Abstract
Fibroblasti / miofibroblasti (MFS) stanno guadagnando sempre maggiore attenzione per il loro ruolo nella patogenesi e il loro contributo sia per la guarigione della ferita e la promozione del microambiente tumorale. Mentre ci sono attualmente molte tecniche per l'isolamento di MF da gastrointestinali (GI) tessuti, questo protocollo introduce un elemento nuovo di isolamento di queste cellule stromali di tessuti congelati. Congelamento campioni di tessuto GI non solo permette al ricercatore di acquisire campioni di collaboratori in tutto il mondo, le biobanche e fornitori commerciali, permette anche il trattamento ritardato dei campioni freschi. Il protocollo descritto sarà costantemente produrrà caratteristici cellule fusiformi con il fenotipo MF che esprimono i marcatori CD90, α-SMA e vimentina. Poiché queste cellule sono derivate da campioni di pazienti, l'uso di cellule primarie conferisce anche il vantaggio di MF mimando da stati, cioè il cancro e malattie infiammatorie intestinali malattie. Questa tecnica ha apen convalidato gastrico, piccolo intestino, colon e MF generazione coltura principale. Colture primarie MF possono essere utilizzati in una vasta gamma di esperimenti su un numero di passaggio e la loro purezza valutate sia immunocitochimica e analisi citofluorimetrica.
Introduction
Miofibroblasti / fibroblasti (MFS) rappresentano una popolazione abbondante di cellule gastrointestinali (GI) mucosa. Queste cellule stromali si trovano appena sotto l'epitelio e formano una rete interconnessa all'interno della mucosa lamina propria nell'intestino. MF non sono responsabili solo per la deposizione della matrice extracellulare, ma attraverso la regolamentazione paracrina possono influenzare il trasporto di elettroliti, la restituzione, e la funzione di barriera dell'epitelio adiacente 1, 2. Inoltre, MF hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave nel processo infiammatorio e tessuti rimodellamento 3, 4. miofibroblasti sono una parte critica del microambiente tumorale, dove sono conosciuti anche come i fibroblasti associati al cancro, e contribuire alla crescita delle cellule tumorali e servire come una nicchia per le cellule staminali del cancro 3. Dati emergenti suggeriscono che MF può anche servire le cellule presentanti l'antigene come locali. Inoltre, la funzione MF come importanti regolatori della risposta immunitaria innata e adattativa, prcing una varietà di citochine e fattori di crescita 5.
Negli individui sani, le cellule MFS si ritiene da differenziare da cellule staminali mesenchimali ed esprimere sulla loro superficie delle cellule, il marcatore mesenchimale, CD90 3, 5. Queste cellule sono anche positivi per vimentina, ma negativo per epiteliali e marker delle cellule ematopoietiche, EpCAM e CD45 rispettivamente. Miofibroblasti sono suggeriti per essere una forma attiva di fibroblasti e possono essere distinti dai fibroblasti non attivati mediante l'espressione di α-SMA 5.
Negli ultimi dieci anni, più approcci per l'isolamento di miofibroblasti dalla mucosa del colon umani sono stati pubblicati per lo più basato sul metodo originariamente descritto da Mahida et al. 5-8. Mentre i singoli studi riportano procedure di isolamento di varie mucosa intestinale, nessun protocollo universale per l'isolamento di MF da più zone del tratto gastrointestinale (ad esempio, gastrico, piccolo e large mucosa intestinale) è stato pubblicato. Il protocollo qui presentata è stato testato ed usato con successo per tutti e tre tipo di tessuto sopra menzionato. . Inoltre, non sono stati segnalati procedure per isolare MFs da mucosa GI congelati.
Qui, vi presentiamo un metodo ottimizzato, che si basa sulla digestione enzimatica, e permette contemporaneamente per l'isolamento di mucosa dell'intestino umano MF per la cultura e citometria a flusso analisi appena digerito, singola cella, i preparativi della mucosa. Questa tecnica produce in modo affidabile colture primarie con un fenotipo MF. Inoltre, gli stessi metodi possono essere utilizzati per isolare MFs da campioni congelati di tessuti intestinali gastriche e piccoli pure. Isolamento di miofibroblasti da tessuto fresco GI è stata precedentemente descritta; tuttavia, l'utilizzo di campioni congelati presenta molti vantaggi. Vale a dire, i ricercatori saranno in grado di raccogliere e conservare i tessuti da un qualsiasi numero di collaboratori in tutto il mondo che hanno il capabilità per spedire campioni di tessuto congelato. Inoltre, i ricercatori potrebbero trovare la collezione di tessuti scartati dalla sala operatoria e / o suite endoscopia e immediata elaborazione del tessuto per l'isolamento di conflitto con il loro programma di sperimentazione in corso. Inoltre, a causa della natura imprevedibile di un intervento chirurgico, di approvvigionamento dei tessuti può verificarsi molto tardi nel corso della giornata, che limiterà il tempo rimasto per il tessuto lavorazione. Congelamento dei tessuti per successive elaborazioni si migliorare queste sfide.
Infine, questi metodi sono stati utilizzati con successo nell'isolamento di colon, gastrici e piccole miofibroblasti intestinali in stati di malattia come il carcinoma colorettale e malattie infiammatorie intestinali.
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Protocol
Il protocollo per l'ottenimento di tessuti umani scartati da pazienti chirurgici e la creazione di colture primarie è stato approvato dalla University of Texas Medical Branch e University of New Mexico revisione istituzionale Boards. I requisiti generali per l'approvvigionamento di campioni di tessuto umano è descritto di seguito. Si noti che, poiché MF può essere isolato da tessuti congelati, le biobanche e fornitori commerciali sono anche opzioni praticabili.
1. Ottenere Human Tissue
- Invia un protocollo per ottenere dei tessuti del colon umano al comitato istituzionale di revisione per l'approvazione.
- Stabilire collaborazioni con chirurghi generali e / o chirurghi colorettali al fine di ottenere tessuti umani per la ricerca. La collaborazione con il reparto di patologia è obbligatoria anche in quanto saranno determinare il tessuto che non è richiesto per la diagnosi e può essere designato per la ricerca.
- Informare il patologo di fornire il tessuto dalla neoplasia e poi grossly mucosa normale di almeno 5 cm dal tumore. Porre immediatamente i campioni nei media lavaggio gelide e disporli sul ghiaccio. Il patologo determina la quantità di tessuto che può essere dato in modo sicuro per la ricerca. Il tessuto minimo richiesto per l'isolamento MF è di 1,5 mm 2.
- Utilizzare il tessuto ottenuto o immediatamente per stabilire le colture primarie o congelamento e posto a -80 ° C per l'isolamento futuro.
- Se il congelamento per l'isolamento più tardi, tagliate il tessuto in circa 1-2 mm 2 pezzi, mettere in un tubo criogenico con 1 ml di mezzi di congelamento (vedi sotto), e conservare a -80 ° C. Nota: Utilizzando questo protocollo, è stato osservato con successo l'isolamento di MF da tessuto congelato per oltre 4 anni.
2. Preparare Reagenti
- Per la soluzione Collagenase: Preparare 100 U / ml di collagenasi I, II e IV, in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con Ca2 + / Mg 2+ (vedi Tabella Materiali
- Preparare la soluzione di DNasi magazzino a base di acqua a 10 mg / ml (3.55 UA / mg).
- Preparare lavaggio mezzi: (MEM: 89 ml, antibiotici contro funghi, 100x: 1 ml; FCS inattivato al calore: 10 ml)
- Preparare Fibroblast crescita dei media: MEM: flacone da 500 ml; L-glutammina (200 mM): 5 ml; MEM non essenziali aminoacidi, 100x soluzione: 5 ml; ciprofloxacina HCl (10 mg / ml): 570 ml; Antibiotico-Antimicotici soluzione 100x: 10 ml; piruvato di sodio (100 mM): 5 ml; FCS inattivato al calore: 50 ml
- Preparare supporti Fermo: i media di crescita dei fibroblasti (reagente 2.4) con l'aggiunta del 10% di dimetilsolfossido (DMSO), poi filtrare-sterilize con un filtro di 0,22 micron.
Tissue 3. enzimaticamente Digest umana
- Se il tessuto è stato congelato nei media congelare, posto esageratamente a (~ 37 ° C) acqua calda fino a quando viene scongelato dei tessuti e dei media.
- Per 4-5 di 2 mm 2 pezzi di tessuto, lavare il tessuto due volte con 10 ml di HBSS senza Ca 2 + / Mg 2+.
- Una volta che il tessuto è stabilito per gravità, eliminare accuratamente il surnatante, senza girare campione.
- Aggiungere 10 ml della soluzione di collagenasi al campione e trasferire la miscela di tessuto in una soluzione sterile tubo DNasi / RNasi-free con incorporato rotori per campione dissociazione. Utilizzare collagenasi dissociare la matrice extracellulare che circonda l'aspetto basale delle cellule epiteliali e costituisce la frazione non cellulare della propria mucosa lamina.
- Chiudere bene il tubo e collegarlo a testa in giù sul manicotto del dissociatore (ad esempio, gentleMACS). Se il laboratorio non ha l'accesso a tegli summenzionato attrezzature, aumentare il tempo di ciascuna fase di digestione per ottenere risultati comparabili.
- Eseguire il h_tumor_01 Programma, un profilo preimpostato in dotazione con la macchina (durata complessiva di 36 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 268 colpi per corsa).
- Dopo la cessazione del programma, staccare il tubo dal dissociatore.
- Incubare campione per 45 min a 37 ° C in rotazione continua su agitatore a 140 rpm. Nota: Per le diverse quantità di campioni di tessuto, il tempo di digestione può essere proporzionalmente ridotto o aumentato (ad esempio, grandi quantità di tessuto possono richiedere tempo supplementare).
- Collegare il tubo a testa in giù sul manicotto del dissociatore.
- Scegliere ed eseguire il programma h_tumor_02 (durata complessiva di 37 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 235 colpi per corsa).
- Dopo la cessazione del programma, staccare il tubo dal dissociatore.
- Aggiungere 50 ml di soluzione madre DNasi. Utilizzare DNAse dissociare / rimuovere le cellule morte e la frazione di DNA di detriti cellulari che porta alla cella aggregazione.
- Incubare campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua su agitatore a 60 rpm.
- Collegare il tubo a testa in giù sul manicotto del dissociatore di nuovo.
- Scegliere ed eseguire il programma h_tumor_03 (durata complessiva di 37 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 168 colpi per corsa).
Nota: Se il tessuto non è completamente digerito, centrifugare a 250 xg per 10 min a 20 ° C, scartare il surnatante, risospendere in 2 ml di soluzione di dissociazione cellulare e incubare a temperatura ambiente per 10 min. - Passare la sospensione cellulare attraverso sterile 70 micron colino cella.
- Sospensione cellulare Centrifugare a 250 xg per 10 min a 20 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
- Lavare pellet di cellule due volte con 25 ml di HBSS senza Ca 2 + / Mg 2+ e scartare il surnatante.
- Prima dell'ultima erah, contare il numero di cellule utilizzando un sistema di conteggio delle cellule automatizzato disponibile in laboratorio o manualmente utilizzando emocitometro. Per MF generazione coltura primaria proseguire per passo 3.19.1, per l'analisi o l'ordinamento di MF in citometria a flusso proseguire per passo 3.19.2.
- Per l'isolamento e la crescita della coltura pura MF (Figura 1), scartare il surnatante da ultima centrifugazione, il pellet cellulare risospendere in quantità appropriata di terreni di isolamento fibroblasti necessaria per seminare fino a 4 x 10 6 cellule in 3 ml di media per pozzetto in 6 piatti ben, coltura cellulare trattati. Passare al punto 3.20.
- Per l'analisi o l'ordinamento di MF in citometria a flusso, collocare fino a 2 x 10 6 a 2 ml di terreni di isolamento dei fibroblasti in 24 bene, piatto a basso legame e incubare O / N a 37 ° C con 5% di CO 2. Questo è quello di ripristinare le epitopi di superficie delle cellule che potrebbero essere interessati dalla procedura enzimatica. Poi raccogliere sospensione cellulare e contare le cellule recuperate e procedereper la immunocolorazione e citometria a flusso di analisi 8.
- Crescere le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. Modificare i media ogni 2 - 3 giorni fino alla formazione del ~ 80% confluenti MF monostrato (Figura 1D-E).
- Cellule Passage in fusti T25 con da 6 pozzetti in rapporto 1: 1 e crescere per circa 10 - 14 giorni nei media di crescita dei fibroblasti per raggiungere 80-100% di confluenza.
- Espandere cultura, passaging cellule da T25 a cellule T75 in rapporto 1: 2. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, usare un pallone per l'analisi di isolati purezza MF usando da citofluorimetria come descritto in precedenza 5. Congelare o di passaggio un altro pallone T75 della cultura MF in rapporto 1: 3.
Nota: Quando analizzate mediante citometria di flusso, si prevede che la mucosa GI stromale MF di origine mesenchimale quando cresce nella cultura avrà seguente fenotipo: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +.
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Representative Results
Usando questo protocollo digestione enzimatica, abbiamo sempre stati in grado di isolare e far crescere CD90 + cellule stromali della mucosa intestinale MF popolazione da GI campioni chirurgici e biopsie (Figura 1). Visibile MF colonia proliferazione potrebbe essere osservato il giorno 2-5 dopo la semina di cellule mononucleate sospensioni in 6 pozzetti (Figura 1A-B). Le colture primarie MF raggiungono ~ 50 - 70% confluenza di giorno 7 - 11 (Figura 1C-D).
Figura 1. I miofibroblasti primari (MFS) isolato da congelata gastrointestinale tessuto. Un ingrandimento 20X di MF umana isolata da campioni congelati di mucosa del colon umano. (A) Giorno 2. gruppi aderenti di cellule stromali sono presenti. (B) Giorni 4. Il spindle- caratteristica o stellate-morfologia cellulare ha sviluppato ed è evidente. La densità di fibroblasti continuano ad aumentare su (C) 7 ° giorno e (D) Giorno 10. (E) By Day 14, vi è un monostrato completamente confluente di MF. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
C'è una leggera diminuzione nella vitalità della mucosa preparazione singola cella sul congelamento dei campioni chirurgici (~ 10%, tabella 1). Tuttavia, con il congelamento, vi è anche una diminuzione nella contaminazione fungina / batterica del tessuto osservata e di conseguenza, un aumento dell'efficienza della generazione coltura MF.
| Fonte di GI mucose miofibroblasti | Viabilità * di mucosa singola sospensione cellulare Preparazione (n = 11) </ td> | MF Isolamento Efficienza (n = 11) |
| Fresco | 88.32 ± 2.369 | 8 su 11 (82%) |
| Congelato | 78.64 ± 4.174 | 11 su 11 (100%) |
| * Viabilità come determinato dal contatore automatico cella seguente 0,4% trypan soluzione colorazione blu. | ||
Tabella 1. vitalità e l'efficienza di miofibroblasti Recovery. Fresco contro congelati tessuti.
La purezza della cultura MF generato è stato analizzato dopo le cellule sono state propagate per almeno due passaggi, per garantire che nessuna contaminazione da altre cellule mucose. Usando la microscopia confocale, è stato dimostrato che MF sono risultati positivi per il marcatore del CD90 delle cellule mesenchimali e lignaggio vimentina, e also α-SMA, un marcatore delle cellule mesenchimali differenziate (Figura 2).
Figura 2. Isolato cellule hanno Forma fibroblasti ed Express MF marcatori. Immunostaining di isolato MF monostrato, diversi passaggi almeno due volte in coltura sono stati fissati con 1% paraformaldeide, immunostained e analizzate al microscopio confocale come descritto in precedenza 9. Cellule isolate espresso un marker di miofibroblasti, un-SMA (in verde, come rilevato da murino monoclonale clone 1A4), e marcatori mesenchimali: vimentina (in rosso, come rilevato da anticorpo monoclonale, clone RV202) e CD90 (in blu, come rilevato da murino mAb, clone 5E10). Nell'immagine risultante dalla fusione, arancione / giallo rappresentano le cellule co-localizzazione di un-SMA e vimentina; viola rappresenta co-localizzazione di vimentina e CD90. Motivi e clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Questo dato è stato confermato da analisi citofluorimetrica (Figura 3). Come riportato in precedenza, MF normali isolati da GI mucosa anche sono risultati negativi per i produttori ematopoietiche CD45 e CD31, così come marcatore epiteliale, EpCAM 3, 5, 9.
Figura 3. Caratterizzazione fenotipica di primaria miofibroblasti (MF) Culture. Stati condotti studi sul MF primari isolati da mucosa del colon e diversi passaggi, almeno due volte nella cultura. Immunostaining, seguita dalla citometria a flusso di analisi, ha confermato che le cellule isolate hanno MF fenotipo sono uniformemente positivi per vimentina, α-SMA, e CD90. Appropriati controlli isotipici sono stati inclusi nello studio.arge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mentre questo protocollo è stato sviluppato per l'applicazione solo ricerca, alla luce della crescente importanza critica di cellule stromali come un cancro potenziali biomarker prognostici e obiettivo terapeutico, la capacità di congelare campioni biologici "funzionali" per un uso successivo offre un vantaggio significativo. Questo rappresenta un vantaggio unico per la creazione di biorepository clinica, che può servire come strumenti aggiuntivi che servono per promuovere lo sviluppo della medicina personalizzata 10, 11. Simile a risultati precedentemente riportati per cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo isolati da stromale congelato frazione vascolare, abbiamo fatto non osservate tutte le modifiche significative dei marcatori e le risposte proliferative / immunitarie / infiammatorie e attività metabolica di MF isolati da campioni di mucosa congelati. 12 Tuttavia, non escludiamo che alcune delle risposte non testato, come extracellulare marcatore deposizione, ecc possono variare . Pertanto, nei casi di lavoro con sconosciuti / UNIREeventi portati, gli investigatori possono costituire un esperimento di confronto in cui la particolare funzione sarà testata side-by-side in MFs isolato dal tessuto congelato e fresco dello stesso individuo.
La maggior parte delle tecniche di metodi di isolamento miofibroblasti si basano sia sull'impiego di macinazione meccanica del tessuto in combinazione con il trattamento sia con agenti chelanti [acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), DL-ditiotreitolo (DTT)] o collagenolitica e proteolitici enzimi 13-14 . È stato precedentemente riportato che generazione di MF dallo stomaco, dell'intestino tenue e del colon era efficiente utilizzando il metodo conseguenza inizialmente descritto da Mahida et al, che si basa sulla macinazione meccanica e l'applicazione degli agenti chelanti 5, 6. Qui, un enzimatica ulteriore È stato riferito metodo che consente la generazione di colture primarie di MFS da campioni di tessuto congelato. Mentre sia tecniche di escrescenza e digestione enzimatica, sonougualmente efficaci nell'isolamento di miofibroblasti primari da gastrica, piccolo intestino, e dei tessuti del colon, c'è ancora dibattito all'interno della comunità scientifica sul fatto cellule in coltura conservano il loro fenotipo in vivo. La tecnica riportata in questo manoscritto permette non solo la generazione di cultura MF primario, ma permette anche ex vivo analisi di diverse popolazioni cellulari presentati nella mucosa GI 15-17. In particolare, occorre loro relativa abbondanza con il tessuto e gli indicatori che esprimono, ma anche per l'uso in saggi funzionali (ad esempio, l'attività enzimatica o produzione di citochine). Abbondanza relativa di MF all'interno del tessuto può essere valutato utilizzando FACS di classificare le cellule basate su indicatori unici a MF (vale a dire, EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +) e quantificare la loro presenza rispetto ad un totale di tutte le cellule appena isolate o, se necessario, facendo rapporto comparativo con tipi cellulari distinti. Nonostante l'efficaciadi isolamento di cellule vitali, una limitazione notevole di questo e altri protocolli basati sulla digestione enzimatica è che l'attività proteolitica di enzima impiegato può alterare epitopi superficie cellulare. Per ovviare a questo, permettiamo alle cellule di recuperare O / N in modo che epitopi di essere ri-espresso in modo simile al loro stato predigerito.
Siamo stati in grado di generare in modo coerente cultura MF da tessuto congelato con una minima perdita di vitalità cellulare. La capacità di recuperare queste culture da campione congelato permette ai ricercatori di manipolare e meglio preservare campioni chirurgici e / o endoscopici di tessuto ottenuti durante la notte o fuori regolari ore lavorative. Inoltre, la diminuzione delle perdite di procurato, tessuti utilizzabili a causa dei contaminanti batterici e / o fungine durante il processo di congelamento costituisce un ulteriore vantaggio. Dopo aver isolato, l'uso di antibiotici dovrebbe essere limitato solo ai primi 2 - 3 passaggi, dopo la quale la coltura deve continuare a utilizzare standard di tecnica asetticac tecnica e antimicotica / media-free agente anti-micoplasma. L'uso routinario di questi agenti in coltura cellulare ha dimostrato di esercitare effetti citotossici, vale a dire la crescita delle cellule, degenerazione cellulare, e in occasione, di morte 18.
Digestione enzimatica produrrà più popolazioni cellulari presenti nella propria GI lamina includendo: cellule immunitarie, le cellule epiteliali, e MF. Dopo il primo passaggio, solo MF rimarrà e può essere identificato dal loro fenotipo unico (figura 1), nonché attraverso pannello specifico-cellula di analisi marcatore (CD90, a-SMA e vimentina positivo, ma negativo epiteliale e ematopoietiche marcatori) 3, 5, 9. Mentre è ampiamente accettato che i miofibroblasti derivano da cellule staminali mesenchimali nell'ospite normale, negli stati di malattia come l'infiammazione cronica e il cancro, una sottopopolazione di MF è stato dimostrato epiteliale espressa o marcatori ematopoietiche 3. Questi risultati sono stati suggeriti per essere possibilmentea seguito della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), o l'assunzione di fibrociti derivati dalla stirpe ematopoietiche 3, 19. Inoltre, ulteriore cautela dovrebbe essere usata se le cellule sono immunostained e analizzati mediante citometria di flusso per i marcatori di cui sopra. Mentre non abbiamo trovato la perdita epitopo ad essere un problema dopo permettendo alle cellule di recuperare O / N dal tessuto fresco digerito incubate in piastre non aderenti, la perdita di epitopi può si verifica quando si utilizza tripsina o qualsiasi altro enzima proteolitico durante il distacco cellule dalla piastra. Così, per evitare questo problema, si consiglia di utilizzare una soluzione di dissociazione cella con agenti chelanti quali EDTA quando culture MF aderenti siano destinate alla immunocolorazione seguita da analisi di citometria a flusso. Dopo aver stabilito una coltura primaria di miofibroblasti, le cellule possono essere congelate in mezzi congelamento e conservati in azoto liquido. Queste cellule possono essere utilizzati in una serie di esperimenti in vitro fino a circa 14 - 15passaggi, dopo di che le cellule senesce e devono essere eliminati.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
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