Abstract
الليفية / myofibroblasts (MFS) وقد تكتسب اهتماما متزايدا لدورها في التسبب ومساهماتها في كل من التئام الجروح وتعزيز المكروية الورم. في حين أن هناك حاليا عدة تقنيات لعزل MFS من الجهاز الهضمي (GI) الأنسجة، وهذا البروتوكول يدخل عنصرا جديدا من عزل هذه الخلايا اللحمية من الأنسجة المجمدة. تجميد عينات الأنسجة GI ليس فقط يسمح للباحث للحصول على عينات من المتعاونين في جميع أنحاء العالم، المصارف البيولوجية، والباعة التجارية، فإنه يسمح أيضا للتأخير في تجهيز عينات جديدة. سوف بروتوكول صفها تسفر باستمرار خلايا على شكل مغزل مميزة مع النمط الظاهري MF التي تعبر عن علامات CD90، α-SMA وvimentin. كما يتم الحصول على هذه الخلايا من عينات المرضى، واستخدام الخلايا الأولية أيضا يمنح صالح MFS محاكاة عن كثب من الدول، وهي أمراض السرطان وأمراض الأمعاء الالتهابية. هذا الأسلوب له النحلالتحقق من صحة ن في المعدة، الأمعاء الدقيقة، والقولون MF جيل ثقافة الأولية. ثقافات MF الأولية يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التجارب على مدى عدد من مرور ونقائها تقييم من قبل كل من مناعية وتحليل التدفق الخلوي.
Introduction
Myofibroblasts / الخلايا الليفية (MFS) تمثل السكان وفرة من الخلايا في الجهاز الهضمي (GI) الغشاء المخاطي. وتقع هذه الخلايا اللحمية فقط تحت ظهارة وتشكل شبكة مترابطة داخل الغشاء المخاطي الصفيحة المخصوصة في الأمعاء. MFS ليست مسؤولة فقط عن ترسب المصفوفة خارج الخلية، ولكن من خلال تنظيم نظير الصماوي قد تؤثر على النقل المنحل بالكهرباء، والرد، وظيفة حاجز ظهارة المجاورة 1 و 2. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت MFS أن تلعب دورا رئيسيا في التهاب والأنسجة إعادة عرض 3 و 4. Myofibroblasts هي جزء هام من المكروية الورم، حيث من المعروف أيضا على أنها الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان، والمساهمة في نمو الخلايا السرطانية، ويكون بمثابة محراب للخلايا الجذعية السرطانية 3. وتشير البيانات الناشئة التي MFS أيضا أن تخدم خلايا مقدمة للمستضد المحلية. بالإضافة إلى ذلك، MFS ظيفة المنظمين هامة من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، الم Ùالوراثة مجموعة متنوعة من السيتوكينات وعوامل النمو 5.
في الأشخاص الأصحاء، ويعتقد أن الخلايا MFS لتمييزها عن الخلايا الجذعية الوسيطة والتعبير على سطح الخلية، وعلامة الوسيطة، CD90 3، 5، وهذه الخلايا هي أيضا إيجابية للvimentin، ولكن سلبية لالظهارية والمكونة للدم علامة الخلية، EpCAM وCD45 ، على التوالي. واقترح Myofibroblasts أن يكون شكل تنشيط الخلايا الليفية ويمكن تمييزها عن الخلايا الليفية غير تفعيلها من خلال التعبير عن α-SMA 5.
على مدى العقد الماضي، مناهج متعددة لعزل myofibroblasts من الغشاء المخاطي للقولون الإنسان وقد نشرت معظمهم يعتمد على الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل Mahida آخرون 5-8. في حين أفادت الدراسات الفردية إجراءات العزل من مختلف مخاطية الأمعاء، أي بروتوكول عالمي لعزل MFS من مناطق متعددة من الجهاز الهضمي (أي المعدة والصغيرة ولوقد نشرت مخاطية الأمعاء الدو). وقد تم اختبار البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة واستخدمت بنجاح لجميع أنواع ثلاثة من الأنسجة المذكورة أعلاه. . وعلاوة على ذلك، لم يتم الإبلاغ عن إجراءات لعزل MFS من الغشاء المخاطي GI المجمدة.
هنا، نقدم طريقة الأمثل، والتي تقوم على الهضم الأنزيمي، ويسمح في الوقت نفسه لعزل المخاطية أمعاء الإنسان MFS للثقافة والتدفق الخلوي التحليل في هضمها طازجة، خلية واحدة، والأعمال التحضيرية المخاطية. هذه التقنية تعطي موثوق الثقافات الأولية مع النمط الظاهري MF. وعلاوة على ذلك، نفس الأساليب يمكن أن تستخدم لعزل MFS من العينات المجمدة من الأنسجة المعوية المعدية والصغيرة أيضا. عزل myofibroblasts من الأنسجة GI جديدة وقد وصفت سابقا؛ ومع ذلك، فإن استخدام العينات المجمدة يقدم العديد من الفوائد. وهي، أن الباحثين سوف تكون قادرة على جمع وتخزين الأنسجة من أي عدد من المتعاونين في جميع أنحاء العالم الذين لديهم capabiعنه lity لشحن عينات الأنسجة المجمدة. وعلاوة على ذلك، قد يجد الباحثون مجموعة من الأنسجة التخلص من غرفة العمليات و / أو جناح التنظير وفورية معالجة الأنسجة لعزل الصراع مع الجدول الزمني التجريب وضعها الراهن. أيضا، نظرا لطبيعة لا يمكن التنبؤ بها من الجراحة، قد تحدث الشراء الأنسجة في وقت متأخر جدا من اليوم، والتي سوف تحد من الوقت المتبقي لالأنسجة المعالجة. سوف تجميد الأنسجة لمعالجة لاحق تحسين هذه التحديات.
وأخيرا، وقد استخدمت هذه الأساليب بنجاح في عزلة myofibroblasts المعوية القولون، المعدة والصغيرة في الحالات المرضية مثل سرطان القولون والمستقيم وامراض التهابات الامعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على بروتوكول للحصول على التخلص من الأنسجة البشرية من المرضى لعمليات جراحية وإنشاء الثقافات الأولية من قبل فرع جامعة تكساس الطبي وجامعة نيو مكسيكو المؤسسي مجالس الاستعراض. يوصف المتطلبات العامة لشراء عينات الأنسجة البشرية أدناه. نلاحظ أنه منذ MFS قد تكون معزولة عن الأنسجة المجمدة، والمصارف البيولوجية والباعة التجارية هي أيضا خيارات قابلة للتطبيق.
1. الحصول على الأنسجة البشرية
- إرسال بروتوكول للحصول على أنسجة القولون الإنسان إلى مجلس المراجعة المؤسسية للموافقة عليها.
- إقامة علاقات تعاون مع أطباء الجراحة العامة و / أو جراحي القولون والمستقيم من أجل الحصول على الأنسجة البشرية لأغراض البحث. بالتعاون مع قسم علم الأمراض هو أيضا إلزامية حيث سيتم تحديد الأنسجة التي لا يشترط للتشخيص ويجوز أن يحدد للبحث.
- إسداء المشورة إلى الطبيب الشرعي لتقديم نسيج من الورم ومن ثم grosslذ الغشاء المخاطي العادي لا يقل عن 5 سم من الورم. المكان على الفور العينات في وسائل الإعلام غسل الجليد الباردة ووضع على الجليد. والطبيب الشرعي تحديد كمية الأنسجة التي يمكن أن تعطى بشكل آمن للأبحاث. الأنسجة الحد الأدنى المطلوب لMF العزلة هو 1.5 مم 2.
- استخدام الأنسجة التي تم الحصول عليها إما فورا لتأسيس الثقافات الأولية أو تجميد ومكان في -80 درجة مئوية لمدة العزل في المستقبل.
- إذا تجميد للعزلة في وقت لاحق، وقطع الأنسجة إلى ما يقرب من 1-2 ملم 2 قطعة، ضع في أنبوب المبردة مع 1 مل من وسائل الإعلام تجميد (انظر أدناه)، وتخزينها في -80 ° C. ملاحظة: استخدام هذا البروتوكول، وقد لوحظ العزلة الناجحة لMFS من الأنسجة المجمدة لأكثر من 4 سنوات.
2. إعداد الكواشف
- لحل كولاجيناز: إعداد 100 U / مل كولاجيناز الأول والثاني والرابع في محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ (انظر المواد الجدول
- إعداد محلول المخزون الدناز المياه القائمة على 10 ملغ / مل (3.55 UA / ملغ).
- إعداد غسل وسائل الإعلام: (MEM: 89 مل، للمضادات الحيوية مضاد فطري، 100X: 1 مل؛ FCS المعطل الحرارة: 10 مل)
- إعداد الخلايا الليفية نمو وسائل الإعلام: MEM: 500 مل زجاجة. L-الجلوتامين (200 ملي): 5 مل. MEM غير الضرورية الأحماض الأمينية، 100X الحل: 5 مل. سيبروفلوكساسين حمض الهيدروكلوريك (10 ملغ / مل): 570 ميكرولتر. المضادات الحيوية مضاد فطري، حل 100X: 10 مل. البيروفات الصوديوم (100 ملم): 5 مل. الحرارة المعطل FCS: 50 مل
- إعداد وسائل الاعلام _تجميد: وسائل الإعلام نمو الخلايا الليفية (الكاشف 2.4) مع إضافة 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)، ثم تصفية-ster يسودilize مع فلتر 0.22 ميكرون.
الأنسجة 3. إنزيمي دايجست الإنسان
- إذا تم تجميد الأنسجة في وسائل الإعلام تجميد، ومكان cryovial في الحارة (~ 37 درجة مئوية) المياه حتى يتم إذابة الأنسجة وسائل الإعلام.
- ل4-5 من 2 ملم 2 قطعة من النسيج، وغسل الأنسجة مرتين مع 10 مل من HBSS دون الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+.
- مرة واحدة وقد استقر الأنسجة عن طريق الجاذبية، تجاهل بعناية طاف دون الغزل العينة.
- إضافة 10 مل من محلول كولاجيناز إلى عينة ونقل الخليط الأنسجة الحل في العقيمة، أنبوب ريبونوكلياز خالية الدناز / مع المدمج في الدوارات لعينة التفكك. استخدام كولاجيناز لفصل المصفوفة خارج الخلية التي تحيط الجانب القاعدية من الخلايا الظهارية ويشكل جزء غير الخلوية من المخصوصة الصفيحة المخاطية.
- بإحكام أنبوب الوثيق وإرفاقه رأسا على عقب على كم من dissociator (على سبيل المثال، GentleMACs). إذا لم يكن لدى المختبر الوصول إلى tوقال انه سبق ذكره المعدات، وزيادة وقت كل خطوة الهضم للحصول على نتائج مماثلة.
- تشغيل h_tumor_01 البرنامج، لمحة محددة مسبقا المضمنة مع الجهاز (المدة الإجمالية 36 ثانية، مع نبضات متقطعة تتراوح ما بين 1000 - 4000 دورة في الدقيقة، مع 268 طلقة في المدى).
- بعد انتهاء البرنامج، فصل أنبوب من dissociator.
- احتضان العينة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران مستمر على شاكر في 140 دورة في الدقيقة. ملاحظة: للحصول على كميات من عينات الأنسجة متفاوتة، وقت الهضم ويمكن تخفيض نسبيا أو زيادة (أي كميات أكبر من الأنسجة قد تتطلب وقتا إضافيا).
- نعلق أنبوب رأسا على عقب على كم من dissociator.
- اختيار وتشغيل h_tumor_02 برنامج (المدة الإجمالية 37 ثانية، مع نبضات متقطعة تتراوح ما بين 1000 - 4000 دورة في الدقيقة، مع 235 طلقة في المدى).
- بعد انتهاء البرنامج، فصل أنبوب من dissociator.
- إضافة 50 ميكرولتر من الدناز محلول المخزون. استخدام الدناز إلى فصل / إزالة الخلايا الميتة وجزء DNA من الحطام الخلوي الذي يؤدي إلى الخلية الدموية.
- احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران مستمر على شاكر في 60 دورة في الدقيقة.
- نعلق أنبوب رأسا على عقب على كم من dissociator مرة أخرى.
- اختيار وتشغيل h_tumor_03 برنامج (المدة الإجمالية 37 ثانية، مع نبضات متقطعة تتراوح ما بين 1000 - 4000 دورة في الدقيقة، مع 168 طلقة في المدى).
ملاحظة: إذا لم يتم هضم الأنسجة تماما، الطرد المركزي في 250 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 ° C، ونبذ طاف، resuspend في 2 مل من خلية حل التفكك واحتضانها في RT لمدة 10 دقيقة. - تمرير تعليق الخلية من خلال معقمة الخلية 70 ميكرومتر مصفاة.
- تعليق خلية الطرد المركزي في 250 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 ° C. نضح طاف تماما.
- غسل الخلية بيليه مرتين مع 25 مل من HBSS دون الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ وتجاهل طاف.
- قبل الماضي كانح، عد عدد الخلايا باستخدام نظام العد خلية الآلي المتوفرة في المختبر أو يدويا باستخدام عدادة الكريات. لMF الجيل الثقافة الابتدائية المضي قدما لالخطوة 3.19.1، لتحليل أو فرز MFS باستخدام التدفق الخلوي المضي قدما لالخطوة 3.19.2.
- لعزل ونمو ثقافة MF نقية (الشكل 1)، ونبذ طاف من الطرد المركزي الماضي، بيليه الخلية resuspend في كمية مناسبة من وسائل الإعلام الليفية العزلة اللازمة لالبذور تصل إلى 4 × 10 6 خلايا في 3 مل من وسائل الإعلام لكل بئر في 6 لوحات جيدا، وتعامل ثقافة الخلية. انتقل إلى الخطوة 3.20.
- لتحليل أو فرز MFS باستخدام التدفق الخلوي، ومكان لتصل إلى 2 × 10 6 في 2 مل من وسائل الإعلام الليفية العزلة في 24 جيدا، لوحة منخفضة ملزمة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪. هذا هو لاستعادة الحواتم سطح الخلية التي قد تتأثر الإجراء الأنزيمية. ثم جمع تعليق خلية وعدد الخلايا تعافى والمضي قدمالالمناعية والتدفق الخلوي تحليل 8.
- زراعة خلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام حتى تشكيل ~ 80٪ متموجة MF أحادي الطبقة (الشكل 1D-E).
- خلايا مرور في قوارير T25 مع من 6 لوحة جيدا في نسبة 1: 1 وتنمو ل~ 10-14 يوما في وسائل الاعلام نمو الخلايا الليفية إلى تحقيق 80-100٪ confluency.
- توسيع الثقافة عن طريق الركض الخلايا من T25 T75 إلى الخلايا في نسبة 1: 2. مرة واحدة الخلايا تصل confluency، استخدم قارورة واحدة لتحليل معزولة MF نقاء باستخدام بواسطة التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا 5. تجميد أو مرور قارورة T75 آخر لثقافة MF في نسبة 1: 3.
ملاحظة: عند تحليل التدفق الخلوي، ومن المتوقع أن GI الغشاء المخاطي انسجة MF المنشأ الوسيطة عندما نموا في الثقافة سوف يكون النمط الظاهري التالية: EpCAM-، CD31-، CD45-، vimentin +، α-SMA +، CD90 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول الهضم الأنزيمي، وكنا على الدوام قادرة على عزل وتنمو MF الأمعاء السكان CD90 + الخلايا اللحمية المخاطية من GI العينات الجراحية والخزعات (الشكل 1). ويمكن ملاحظة مرئية MF مستعمرة الانتشار في يوم 2-5 بعد البذر تعليق خلية وحيدات النوى إلى 6 لوحات جيدا (الشكل 1A-B). ثقافات الأولية MF تصل ~ 50-70٪ التقاء يوم 7-11 (الشكل 1C-D).
الشكل 1. Myofibroblasts الابتدائية (MFS) المعزولة من المجمدة الجهاز الهضمي الأنسجة. A التكبير 20X من MFS البشري معزولة من العينة المجمدة من الغشاء المخاطي للقولون البشري. (A) يوم 2. مجموعات منتسب من خلايا انسجة موجودة. (B) يوم 4. spindle- السمة أو stellate-وقد وضعت مورفولوجيا الخلايا وغير واضحة تماما. كثافة الخلايا الليفية تستمر في الزيادة على (C) يوم 7 و (D) يوم 10. (E) حسب يوم 14، هناك أحادي الطبقة متموجة تماما من MFS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هناك انخفاض طفيف في جدوى إعداد خلية واحدة المخاطية على تجميد العينات الجراحية (~ 10٪، الجدول 1). ومع ذلك، مع تجميد، وهناك أيضا انخفاض في التلوث الفطري / بكتيرية من النسيج ملاحظتها وبالتالي زيادة في كفاءة توليد ثقافة MF.
| مصدر GI الأغشية المخاطية Myofibroblasts | قابلية * من الغشاء المخاطي واحدة تعليق خلية إعداد (ن = 11) </ td> | MF عزل الكفاءة (ن = 11) |
| طازج | 88.32 ± 2.369 | 8 من أصل 11 (82٪) |
| مجمد | 78.64 ± 4.174 | 11 من أصل 11 (100٪) |
| * قابلية على النحو الذي يحدده مكافحة الخلايا الآلية التالية 0.4٪ التريبان حل الأزرق تلطيخ. | ||
الجدول 1. قابلية وكفاءة الأرومة الليفية العضلية الاسترداد. جديدة مقابل الأنسجة المجمدة.
تم تحليل نقاء الثقافة MF لدت بعد نشر الخلايا على الأقل اثنين من الممرات، وذلك لضمان عدم وجود تلوث من الخلايا المخاطية الأخرى. باستخدام متحد البؤر المجهر، وقد تبين أن MFS كانت إيجابية للعلامة من CD90 نسب الخلية الوسيطة وvimentin، والمرضس α-SMA، علامة من خلايا اللحمة المتوسطة متباينة (الشكل 2).
الشكل 2. عزل خلايا لقد شكل الخلايا الليفية وعبر عن MF علامات. المناعية معزولة MF أحادي الطبقة، passaged مرتين على الأقل في الثقافة وثابتة مع 1٪ امتصاص العرق، immunostained وتحليلها بواسطة المجهر متحد البؤر كما هو موضح سابقا 9. أعربت الخلايا المعزولة علامة على الأرومة الليفية العضلية، و-SMA (باللون الأخضر، والكشف عنها من قبل الفئران ماب استنساخ 1A4)، وعلامات الوسيطة: vimentin (باللون الأحمر، والكشف عنها بواسطة MAB، استنساخ RV202) وCD90 (باللون الأزرق، والكشف عنها من قبل الفئران ماب، استنساخ 5E10). في الصورة المدمجة، برتقالي / أصفر خلايا تمثل شارك توطين ل-SMA وvimentin. الأرجواني يمثل شارك في توطين vimentin وCD90. حجات ه انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد أكد هذه البيانات عن طريق تحليل التدفق الخلوي (الشكل 3). كما ذكرت سابقا، كما كان MFS عادية معزولة عن GI الغشاء المخاطي السلبي لصانعي المكونة للدم CD45 CD31 و، وكذلك علامة الظهارية، EpCAM 3، 5، 9.
الشكل 3. التوصيف المظهري من الأرومة الليفية العضلية الأولية (MF) الثقافات. أجريت الدراسات على MFS الأولية معزولة من الغشاء المخاطي للقولون وpassaged مرتين على الأقل في الثقافة. المناعية، تليها تحليل التدفق الخلوي، وأكد أن الخلايا المعزولة لها MF النمط الظاهري إيجابية بشكل موحد لvimentin، α-SMA، وCD90. أدرجت ضوابط نمط إسوي المناسبة في الدراسة.arge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين تم تطوير هذا البروتوكول لتطبيق الأبحاث فقط، في ضوء تزايد الأهمية الحاسمة للخلايا انسجة باعتباره المحتملة سرطان المؤشرات الحيوية النذير والهدف العلاجي، والقدرة على تجميد biospecimens "وظيفية" لاستخدامها لاحقا تقدم ميزة كبيرة. هذا يمثل ميزة فريدة من نوعها لخلق biorepository السريرية، التي قد تكون الأدوات كما إضافية تساعد على دفع عجلة التطور في الطب شخصية 10، 11. مماثلة لنتائج تقارير سابقة عن الوسيطة الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة معزولة من انسجة المجمدة جزء الأوعية الدموية، وفعلنا لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة في علامات و / الردود / المناعة التكاثري التهابات والنشاط الأيضي MFS عزل من العينات المجمدة المخاطية. 12 ومع ذلك، فإننا لا نستبعد أن بعض الردود غير اختبار مثل ترسب علامة خارج الخلية، وما إلى ذلك قد تختلف . وهكذا، في تلك الحالات من العمل مع المجهول / unreأحداث استدار والمحققين قد تقيم تجربة المقارنة التي سيتم اختبار وظيفة معينة جنبا إلى جنب في MFS معزولة عن الأنسجة الطازجة والمجمدة من نفس الفرد.
وتستند غالبية تقنيات أساليب العزل الأرومة الليفية العضلية إما على استخدام تنميق الميكانيكية للأنسجة جنبا إلى جنب مع العلاج إما مع وكلاء مخلبية [ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، DL-Dithiothreitol (DTT)] أو حال الكولاجين وبروتين الانزيمات 13-14 . وقد ذكرت سابقا أن توليد MF من المعدة، والأمعاء الدقيقة والقولون كفاءة باستخدام أسلوب ثمرة وصف في البداية من قبل Mahida وآخرون، والتي تقوم على تنميق الميكانيكية وتطبيق وكلاء مخلبية 5، 6، وهنا الأنزيمية إضافية وأفاد الأسلوب الذي يسمح للجيل الثقافات الأولية من MFS من عينات الأنسجة المجمدة. في حين أن كلا تقنيات ثمرة والأنزيمية الهضم همفعالة على قدم المساواة في عزلة myofibroblasts الأولية من المعدة، الأمعاء الصغيرة، والأنسجة القولون، لا يزال هناك نقاش داخل المجتمع العلمي حول ما إذا كانت الخلايا المستزرعة الحفاظ في الجسم الحي على النمط الظاهري. تقنية ورد في هذه المخطوطة تسمح لتوليد ليس فقط الثقافة MF الأولية، ولكن تسمح أيضا خارج الحي تحليل السكان مختلفة من الخلايا التي قدمت في GI الغشاء المخاطي 15-17. ويشمل ذلك تحديد الوفرة النسبية مع الأنسجة وعلامات أنها تعبر، ولكن أيضا لاستخدامها في المقايسات الفنية (على سبيل المثال، النشاط الأنزيمي أو إنتاج السيتوكينات). الوفرة النسبية للMFS داخل الأنسجة ويمكن تقييم استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية عن طريق فرز الخلايا استنادا إلى علامات فريدة من نوعها لMFS (أي EpCAM-، CD31-، CD45-، vimentin +، α-SMA +، CD90 +) وقياس وجودهم بالمقارنة مع المجموع الكلي لعزل خلايا طازجة أو، إذا لزم الأمر، عن طريق القيام نسبة مقارنة مع أنواع الخلايا متميزة. وعلى الرغم من فعاليةمن العزلة خلية قابلة للحياة، وتحديد الجدير بالذكر أن هذا وغيرها من البروتوكولات القائمة على الهضم الأنزيمي هو أن النشاط بروتين انزيم العاملين قد يغير الحواتم سطح الخلية. للتغلب على هذا، ونحن تسمح للخلايا لاسترداد O / N من أجل الحواتم إلى إعادة أعرب-على نحو مماثل لدولتهم مهضوم.
تمكنا باستمرار لتوليد ثقافة MF من الأنسجة المجمدة مع فقدان الحد الادنى من بقاء الخلية. القدرة على استرداد هذه الثقافات من العينة المجمدة تسمح للباحثين لمعالجة والحفاظ على أفضل عينات الأنسجة الجراحية و / أو بالمنظار التي تم الحصول عليها أثناء الليل أو خارج ساعات العمل العادية. وعلاوة على ذلك، فإن الانخفاض في فقدان المشتراة، الأنسجة القابلة للاستخدام بسبب الملوثات البكتيرية و / أو الفطرية أثناء عملية التجميد بمثابة ميزة إضافية. بعد عزل، يجب أن يقتصر استخدام المضادات الحيوية فقط أول 2-3 الممرات، وبعد ذلك زراعة يجب الاستمرار في استخدام معيار aseptiج تقنية ومكافحة فطاري / مكافحة الميكوبلازما خالية من وكيل وسائل الإعلام. وقد تبين أن الاستخدام المنتظم لهذه العوامل في الثقافة الخلوية لممارسة تأثيرات cytoxic، وهي نمو الخلايا، انحطاط الخلوية، وعلى المناسبة، وفاة 18.
الهضم الأنزيمي سوف تسفر السكان الخلية متعددة موجودة في المخصوصة GI الصفيحة بما في ذلك: الخلايا المناعية والخلايا الظهارية، وMFS. بعد مرور أول، وفقط MFS تبقى ويمكن التعرف على النمط الظاهري الفريد (الشكل 1)، وكذلك من خلال لوحة خلية محددة من تحليل علامة (CD90، و-SMA، وvimentin إيجابي، ولكن سلبية لالظهارية والمكونة للدم علامات) 3، 5، 9، في حين قبلت على نطاق واسع أن myofibroblasts تنشأ من الخلايا الجذعية الوسيطة في البلد المضيف الطبيعي، في الحالات المرضية مثل التهاب المزمن والسرطان، وقد تبين جزء من السكان من MFS الظهارية صريحة أو علامات المكونة للدم 3. وقد اقترحت هذه النتائج لربما يكوننتيجة ل-الظهارية الوسيطة الانتقالية (EMT) أو تجنيد الخلايا الليفية المشتقة من النسب المكونة للدم 3، 19. وعلاوة على ذلك، ينبغي توخي الحذر إضافية إذا تم immunostained الخلايا وتحليل التدفق الخلوي للعلامات التي نوقشت أعلاه. في حين أننا لم نعثر على فقدان حاتمة أن يكون مشكلة بعد السماح للخلايا لاسترداد O / N من الأنسجة هضمها طازجة المحتضنة في لوحات غير ملتصقة، ويمكن فقدان الحواتم يحدث عند استخدام التربسين أو أي انزيم بروتين آخر خلال مفرزة من خلايا من لوحة. وهكذا، لتجنب هذه المشكلة، نوصي لاستخدام الحل تفارق الخلية مع وكلاء مخلبية مثل EDTA عندما يقصد الثقافات MF ملتصقة لالمناعية تليها تحليل التدفق الخلوي. بعد تأسيس ثقافة الأولية من myofibroblasts، والخلايا ويمكن بعد ذلك يتم تجميدها في وسائل الإعلام تجميد وتخزينها في النيتروجين السائل. هذه الخلايا يمكن استخدامها في مجموعة من التجارب في المختبر حتى ما يقرب من 14-15الممرات، وبعد ذلك الوقت خلايا senesce ويجب التخلص منها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
