Abstract
成纤维细胞/肌成纤维细胞（MFS）已获得越来越多的关注他们在发病中的作用及其对肿瘤微环境的两个伤口愈合和推广贡献。虽然目前有很多技术的MF的胃肠道（GI）组织中分离，该协议引入了一种新的从冰冻组织这些间质细胞的分离的元素。冷冻胃肠组织标本不仅允许研究者获得来自世界各地的合作者，生物库，和商业供应商的样品，它也允许新鲜样品的延迟处理。所描述的协议将始终如一地产生特征梭形细胞表达标记CD90，α-SMA和波形对MF型。因为这些细胞来自患者样品衍生，使用原代细胞也赋予密切模仿隶属函数的受益于疾病状态，即癌和炎症性肠疾病。这种技术具有蜂ñ证实胃，小肠和结肠MF原代培养一代。主培养物的MF可以使用在实验繁多在若干通路和它们的纯度评估由两个免疫细胞化学和流式细胞术分析。
Introduction
肌成纤维细胞/成纤维细胞（MFS）表示细胞在胃肠道黏膜丰富的人口。这些基质细胞就位于下方的上皮形成和在肠道内的粘膜固有层的互连网络。微丝不仅负责细胞外基质的沉积，但通过旁分泌调节可影响电解质转运，恢复原状的，屏障功能相邻上皮1,2。此外，隶属函数已被证明在炎症和组织中发挥关键作用重塑3,4。肌成纤维细胞是在肿瘤微环境，在那里他们也被称为癌相关成纤维细胞的一个关键部分，并有助于肿瘤细胞的生长，并作为一个利基癌症干细胞3。新出现的数据表明，微丝也可用作本地抗原呈递细胞。此外，隶属函数功能的固有免疫和适应性免疫反应的重要调节器，机生产线CING多种细胞因子和生长因子5。
在健康个体中，微丝细胞被认为从间充质干细胞分化和表达在其细胞表面上，所述间充质标记物，CD90 3,5，这些细胞也表达vimentin，但阴性上皮细胞和造血细胞标记物的EpCAM和CD45分别。肌成纤维细胞被建议是成纤维细胞的活化形式，并且可以从非活化的成纤维细胞用α-SMA 5的表达来区分。
在过去十年中，多种方法用于从人结肠黏膜肌成纤维细胞的分离已公布-大多是基于最初由Mahida 等人 5-8中记载的方法。虽然个别的研究报道来自各种肠粘膜，对于隶属函数的从胃肠道的多个区域（即，胃，小和升隔离没有通用协议分离程序阿尔赫肠粘膜）已经出版。本文提出的方案已经过测试，并成功地用于所有三个类型的组织上面提到的。 。此外，还没有被报道用于从冷冻胃肠粘膜分离的MF流程。
这里，我们提出一种优化方法，它是基于酶消化，并且同时允许对人体肠道粘膜的MF的培养分离和流式细胞术分析在新鲜消化，单细胞，粘膜制剂。这种技术可靠地得到原代培养与MF的表型。此外，同样的方法可以用来从胃和小肠的组织冷冻样品隔离微丝为好。从新鲜的GI组织成肌纤维细胞的分离先前已描述;然而，冷冻样品的利用带来了许多好处。即，研究人员将能够收集和存储组织免受任何数目在全世界合作者谁具有capabi的lity运送冷冻组织样本。此外，研究人员可能会发现从手术室和/或内窥镜套件和立即丢弃组织的处理的组织为隔离与他们当前的实验时间表冲突的集合。此外，由于手术的不可预测性，可能会出现组织采购非常晚了一天，这将限制左为加工组织的时间。冷冻组织进行后续处理会减轻这些挑战。
最后，这些方法已被成功地用于在结肠，胃和小肠肌纤维母细胞在疾病状态如大肠癌和炎症性肠疾病的隔离。
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Protocol
该协议获得从手术患者丢弃的人体组织，并建立原代培养的是经德克萨斯大学医学科和新墨西哥州机构审查委员会的大学大学。用于人体组织标本采购的一般要求如下所述。注意，由于隶属函数可以从冰冻组织，生物银行和商业供应商分离出来的也是可行的办法。
1.获取人体组织
- 提交协议来获得人结肠组织的机构审查委员会批准。
- 建立合作与普通外科医生和/或结直肠外科为了获得人体组织进行研究。与病理科协作也是强制性的，因为它们将被判定为不需要进行诊断和可被指定为研究的组织。
- 奉劝病理学家从肿瘤提供组织，然后grosslŸ正常粘膜至少5厘米的肿瘤。立即放置在冰冷的洗涤介质的样品，并放置在冰上。病理学家将确定可以用于研究被安全地给定组织的量。需要MF隔离最小的组织为1.5 平方毫米。
- 使用获得的组织或者立即建立原代培养物或冷冻并置于在-80℃下以供将来隔离。
- 如果冷冻购买隔离，切割组织成约1 - 2毫米2件 ，放入低温管与1ml冷冻介质（见下文），并储存在-80℃。注：利用此协议，隶属函数的自组织冻结了超过4年成功分离已被观察到。
2.准备试剂
- 胶原酶的解决方案：准备100 U / ml的胶原酶I，II和IV在汉克的平衡盐溶液（HBSS）与钙 / 镁离子（ 见材料表
- 制备水性DNA酶原液以10毫克/毫升（3.55 UA /毫克）。
- 准备清洗介质：（MEM 89毫升，抗生素 - 抗真菌剂，100×1毫升，热失活的FCS 10毫升）
- 准备成纤维细胞生长培养基：MEM：一瓶500毫升; L-谷氨酰胺（200 mM计）：5毫升， MEM非必需氨基酸，100倍的溶液：5毫升，环丙沙星盐酸（10毫克/毫升）：570微升;抗生素 - 抗真菌剂，100倍溶液10毫升，丙酮酸钠（100毫摩尔）：5毫升，热灭活的FCS 50 ml的
- 制备冻结介质：成纤维细胞生长培养基（试剂2.4）用加入了10％的二甲亚砜（DMSO）中，然后过滤，韦伯斯特ilize用0.22微米的过滤器。
3.酶促文摘人体组织
- 如果组织被冻结在冷冻媒体，地方离心管中的温暖（〜37℃）的水，直到组织和媒体解冻。
- 为4 - 5 2 2毫米组织片，两次用10ml的HBSS洗组织不含Ca 2+ / Mg 2 +的。
- 一旦组织已落户在重力作用，精心弃上清没有旋转样品。
- 加入10 mL胶原酶溶液的样品，并在组织的溶液混合物与转移到无菌的，DNA酶/无RNase管内置转子样品解离。用胶原酶以解离细胞外基质包围的上皮细胞的基础方面，形成在粘膜固有层中的非细胞部分。
- 紧紧贴着管颠倒其安装到离解器（ 例如 ，GentleMACs）的袖子。如果实验室不具有接入到t他上述的设备，增加每个消化步骤的时间，以获得比较的结果。
- 运行程序h_tumor_01，预先设定的信息包括与机器（36秒的总的持续时间，与间歇脉冲范围从1000 - 4000转，以268转每运行）。
- 终止程序结束后，取下管从离解。
- 在37℃下连续旋转孵育样品45分钟在摇床上，在140转。注意：对于不同的组织样本的量，消化的时间可以按比例减少或增加（ 即 ，更大的组织的量可能需要额外的时间）。
- 连接管倒到离解的袖子。
- 选择并运行程序h_tumor_02（37秒的总时间，间歇性脉冲，从1000 - 4000转，235发每运行）。
- 终止程序结束后，取下管从离解。
- 加入50微升DNA酶原液。使用DNA酶以解离/去除死细胞和细胞碎片的DNA的级分导致细胞结块。
- 在37℃下在摇床上连续旋转孵育样品30分钟以60rpm。
- 再次将试管倒置到离解的袖子。
- 选择并运行程序h_tumor_03（37秒的总时间，间歇性脉冲，从1000 - 4000转，168发每运行）。
注意：如果组织未完全消化，离心机在250×g的10分钟，在20℃，弃上清，重悬在2毫升细胞解离溶液和在室温下孵育10分钟。 - 通过无菌70微米的细胞过滤的细胞悬浮液。
- 离心细胞悬浮液在250×g的10分钟，在20℃。吸去上清液彻底。
- 洗涤细胞沉淀两次用25ml的HBSS不含Ca 2+ / Mg 2 +的并弃去上清液。
- 前的最后被小时，使用一个自动细胞计数系统，可以在实验室或手动使用血细胞计数器计数细胞数。对于MF原代培养一代继续开行步3.19.1，进行分析或隶属函数的使用流式细胞仪进行步3.19.2排序。
- 分离和纯的MF培养的生长 （图1）中，丢弃从最后离心，重悬细胞沉淀上清液中的成纤维细胞分离培养基的种子高达4×10 6细胞所需要的适当的量在3ml的培养基，每孔中6孔，细胞培养处理板。继续执行步骤3.20。
- 用于分析或微丝的使用流式细胞术，最多放置2×10 6在2 ml成纤维细胞分离培养基的24孔，低的结合板孵育O / N在37℃，5％CO 2的分选。这是恢复可能受影响的酶的过程中的细胞表面表位。然后收集细胞悬液，计数回收的细胞，并继续用于免疫染色和流式细胞仪分析8。
- 生长的细胞在37℃，5％的CO 2。更换介质每2 - 3天，直到形成80％汇合MF单层〜（ 图1D-E）。
- 代细胞在T25烧瓶与来自6孔板中以比1:1和生长〜10 - 在成纤维细胞生长培养基中7-14天实现80 - 100％汇合。
- 2：从T25传代细胞T75细胞比1扩大文化。一旦细胞达到汇合，利用流式细胞仪如前5描述用一个锥形瓶孤立MF纯度的分析。 3：在比1冻结或通过MF文化的另一种T75烧瓶中。
注意：当通过流式细胞术分析，因此预 计间充质来源的胃肠粘膜基质MF当在培养生长将具有以下表现型：EpCAM-，CD31，CD45，波形蛋白+α-SMA +，CD90 +。
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Representative Results
使用此酶消化协议中，我们一直能够隔离并从胃肠手术标本和活检（图1）生长的MF人口肠道CD90 +粘膜基质细胞。 5播种单个核细胞悬液到6孔板（ 图1A-B）之后-可见MF菌落数量激增可能在第2天进行观察。对MF原代培养达到〜50 - 70％汇合由7天- 11（图1C-D）。
图从冷冻胃肠道组织中分离1.原发性肌成纤维细胞（MFS）。人类的MF的20倍放大倍率分离出人类结肠黏膜的冰冻标本。 （ 一）日基质细胞黏附2.集群都存在。 （二）天4.特征纺锤或stellate-细胞形态已开发并是显而易见的。成纤维细胞的密度继续增加（C）7日和 （D）10日（ 五）14日，有隶属函数的完全融合单层。 请点击此处查看该图的放大版本。
对所手术标本（〜10％，表1）的冷冻略有下降粘膜单细胞制剂的可行性。然而，随着冷冻，也有在该组织的细菌/真菌污染的减少观察，因此，增加了在MF培养的生成效率。
| 胃肠道粘膜肌成纤维细胞的来源 | 生存能力*黏膜单细胞悬液准备（N = 11）</ TD> | MF分离效率（N = 11） |
| 新鲜 | 88.32±2.369 | 8出11（82％） |
| 冰冻 | 78.64±4.174 | 11选自11（100％） |
| *活力通过自动细胞计数以下0.4％台盼蓝染色解决方案所确定的。 | ||
表1. 活力和肌成纤维细胞恢复的效率 。新鲜与冷冻组织。
细胞中繁殖后的至少两个通道，以确保没有污染的其他粘膜细胞生成的MF培养的纯度进行分析。使用共焦显微镜，证明该微丝为阳性的间充质细胞谱系CD90和波形蛋白和ALS的标记øα-SMA，中分化间质细胞的标记物（ 图2）。
图2.分离的细胞具有如先前所描述9 成纤维形状和快速的MF标记。免疫染色分离的MF单层，传代培养的至少两倍固定用1％多聚甲醛，免疫染色和共聚焦显微镜分析。分离的细胞表达的标志物成肌纤维细胞的，一个α-SMA（显示为绿色，作为检测由鼠mAb克隆1A4），和间质标记物：波形蛋白（红色，由单克隆抗体，克隆RV202检测）和CD90（蓝色，通过所检测的鼠单克隆抗体，克隆5E10）。在合并的图像，橙/黄色细胞代表共定位一个-SMA和波形蛋白;紫色代表共定位波形和CD90的。 普莱斯 e单击此处查看该图的放大版本。
此数据通过流式细胞术分析（图3）确认。如先前报道，正常微丝从胃肠粘膜分离也为阴性造血决策者CD45和CD31，以及上皮标记物，EpCAM的3，5,9。
图3.原发性肌成纤维细胞（MF）的培养物的表型表征。研究进行初级微丝从结肠粘膜分离进行传代并在至少两个时间中培养。免疫染色，随后流式细胞仪分析，证实该分离的细胞具有表型的MF是均匀的正面为波形蛋白，α-SMA，和CD90。适当的同型对照纳入研究范围。arge.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
虽然该协议是为研究中的应用开发只，在成长为一个潜在的癌症预后标志物和治疗靶点基质细胞至关重要的光，冻结“功能性”生物标本以备后用的能力提供了一个显著优势。这是一个独特的优势，为创作临床biorepository的，可作为额外的工具服务促进个性化医疗10,11的发展，类似于先前针对脂肪间充质干细胞从冷冻的基质血管级分中分离报告的结果，我们进行了未观察到在标记和增殖/免疫/炎性反应和MFS的代谢活性从冷冻的粘膜标本中分离的任何显著改变。12然而，我们不排除一些非测试应答，例如胞外标记沉积等可能会发生变化。因此，与未知工作这些案件/ unre停泊的事件，调查人员可能建立一个对比实验，其中特定功能将被测试侧由端中的MF来自同一个体的冷冻和新鲜组织中分离。
多数人的技术成肌纤维细胞的分离方法是基于两种对使用的组织联合治疗或者与螯合剂[乙二胺四乙酸（EDTA），DL-二硫苏糖醇（DTT）]或胶原溶解酶和蛋白酶13-14的机械切碎的。据以前报道，代的MF从胃，小肠和结肠的是有效利用由Mahida 等，这是根据机械切碎和应用螯合剂5,6最初描述的生长方法，在这里，附加的酶报道的方法，使该微丝从冰冻组织标本初级培养的产生。虽然这两种技术，生长和酶消化，是同样有效的从胃，小肠和结肠组织初级成肌纤维细胞的分离，仍有科学界辩论上培养的细胞是否保留其在体内的表型。报道在这个手稿的技术允许不仅代主MF培养的，但也允许在胃肠粘膜15-17呈现不同的细胞群的体外分析。这包括确定它们的相对丰度与组织及表达它们的标记物，也为在功能测定法（例如，酶活性或细胞因子的产生）使用。隶属函数的组织中的相对丰度可使用FACS通过时相比，分选基于标记特有的隶属函数（即，EpCAM-，CD31，CD45，波形蛋白+α-SMA +，CD90 +）和量化它们的存在的细胞来评估总的是新鲜分离的细胞，或者，如果需要的话，做的比较比有不同的细胞类型。尽管疗效的活细胞分离，这和其他协议基于酶消化一个值得注意的限制是，酶用量可以改变细胞表面表位的蛋白水解活性。为了克服这个问题，我们让细胞恢复O / N，以便被重新表达的表位相同，其简化的状态。
我们已经能够始终如一地产生从冷冻的组织的MF培养用的细胞活力损失最小。从冰冻标本中恢复这些文化的能力，使研究人员能够操纵和更好地保持在夜间或超出常规的工作时间得到手术和/或镜下组织标本。另外，由于在冷冻过程中的细菌和/或真菌污染物的降低采购，可用组织的损失作为一个额外的优点。以下隔离，抗生素的使用应限于只有第2 - 3次传代，之后培养应该继续使用标准aseptiC等技术和抗真菌/抗支原体剂的培养基。常规使用在蜂窝培养这些药物已被证明发挥细胞毒性作用，即细胞生长，细胞退化，并且有时，死亡18。
酶消化将产生本在GI固有层包括多个细胞群：免疫细胞，上皮细胞，和MFS。第一通道之后，仅微丝将保持，并且可以通过其独特的表型（ 图1），以及通过标记分析（CD90，一个-SMA和波形蛋白阳性的细胞特异性的面板被识别，但负上皮和造血标记）3，5，9。尽管人们普遍认为肌纤维母细胞从间质干细胞出现在正常的宿主，在疾病状态如慢性炎症和癌症，微丝的亚群已经显示明示上皮或造血标记物3。这些研究结果已被认为可能是的上皮-间质转化（EMT）或招募从造血谱系3，19衍生纤维细胞的结果，另外，附加应谨慎使用，如果细胞是免疫染色并通过流式细胞仪对上面所讨论的标志物进行分析。虽然我们还没有发现该表位的损失是个问题使细胞从新鲜消化的组织培养非粘附板回收O / N后，抗原决定簇的缺失可以支队过程中使用胰蛋白酶或其他蛋白水解酶时，会发生细胞从板。因此，为了避免这个问题，我们建议使用与螯合剂如EDTA的细胞分离液时，粘附MF文化是用于免疫染色，随后用流式细胞仪分析。后肌成纤维细胞原代培养物被建立，该细胞然后可以被冻结在冷冻介质和贮存在液氮中。这些细胞可用于在体外实验的阵列，直到大约14 - 15代，之后将细胞衰老和应该被丢弃。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
