroblastes (réactif 2.4) avec l'ajout de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), puis filtrez-sterilize avec un filtre de 0,22 pm.
Tissue 3. Digest enzymatique humain
- Si le tissu a été gelé dans les médias gel, lieu cryovial dans (~ 37 ° C) jusqu'à ce que l'eau chaude des tissus et des médias doit être décongelée.
- Pour 4 - 5 de 2 mm 2 morceaux de tissu, lavez le tissu deux fois avec 10 ml de HBSS sans Ca 2+ / Mg 2+.
- Une fois que le tissu a réglé par gravité, prenez soin de le surnageant sans essorage échantillon.
- Ajouter 10 ml de la solution de collagénase à l'échantillon et transférer le mélange tissu-solution dans un tube stérile, DNase / RNase avec haut-rotors pour échantillon dissociation. Utilisation de la collagénase pour dissocier la matrice extracellulaire qui entoure l'aspect basal des cellules épithéliales et constitue la fraction non-cellulaire de la muqueuse de la lamina propria.
- Fermer hermétiquement le tube et l'attacher à l'envers sur la manche de la dissociateur (par exemple, gentleMACS). Si le laboratoire n'a pas accès à la til susmentionnées équipements, augmenter le temps de chaque étape de digestion pour obtenir des résultats comparables.
- Exécutez le h_tumor_01 du programme, un profil prédéfini fourni avec la machine (durée totale de 36 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 268 tours par course).
- Après la fin du programme, retirez le tube de la dissociateur.
- Incuber l'échantillon pendant 45 min à 37 ° C sous rotation continue sur agitateur à 140 tours par minute. Remarque: Pour les quantités d'échantillons de tissus divers, temps de digestion peut être proportionnellement réduite ou augmentée (par exemple, de plus grandes quantités de tissu peuvent être plus longues).
- Attacher le tube à l'envers sur le manchon du dissociateur.
- Choisissez et exécutez le h_tumor_02 de programme (durée totale de 37 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 235 tours par course).
- Après la fin du programme, retirez le tube de la dissociateur.
- Ajouter 50 pi de DNase solution stock. Utilisez DNAse de dissocier / éliminer les cellules mortes et fraction d'ADN des débris cellulaires qui mène à la cellule agglutination.
- Incuber l'échantillon pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue sur un agitateur à 60 tpm.
- Attacher le tube à l'envers sur le manchon du dissociateur nouveau.
- Choisissez et exécutez le h_tumor_03 de programme (durée totale de 37 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 168 tours par course).
Remarque: Si le tissu est complètement digéré pas, centrifuger à 250 g pendant 10 min à 20 ° C, éliminer le surnageant, remettre en suspension dans 2 ml de solution de dissociation cellulaire et incuber à température ambiante pendant 10 min. - Passez la suspension de cellules à travers stérile 70 um tamis cellulaire.
- Centrifugeuse suspension de cellules à 250 g pendant 10 min à 20 ° C. Aspirer le surnageant complètement.
- Laver culot cellulaire à deux reprises avec 25 ml de HBSS sans Ca 2+ / Mg 2+ et jeter le surnageant.
- Avant la dernière étaith, compter le nombre de cellules en utilisant un système de comptage de cellules automatisé disponible dans le laboratoire ou manuellement en utilisant un hémocytomètre. Pour MF génération de culture primaire de procéder pour l'étape 3.19.1, pour l'analyse ou le tri de la MFS en utilisant la cytométrie de flux de procéder pour l'étape 3.19.2.
- Pour l'isolement et la croissance de la culture MF pur (figure 1), jeter le surnageant à partir de la dernière centrifugation, culot de cellules de remettre en suspension dans la quantité appropriée de support d'isolation des fibroblastes nécessaire pour ensemencer jusqu'à 4 x 10 6 cellules dans 3 ml du milieu par puits dans 6 assiettes bien, la culture de cellules traitées. Passez à l'étape 3.20.
- Pour l'analyse ou le tri de la MFS en utilisant la cytométrie de flux, placer jusqu'à 2 x 10 6 dans 2 ml de milieux d'isolement des fibroblastes dans 24 puits, plaque bas-liaison et incuber O / N à 37 ° C avec 5% de CO 2. Ceci est de restaurer les épitopes de surface cellulaire qui peuvent être affectés par la procédure enzymatique. Ensuite collecter suspension cellulaire et compter les cellules récupérées et procéderpour l'immunocoloration et cytométrie de flux analyse 8.
- Cultiver les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. Changer de support tous les 2 - 3 jours jusqu'à la formation de ~ 80% de confluence MF monocouche (figure 1D-E).
- Cellules Passage dans des flacons T25 avec plaque de 6 puits à un rapport de 1: 1 et croître pendant ~ 10 - 14 jours dans les médias de croissance des fibroblastes pour atteindre 80 - 100% de confluence.
- Développer culture par passage de cellules à partir de cellules T25 à T75 à un rapport 1: 2. Une fois que les cellules atteignent la confluence, utiliser un flacon pour l'analyse de la pureté isolé MF utilisant par cytométrie de flux comme décrit précédemment 5. De geler ou de passage dans un autre ballon T75 de la culture MF au rapport 1: 3.
Remarque: Lors de l'analyse par cytométrie de flux, il est prévu que la muqueuse GI stromales mésenchymateuses MF d'origine lors de la croissance dans la culture aura phénotype suivant: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentine +, α-SMA +, CD90 +.
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Representative Results
En utilisant ce protocole de digestion enzymatique, nous avons toujours été en mesure d'isoler et de cultiver CD90 + cellules stromales de la muqueuse intestinale MF population de GI spécimens et des biopsies (Figure 1) chirurgicales. Visible colonie prolifération MF a pu être observée le jour 2 - 5 après le semis suspensions cellulaires mononucléaires dans des plaques de 6 puits (figure 1A-B). Les cultures primaires MF atteignent ~ 50 - 70% de confluence au jour 7 - 11 (figure 1C-D).
Figure 1. Myofibroblastes primaires (PDE) isolées à partir de tissus congelés gastro. Un grossissement de 20X de la MFS humain isolé du spécimen congelé de la muqueuse du côlon humain. (A) Jour 2. grappes adhérente de cellules stromales sont présents. (B) les jours 4. La caractéristique ou en fuseau stellate-morphologie cellulaire a développé et est facilement apparent. La densité des fibroblastes continuent à augmenter sur (C) Jour 7 et (D) Jour 10. (E) au jour 14, il ya une monocouche complètement confluent de la MFS. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Il ya une légère diminution de la viabilité de la préparation d'une seule cellule muqueuse sur le gel des prélèvements chirurgicaux (~ 10%, tableau 1). Cependant, avec le gel, il y a également une diminution de la contamination bactérienne / fongique des tissus observés et, par conséquent, une augmentation de l'efficacité de la génération de culture MF.
| Source des muqueuses GI Myofibroblastes | Viabilité de la muqueuse * Simple suspension cellulaire Préparation (n = 11) </ td> | MF Isolation efficacité (n = 11) |
| Frais | 88.32 ± 2.369 | 8 sur 11 (82%) |
| congelés | 78,64 ± 4.174 | 11 des 11 (100%) |
| * Viabilité tel que déterminé par un compteur de cellules automatisé suivant 0,4% solution de bleu trypan coloration. | ||
Tableau 1. viabilité et l'efficacité de myofibroblastes récupération. Frais vs congelés tissus.
La pureté de la culture a été analysé MF générée après que les cellules ont été propagées pendant au moins deux passages, afin de garantir l'absence de contamination par d'autres cellules de la muqueuse. En utilisant la microscopie confocale, on a démontré que MFs étaient positifs pour le marqueur CD90 de la vimentine et de la lignée des cellules mésenchymateuses, et also α-SMA, un marqueur de la différenciation des cellules mésenchymateuses (figure 2).
Figure 2. Forme cellules ont isolé des fibroblastes et Express MF marqueurs. Immunocoloration de MF isolé monocouche, un passage au moins deux fois dans la culture ont été fixées avec du paraformaldehyde à 1%, une immunocoloration et analysé par microscopie confocale 9 comme décrit précédemment. Les cellules isolées ont exprimé le marqueur de myofibroblastes, a-SMA (en vert, tel que détecté par mAb murin clone 1A4), et des marqueurs mésenchymateuses: vimentine (en rouge, comme détecté par mAb, clone RV202) et CD90 (en bleu, tel que détecté par mAb murin, clone 5E10). Dans l'image fusionnée, les cellules orange / jaune représentent la co-localisation d'un SMA et vimentine; pourpre représente la co-localisation de la vimentine et CD90. Moyens e cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ces données ont été confirmées par analyse de cytométrie de flux (Figure 3). Comme indiqué précédemment, la MFS normales isolées à partir de la muqueuse GI étaient également négative pour les décideurs hématopoïétiques CD45 et CD31, ainsi que marqueur épithélial, EpCAM 3, 5, 9.
Figure 3. Caractérisation phénotypique des myofibroblastes primaires (MF) Cultures. Les études ont été réalisées sur les CM primaires isolées à partir de la muqueuse du côlon et passé au moins deux fois dans la culture. Immunocoloration, suivie par cytométrie de flux, a confirmé que les cellules isolées ont MF phénotype sont uniformément positives pour la vimentine, α-SMA, et CD90. Contrôles isotypiques appropriés ont été inclus dans l'étude.arge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Bien que ce protocole a été développé pour l'application de recherche uniquement, à la lumière de l'importance croissante critique de cellules stromales comme un cancer potentiels biomarqueurs pronostiques et cible thérapeutique, la capacité de geler biospécimens «fonctionnelles» pour une utilisation ultérieure offre un avantage significatif. Cela représente un avantage unique pour la création de banques de tissus biologiques cliniques, qui peuvent servir d'outils supplémentaires servant à faire progresser le développement de la médecine personnalisée 10, 11. Similaires aux résultats précédemment rapportés pour les cellules souches mésenchymateuses de tissu adipeux isolés à partir du stroma congelé fraction vasculaire, nous avons fait pas observé de changements significatifs dans les marqueurs et les réponses prolifératives / immunitaires / inflammatoires et l'activité métabolique de la MFS isolé à partir de prélèvements de la muqueuse congelés. 12 Cependant, nous ne excluent pas que certaines des réponses non testés tels que le dépôt de marqueur extracellulaire, etc. peuvent varier . Ainsi, dans les cas de travailler avec inconnu / ILLIMITÉEévénements portés, les enquêteurs peuvent mettre en place une expérience de comparaison dans laquelle la fonction particulière sera testé côte-à-côte dans la MFS isolé à partir de tissus congelés et frais du même individu.
La majorité des techniques de procédés d'isolement de myofibroblastes sont basées soit sur l'utilisation de hachage mécanique du tissu combiné avec un traitement soit avec des agents de chelation [acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), DL-dithiothréitol (DTT)] enzymes ou collagénolytiques et protéolytiques 13-14 . Il a été précédemment rapporté que la production de MF à partir de l'estomac, l'intestin grêle et le côlon a été efficace en utilisant le procédé de l'excroissance initialement décrit par Mahida et al, qui est basé sur le hachage mécanique et l'application des agents chélatants 5, 6. Ici, un enzymatique supplémentaire procédé qui permet la génération de cultures primaires de MFS à partir d'échantillons de tissus congelés est rapporté. Bien que les deux techniques-excroissance et la digestion enzymatique sont-aussi efficace dans l'isolement de myofibroblastes primaires de l'estomac, l'intestin grêle, du côlon et du tissu, il ya encore débat au sein de la communauté scientifique sur les cellules cultivées se conservent leur phénotype in vivo. La technique rapportée dans ce manuscrit permet non seulement de génération MF culture primaire, mais permet également une analyse ex vivo de populations de cellules différentes présentées dans la muqueuse GI 15-17. Cela comprend la détermination de leur abondance relative avec le tissu et les marqueurs qu'ils expriment, mais également pour une utilisation dans des analyses fonctionnelles (par exemple, l'activité enzymatique ou la production de cytokines). L'abondance relative de MFs dans le tissu peut être évaluée en utilisant FACS en triant les cellules sur la base des marqueurs uniques à MFs (à savoir, EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentine +, α-SMA +, CD90 +) et de quantifier leur présence par rapport à un total des cellules fraîchement isolées ou, le cas échéant, en faisant rapport comparatif sur un des types de cellules distincts. En dépit de l'efficacitél'isolement de cellules viables, une limitation notable de ceci et d'autres protocoles sur la base de digestion enzymatique est que l'activité protéolytique de l'enzyme utilisée peut modifier des epitopes de surface cellulaire. Pour surmonter cela, nous permettons à des cellules de récupérer O / N afin d'épitopes à ré-exprimé de manière similaire à leur état prédigérée.
Nous avons été en mesure de générer de façon récurrente la culture MF de tissus congelés avec une perte minimale de la viabilité cellulaire. La capacité à récupérer ces cultures de spécimen congelé permet aux chercheurs de manipuler et de mieux préserver les échantillons de tissus chirurgicaux et / ou endoscopiques obtenus au cours de la nuit ou hors des heures normales de travail. En outre, la diminution de la perte de procurer, d'un tissu utilisable en raison des contaminants bactériens et / ou fongiques pendant le processus de congélation constitue un avantage supplémentaire. Suite à l'isolation, l'utilisation d'antibiotiques devrait être limitée aux seules les premières 2 - 3 passages, après quoi la culture devraient continuer à utiliser la norme Aseptitechnique de c et les médias sans agent anti-mycosique / anti-mycoplasmes. L'utilisation systématique de ces agents dans la culture cellulaire a été montré pour avoir des effets cytotoxiques, à savoir la croissance cellulaire, la dégénérescence cellulaire, et à l'occasion, 18 décès.
Digestion enzymatique donnera de multiples populations de cellules présentes dans la lamina propria de GI, y compris: les cellules immunitaires, les cellules épithéliales et MF. Après le premier passage, que la MFS demeure et peut être identifié par leur phénotype unique (figure 1), ainsi que par le panneau de l'analyse des marqueurs (CD90, un SMA, et vimentine positif spécifique de la cellule, mais négatif pour épithéliale et hématopoïétique Alors qu'il est largement admis que les myofibroblastes proviennent de cellules souches mésenchymateuses dans l'hôte normal, dans des états pathologiques tels que l'inflammation chronique et le cancer, une sous-population de la MFS a été montré épithéliale expresse ou 3 marqueurs hématopoïétiques marqueurs) 3, 5, 9.. Ces résultats ont été suggérés pour être éventuellementà la suite de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) ou le recrutement de fibrocytes issus de lignée hématopoïétique 3, 19. En outre, des précautions supplémentaires doivent être utilisé si les cellules sont immunocolorées et analysées par cytométrie en flux pour les marqueurs décrits ci-dessus. Alors que nous avons pas trouvé la perte de épitope d'être un problème après avoir laissé les cellules de récupérer O / N à partir de tissu fraîchement digéré incubés dans des plaques non-adhérentes, la perte d'épitopes peuvent se produit lors de l'utilisation de la trypsine ou de toute autre enzyme protéolytique pendant le détachement de les cellules de la plaque. Ainsi, pour éviter ce problème, nous recommandons d'utiliser une solution de dissociation cellulaire avec des agents chélateurs tels que l'EDTA lorsque les cultures MF adhérentes sont destinés à l'immunocoloration suivie par cytométrie de flux. Après une culture primaire de myofibroblastes est établie, les cellules peuvent ensuite être congelés dans un milieu de congélation et stockées dans de l'azote liquide. Ces cellules peuvent être utilisées dans une variété d'expériences in vitro jusqu'à environ 14 - 15passages, après quoi les cellules vieillissent et doivent être jetés.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
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