Abstract
Fibroblaster / myofibroblaster (MFS) har allt större uppmärksamhet för sin roll i patogenes och deras bidrag till både sårläkning och främjande av tumören mikromiljö. Det finns för närvarande många tekniker för isolering av MFS av gastrointestinala (GI) vävnader, introducerar detta protokoll ett nytt inslag i isolering av dessa stromaceller från fryst vävnad. Frysning GI vävnadsprover inte bara tillåter forskaren att skaffa prover från hela världen medarbetare, biobanker och kommersiella säljare, också tillåter det den fördröjda behandlingen av färska prover. Den beskrivna protokollet kommer konsekvent att ge karaktäristiska spindelformade celler med MF fenotyp som uttrycker markörerna CD90, α-SMA och vimentin. Eftersom dessa celler är härledda från patientprover, användning av primära celler ger också fördelen av ett nära härmande MFS av sjukdomstillstånd-nämligen cancer och inflammatoriska tarmsjukdomar. Denna teknik har bietn valideras i magsäcken, tunntarmen och kolon MF primär kultur generation. Primära MF kulturer kan användas i ett brett spektrum av experiment under ett antal passage och deras renhet bedöms av både immunocytokemi och flödescytometrianalys.
Introduction
Myofibroblaster / fibroblaster (MFS) utgör en riklig population av celler i mag (GI) slemhinna. Dessa stromaceller ligger precis under epitel och bildar ett sammanhängande nätverk inom mucosal lamina propria i tarmen. MFS är inte bara ansvarig för avsättningen av den extracellulära matrisen, utan genom parakrin reglering kan påverka elektrolyt transport, restitution och barriärfunktionen hos den intilliggande epitel 1, 2. Dessutom har MFS visat sig spela en viktig roll vid inflammation och vävnads remodeling 3, 4. Myofibroblaster är en viktig del av tumören mikromiljö, där de är även känd som cancerassocierade fibroblaster, och bidra till tumörcelltillväxt och fungera som en nisch för cancerstamceller 3. Emerging data tyder på att MFS också kan fungera som lokala antigenpresenterande celler. Dessutom, MFS fungerar som viktiga regulatorer av medfödda och adaptiva immunsvar, producing en mängd olika cytokiner och tillväxtfaktorer 5.
Hos friska individer är MFS-celler tros skilja från mesenkymala stamceller och uttrycker på sin cellyta, den mesenkymala markör, CD90 3, 5. Dessa celler är också positivt för vimentin, men negativt för epitel och hematopoetisk cellmarkör, EpCAM och CD45 , respektive. Myofibroblaster föreslås vara en aktiverad form av fibroblaster och kan särskiljas från icke-aktiverade fibroblaster genom uttryck av α-SMA 5.
Under det senaste årtiondet, flera metoder för isolering av myofibroblaster från humana kolonslemhinnan har publicerats, huvudsakligen baserad på den metod som ursprungligen beskrivits av Mahida et al. 5-8. Även enskilda studier rapporterar isoleringsförfaranden från olika tarmslemhinnan, ingen universal protokoll för isolering av MFS från flera områden i mag-tarmkanalen (dvs, mag-, små och large mukosa) publicerad. Protokollet presenteras här har testats och framgångsrikt använts för alla tre typer av vävnad som nämns ovan. . Dessutom har förfaranden för att isolera MFS från frysta GI slemhinnan inte rapporterats.
Här presenterar vi en optimerad metod, som bygger på enzymatisk digestion, och samtidigt gör det möjligt för isolering av människans tarm mucosal MFs för kultur och flödescytometrianalys i färskt omsatta och enda cell, mucosal preparat. Denna teknik ger ett tillförlitligt primära kulturer med en MF fenotyp. Dessutom kan samma metoder användas för att isolera MFS från frysta exemplar av mag- och små tarm vävnader också. Isolering av myofibroblaster från färsk GI vävnad har tidigare beskrivits; Men användningen av frysta prover ger många fördelar. Nämligen, skulle forskarna kunna samla in och lagra vävnader från valfritt antal medarbetare över hela världen som har capability leverans frusna vävnadsprover. Dessutom kan forskarna hitta insamling av kasserade vävnad från operationssalen och / eller endoskopi svit och omedelbar bearbetning av vävnad för isolering till konflikt med deras nuvarande experiment schema. Dessutom, på grund av den oförutsägbara karaktären av kirurgi, kan vävnadstillvaratagande uppträder mycket sent på dagen, vilket kommer att begränsa tid kvar för bearbetning vävnad. Frysning vävnad för senare bearbetning kommer att förbättra dessa utmaningar.
Slutligen har dessa metoder med framgång använts i isoleringen av kolon, gastriska och små tarm myofibroblaster i sjukdomstillstånd, såsom kolorektalt karcinom och inflammatoriska tarmsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet för erhållande av kasserade mänsklig vävnad från kirurgiska patienter och inrättandet av primära odlingar godkändes av University of Texas Medical Branch och University of New Mexico institutionella prövningsnämnder. De allmänna kraven för tillvaratagande av mänskliga vävnadsprover beskrivs nedan. Observera att eftersom MFS kan isoleras från fryst vävnad, biobanker och kommersiella leverantörer är också lönsamt alternativ.
1. Erhåll human vävnads
- Skicka in ett protokoll för att erhålla human kolonvävnad till den institutionella prövningsnämnd för godkännande.
- Upprätta samverkningar med allmänna kirurger och / eller kolorektala kirurger för att erhålla human vävnad för forskning. Samarbetet med patologi Institutionen är också obligatoriskt eftersom de kommer att bestämma vävnad som inte krävs för diagnos och kan utses för forskning.
- Informera patologen att ge vävnad från tumör och sedan grossly normal slemhinna minst 5 cm från tumören. Placera omedelbart proven i iskalla tvätt media och placera på is. Patologen avgör mängden vävnad som säkert kan ges till forskning. Den minimala vävnad som krävs för MF isolering är 1,5 mm 2.
- Använd den erhållna vävnaden antingen omedelbart att fastställa primära kulturer eller frysa och plats vid -80 ° C för framtida isolering.
- Om frysning för senare isolering, skär vävnaden i ca 1-2 mm 2 bitar, lägg i en kryogen rör med 1 ml frys medier (se nedan), och förvara vid -80 ° C. Obs: Med hjälp av detta protokoll, har framgångsrikt isolering av MFS från vävnad fryst i mer än fyra år har observerats.
2. Förbered Reagens
- För kollagenas lösning: Bered 100 E / ml kollagenas I, II och IV i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med Ca2 + / Mg2 + (se Material Tabell
- Förbered Vattenbaserad DNas stamlösning på 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
- Förbered tvätt media: (MEM: 89 ml, Antibiotika Antimykotika, 100x: 1 ml, värmeinaktiverat FCS: 10 ml)
- Förbered Fibroblast tillväxtmedier: MEM: 500 ml flaska; L-glutamin (200 mM): 5 ml; MEM icke-essentiella aminosyror, 100x lösning: 5 ml; ciprofloxacin HCl (10 mg / ml): 570 ^ il; Antibiotika Antimykotika, 100 x lösning: 10 ml; natriumpyruvat (100 mM): 5 ml; värmeinaktiverat FCS: 50 ml
- Förbered Freeze media: Fibroblast tillväxtmedier (reagens 2.4) med tillsats av 10% dimetylsulfoxid (DMSO) och filtrera-sterilize med ett 0,22 pm filter.
3. Enzymatiskt Digest Human Tissue
- Om vävnaden frystes i frysmedia, plats cryovial i varmt (~ 37 ° C) vatten tills vävnad och media tinas.
- För 4-5 av 2 mm 2 bitar av vävnad, tvätta vävnad två gånger med 10 ml HBSS utan Ca 2 + / Mg 2+.
- När vävnad har avgjorts genom gravitation, försiktigt kassera supernatanten utan spinning prov.
- Tillsätt 10 ml av den kollagenaslösning till provet och för över vävnadslösningsblandningen till en steril, DNas / RNas-fritt rör med inbyggda rotorer för prov dissociation. Använd kollagenas att dissociera den extracellulära matrisen som omger den basala aspekten av epitelceller och bildar den icke-cellulära del av mucosal lamina propria.
- Tätt nära röret och fäst den upp och ner på hylsan av dissociator (t.ex. gentleMACS). Om laboratoriet inte har tillgång till than tidigare nämnda utrustning, öka tiden för varje matsmältningen steg för att få jämförbara resultat.
- Kör Program h_tumor_01, en förinställd profil som medföljer maskinen (varar sammanlagt 36 sekunder, med intermittenta pulser som sträcker sig från 1000 - 4000 rpm, med 268 varv per körning).
- Efter avslutad programmet, ta bort röret från dissociator.
- Inkubera prov för 45 min vid 37 ° C under kontinuerlig rotation på skakanordning vid 140 rpm. Anmärkning: För varierande mängder vävnadsprover, kan tiden för matsmältning proportionellt reduceras eller ökas (dvs., större mängder av vävnaden kan kräva ytterligare tid).
- Fäst röret upp och ned på hylsan av dissociator.
- Välj och kör programmet h_tumor_02 (total varaktighet av 37 sekunder, med intermittenta pulser som sträcker sig från 1000 - 4000 rpm, med 235 varv per körning).
- Efter avslutad programmet, ta bort röret från dissociator.
- Tillsätt 50 pl av DNas stamlösning. Använd DNAs att dissociera till / ta bort döda hudceller och DNA fraktion av cellrester som leder till cell klumpar.
- Inkubera prov för 30 min vid 37 ° C under kontinuerlig rotation på skakapparat vid 60 varv per minut.
- Fäst röret upp och ned på hylsan av dissociator igen.
- Välj och kör programmet h_tumor_03 (total varaktighet av 37 sekunder, med intermittenta pulser som sträcker sig från 1000 - 4000 rpm, med 168 varv per körning).
Obs: Om vävnaden inte är fullständigt smält, centrifugera vid 250 x g under 10 min vid 20 ° C, kassera supernatanten, återsuspendera i 2 ml cell dissociationslösning och inkubera vid RT i 10 min. - Passera cellsuspensionen genom steril 70 fim cellfilter.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 250 x g under 10 min vid 20 ° C. Sug ut supernatant helt.
- Tvätta cellpelleten två gånger med 25 ml HBSS utan Ca 2 + / Mg 2+ och kassera supernatanten.
- Före den sista varH, räkna antalet celler med användning av en automatiserad cellräkningssystem tillgängliga i laboratoriet eller manuellt med hemocytometer. För MF primär kultur generation fortgå under steg 3.19.1, för analys eller sortering av MFS med hjälp av flödescytometri fortgå i steg 3.19.2.
- För isolering och tillväxt av ren MF kultur (Figur 1), kassera supernatanten från förra centrifugering, resuspendera cellpelleten i lämplig mängd fibroblast isoleringsmedia som behövs för att utsäde upp till 4 x 10 6 celler i 3 ml media per brunn i 6 brunn, cellkultur-behandlade plattor. Gå vidare till steg 3.20.
- För analys eller sortering av MFS med användning av flödescytometri, placera upp till 2 x 10 6 i 2 ml fibroblast isoleringsmedia i 24 brunn, låg bindningsplattan och inkubera O / N vid 37 ° C med 5% CO2. Detta är att återställa cellytan epitoper som kan påverkas av den enzymatiska förfarandet. Samla cellsuspensionen och räkna återvunna celler och fortsättför immunfärgning och flödescytometri analys 8.
- Odla cellerna vid 37 ° C med 5% CO2. Ändra media varje 2 - 3 dagar tills bildning av ~ 80% konfluenta MF monolager (Figur 1D-E).
- Passage celler i T25-kolvar med från 6 brunnar vid förhållandet 1: 1 och växa under ~ 10 - 14 dagar i fibroblasttillväxt media för att uppnå 80-100% konfluens.
- Expandera kultur genom att passera celler från T25 till T75-celler vid förhållandet 1: 2. När cellerna når sammanflytning, använd en kolv för analys av isolerade MF renhet med hjälp av flödescytometri som beskrivits tidigare 5. Frysa eller passage annan T75 kolv med MF kultur på förhållandet 1: 3.
Obs: Vid analys av flödescytometri, förväntas det att GI slemhinna stromal MF av mesenkymala ursprung när de växer i kultur kommer att ha följande fenotyp: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentin +, α-SMA +, CD90 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av denna enzymatiska nedbrytning protokoll, har vi konsekvent kunnat isolera och odla MF befolknings gut CD90 + slemhinnor stromaceller från GI kirurgiska prover och biopsier (Figur 1). Synlig MF koloni proliferation kunde observeras på dag 2 - fem efter sådd mononukleära cellsuspensioner i 6 brunnars plattor (Figur 1A-B). MF primära kulturer når ~ 50-70% sammanflödet dag 7-11 (Figur 1C-D).
Figur 1. Primära Myofibroblaster (MFS) isolerad från Frozen Gastrointestinal Tissue. En 20X förstoring av humant MFS isolerat från frysta exemplar av mänsklig kolonslemhinnan. (A) Dag 2. Adherenta kluster av stromaceller är närvarande. (B) dagar 4. Den karakteristiska spindle- eller stellate-cellmorfologi har utvecklat och är lätt uppenbara. Densiteten av fibroblaster fortsätter att öka på (C) Dag 7 och (D) Dag 10. (E) Genom Dag 14, det är en helt sammanhängande monoskikt av MFS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det finns en liten minskning av lönsamheten för mucosal enda cell förberedelse på frysning av kirurgiska exemplar (~ 10%, Tabell 1). Men med frysning, finns det också en minskning av bakteriell / svampkontaminering av vävnaden observeras och följaktligen en ökning av effektiviteten av MF kultur generationen.
| Källa GI Mukosala Myofibroblaster | Viabilitet * av Mucosa enkelcellsuspension Framställning (n = 11) </ td> | MF Isolering Effektivitet (n = 11) |
| Färsk | 88,32 ± 2,369 | 8 av 11 (82%) |
| Frusen | 78,64 ± 4,174 | 11 av 11 (100%) |
| * Livskraft som bestämdes genom automatiserad cellräknare efter 0,4% trypan blå lösning färgning. | ||
Tabell 1. livskraft och effektivitet Myofibroblast Recovery. Färska vs frysta vävnader.
Renheten av genererad MF kultur analyserades efter celler förökades åtminstone två passager, i syfte att säkerställa att ingen kontaminering av andra slemhinneceller. Med hjälp av konfokalmikroskopi, visades det att MFS var positiva för markören för mesenkymala cellinjen CD90 och vimentin, och also α-SMA, en markör för de differentierade mesenkymala celler (Figur 2).
Figur 2. isolerade celler Har Fibroblast Form och Express MF Markers. Immunfärgning av isolerade MF monolager, passeåtminstone två gånger i kultur fixerades med 1% paraformaldehyd, immun och analyserades med konfokalmikroskopi som beskrivits tidigare 9. Isolerade celler uttryckte en markör för myofibroblast, a-SMA (i grönt, som detekteras av murin mAb klon 1A4) och mesenkymala markörer: vimentin (i rött, som detekteras av mAb, klon RV202) och CD90 (i blått, som detekteras av murin mAb, klon 5E10). I den sammanslagna bilden, orange / gula celler representerar co-lokalisering av a-SMA och vimentin; lila representerar samlokalisering av vimentin och CD90. Grunder e Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessa data bekräftades genom flödescytometrianalys (Figur 3). Som tidigare rapporterats, normala MFS isolerade från GI slemhinnor var också negativ för hematopoetiska beslutsfattare CD45 och CD31, samt epiteliala markör, EpCAM 3, 5, 9.
Figur 3. Fenotypisk karakterisering av primära Myofibroblast (MF) kulturer. Studier utfördes på primära MFS isolerade från kolonslemhinnan och passerades minst två tid i odling. Immunofärgning, följt av flödescytometrianalys, bekräftade att de isolerade celler har MF fenotyp är enhetligt positiva för vimentin, α-SMA, och CD90. Lämpliga isotypkontroller inkluderades i studien.arge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om detta protokoll har utvecklats för forskningsansökan endast mot bakgrund av ökande avgörande betydelsen av stromaceller som en potentiell cancer prognostic biomarkörer och terapeutiskt mål, förmågan att frysa "funktionella" biospecimens för senare användning erbjuder en betydande fördel. Detta är en unik fördel för att skapa klinisk biorepository, som kan tjäna som ytterligare verktyg som används för att främja utvecklingen av personlig medicin 10, 11. Liknande iakttagelser som tidigare rapporterats för adipos mesenchymala stamceller isolerade från fryst stromal vaskulär fraktion, vi gjorde inte observerats några betydande förändringar i markörer och proliferativa / immun / inflammatoriska svar och metaboliska aktiviteten hos MFS isolerats från frysta slemhinnor prover. 12 Men vi utesluter inte att en del av icke-testade svar såsom extracellulärt markör nedfall, etc kan variera . Således, i de fall att arbeta med okänd / unreporte händelser, kan utredarna inrätta en jämförelseexperiment där särskilda funktion kommer att testas sida vid sida i MFS isolerade från fryst och färsk vävnad av samma individ.
Majoriteten av de tekniker för myofibroblast isoleringsmetoder är baserade antingen på användningen av mekanisk malning av vävnaden kombinerat med behandling antingen med kelateringsmedel [etylendiamintetraättiksyra (EDTA), DL-ditiotreitol (DTT)] eller kollagenolytiska och proteolytiska enzymer 13-14 . Det har tidigare rapporterats att generation av MF från magsäcken, tunntarmen och tjocktarmen var effektiv genom att använda utväxt metoden ursprungligen beskrivits av Mahida et al, som bygger på mekanisk malning och tillämpning av kelatbildare 5, 6. Här en ytterligare enzymatisk metod som tillåter generering av primära kulturer av MFS från frysta vävnadsprover rapporteras. Medan både tekniker-utväxt och enzymatisk digestion-arelika effektiv i isolering av primära myofibroblaster från magsäcken, tunntarmen, och kolonvävnad, finns det fortfarande debatt inom forskarsamhället om huruvida odlade celler bevara sin in vivo fenotyp. Tekniken rapporteras i detta manuskript möjliggör inte bara generering av primär MF kultur, men också tillåter ex vivo analys av olika cellpopulationer som presenteras i GI slemhinna 15-17. Detta inkluderar att bestämma deras relativa överflöd med vävnaden och markörerna de uttrycker, men också för användning i funktionella analyser (t.ex. enzymatisk aktivitet eller cytokin produktion). Relativa förekomsten av MFS i vävnaden kan bedömas med hjälp av FACS genom att sortera celler baserat på markörer är unika för MFS (nämligen EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentin +, α-SMA +, CD90 +) och kvantifiering av deras närvaro jämfört med en summan av alla isolerade nyligen celler eller vid behov, genom att göra jämförande förhållande med en distinkt celltyper. Trots effektivitetenav viabelt cellisolering, är en anmärkningsvärd begränsning av denna och andra protokoll baserade på enzymatisk digerering att den proteolytiska aktiviteten hos enzymet kan förändra cellyte-epitoper. För att övervinna detta, tillåter vi celler att återhämta O / N för att epitoper som skall åter uttryckas på liknande sätt som deras predigested tillstånd.
Vi har kunnat konsekvent generera MF kultur från fryst vävnad med minimal förlust av cellviabilitet. Förmågan att återvinna dessa kulturer från frysta prov gör det möjligt för forskarna att manipulera och bättre bevara kirurgiska och / eller endoskopiska vävnadsprover som erhållits under natten eller av ordinarie arbetstimmar. Dessutom, den minskade förlusten av upphandlade, användbar vävnad på grund av bakterie och / eller svamp föroreningar under frysprocessen fungerar som en extra fördel. Efter isolering bör användning av antibiotika begränsas till endast de första 2 - 3 passager, varefter odling bör fortsätta att använda standard aseptic teknik och antimykotisk / anti-mykoplasmamedel-fria medier. Rutinmässig användning av dessa medel i cellulär kulturen har visat sig utöva cytotoxiska effekter, nämligen celltillväxt, cell degeneration, och vid några tillfällen död 18.
Enzymatisk klyvning kommer att ge multipla cellpopulationer som föreligger i mag lamina propria inklusive: immunceller, epitelceller och MFS. Efter den första passagen kommer endast MFs kvar och kan identifieras genom sin unika fenotyp (figur 1), samt genom cellspecifik panel av marköranalys (CD90, a-SMA och vimentin positiv, men negativt för epitel och hematopoetisk markörer) 3, 5, 9. Även om det är allmänt accepterat att myofibroblaster härrör från mesenkymala stamceller i normal värd i sjukdomstillstånd, såsom kronisk inflammation och cancer, har en subpopulation av MFS visats uttryck epitel- eller hematopoetiska markörer 3. Dessa upptäckter har föreslagits att möjligen varaett resultat av epitel-mesenkymala övergång (EMT) eller rekrytering av fibrocyter härledda från hematopoietisk härstamning 3, 19. Vidare bör ytterligare försiktighet användas om celler immunfärgades och analyserades med flödescytometri för markörerna som diskuterats ovan. Även om vi inte har hittat epitopen förlusten vara en fråga efter att låta cellerna att återhämta O / N från nyligen rötas vävnad inkuberas i icke-vidhäftande plattor, kan förlusten av epitoper uppstår när du använder trypsin eller någon annan proteolytiskt enzym under avskiljandet av celler från plattan. Således, för att undvika detta problem, rekommenderar vi att använda en cell dissociation lösning med kelateringsmedel såsom EDTA när vidhäftande MF kulturer är avsedda för immunfärgning följt av flödescytometrianalys. Efter en primärkultur myofibroblaster är etablerad, kan cellerna sedan frysas i frysmedier och lagrades i flytande kväve. Dessa celler kan användas i en uppsättning av in vitro-experiment fram till ungefär fjorton - 15passager, varefter cellerna senesce och bör kasseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
