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Neuroscience

माउस hippocampal astrocytes में सेक्स अंतर के बाद Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/53695
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,3
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Summary

Astrocytes केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे महत्वपूर्ण प्रमुख खिलाड़ियों में से एक हैं। यहाँ, हम तंत्र के बाद इन विट्रो ischemia पुरुष और महिला नवजात शिशु पिल्ले में astrocyte समारोह अंतर्निहित का अध्ययन करने के क्रम में sexed हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृति प्रोटोकॉल का एक व्यावहारिक विधि रिपोर्टिंग कर रहे हैं।

Abstract

हाइपोक्सिया / ischemia (एचआई) से संबंधित मस्तिष्क की चोट के बाद Astrogliosis वृद्धि की रुग्णता और नवजात शिशुओं में मृत्यु दर में एक भूमिका निभाता है। हाल ही में नैदानिक अध्ययन से संकेत मिलता है कि मस्तिष्क की चोट की गंभीरता सेक्स निर्भर होना दिखाई देते हैं, और पुरुष नवजात शिशुओं और अधिक गंभीर स्नायविक परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप तुलनीय मस्तिष्क की चोटों के साथ महिलाओं की तुलना में एचआई से संबंधित मस्तिष्क की चोट के प्रभाव के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि,। विश्वसनीय तरीकों के विकास के लिए अलग और sexed हिप्पोकैम्पस astrocytes की अत्यधिक समृद्ध आबादी बनाए रखने के लिए नवजात HI के रोग परिणामों में लिंग भेद के सेलुलर आधार को समझने के लिए आवश्यक है। इस अध्ययन में, हम सेक्स विशिष्ट हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृतियों है कि इन विट्रो ischemia, ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव के एक मॉडल, reoxygenation के द्वारा पीछा के अधीन हैं बनाने के लिए एक विधि का वर्णन है। इसके बाद प्रतिक्रियाशील astrogliosis immunostai द्वारा जांच की गई थीGlial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और S100B के लिए निंग। इस विधि, नवजात HI निम्नलिखित पुरुष और महिला हिप्पोकैम्पस astrocytes की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अलग से एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

Astrocytes केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे महत्वपूर्ण प्रमुख खिलाड़ियों में से एक हैं। सबूत की बढ़ती शरीर इंगित करता है कि astrocytes की भूमिकाओं न्यूरोनल सहायता प्रदान करने की तुलना में अधिक हैं। वास्तव में, शारीरिक शर्तों के तहत astrocytes की भूमिका जैसे विकासशील एक्सोन 1 के प्रवास के मार्गदर्शक, सीएनएस रक्त के प्रवाह को विनियमित 2, synaptic मध्य द्रव 3 का पीएच homeostasis को बनाए रखने, और रक्त मस्तिष्क बाधा में भाग लेने के रूप में, बहुत जटिल हो सकता है 4 और 5 synaptic प्रसारण। रोग की स्थिति के तहत, astrocytes एक प्रक्रिया प्रतिक्रियाशील astrogliosis जिसमें आकृति विज्ञान, संख्या, स्थान, स्थलाकृति astrocytes की और समारोह (अपमान से दूरी के संबंध में) एक विषम रास्ता 6.7 में बदल सकता है कहा जाता है के साथ चोट का जवाब। देखा Astrogliosis नवजात hypoxic इस्कीमिक मस्तिष्क विकृति शायद रुग्णता और नवजात शिशुओं की मृत्यु दर में योगदान करने के बाद

हाल ही में नैदानिक ​​और प्रायोगिक अध्ययन से संकेत मिलता है मस्तिष्क की चोट की गंभीरता सेक्स पर निर्भर होना प्रतीत होता है कि पुरुष और नवजात शिशुओं, और अधिक गंभीर स्नायविक परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप की तुलना में हाइपोक्सिया / ischemia (एचआई) से संबंधित मस्तिष्क की चोट के प्रभाव के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि तुलनीय मस्तिष्क की चोटों 9-11 साथ महिलाओं। हालांकि चोट के स्थानीयकरण गर्भावधि उम्र और अवधि और अपमान की गंभीरता पर निर्भर करता है, हिप्पोकैम्पस सबसे अधिक प्रभावित अवधि नवजात HI बाद सीएनएस में क्षेत्रों में से एक है, और वृद्धि हिप्पोकैम्पस astrogliosis अप-विनियमन के द्वारा पुष्टि की गई है Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) 3 डी नवजात HI 7,10,12,13 के बाद। Astrocyte समारोह में सेक्स मतभेद मस्तिष्क ischemia 14,15 के बाद दोनों नवजात शिशुओं और वयस्क कृन्तकों में दिखाया गया। इसके अलावा, इन विट्रो ischemia के लिए पुरुष astrocytic संवेदनशीलता में वृद्धि हुई सेल द्वारा दिखाया गया थाएल मौत संस्कृति 16 में महिला cortical astrocytes की तुलना में।

सेक्स मतभेदों में गर्भाशय शुरू करते हैं और मृत्यु 17 तक जारी है। पिछले दशक के दौरान, सेल संस्कृति में है और इन विवो अध्ययनों प्रयोगात्मक शर्तों में लिंगों सहित के महत्व को चिकित्सा और एनआईएच के संस्थान के जोर सेक्स शारीरिक और रोग की स्थिति 17,18 में देखा मतभेद में मौलिक ज्ञान की तलाश करने के लिए किया गया है । विश्वसनीय तरीकों का विकास अलग और sexed हिप्पोकैम्पस astrocytes की आबादी बनाए रखने के लिए नवजात HI के रोग परिणामों में लिंग भेद के सेलुलर आधार को समझने के लिए आवश्यक है। वर्तमान अध्ययन के आदेश के बाद ऑक्सीजन / ग्लूकोज अभाव (OGD) और reoxygenation (REOX), उत्प्रेरण GFAP-immunoreactive astrocytes की भूमिका का आकलन करने में नवजात चूहों से समृद्ध सेक्स-विशिष्ट हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृतियों तैयार करने के लिए तकनीक प्रदान करने के लिए डिजाइन किया गया थासेल संस्कृति वातावरण में HI। इस तकनीक normoxic और इस्कीमिक की शर्तों के तहत नवजात पुरुषों और महिलाओं में हिप्पोकैम्पस astrocytes से संबंधित किसी भी परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: इस अध्ययन की देखभाल के लिए गाइड की सिफारिश और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान की प्रयोगशाला पशु के उपयोग के अनुसार में आयोजित किया गया। पशु प्रोटोकॉल विस्कॉन्सिन-मैडिसन, संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। कि यहां प्रस्तुत किया है प्राथमिक astrocyte संस्कृति प्रोटोकॉल कुछ संशोधनों के साथ झांग Y 19 एट अल। और Cengiz पी 20 एट अल द्वारा प्रस्तुत प्रोटोकॉल से अपनाया है।।

1. हिप्पोकैम्पस विच्छेदन और astrocyte संस्कृति

  1. सभी आवश्यक अभिकर्मकों और शल्य कैंची, चिकनी ठीक संदंश, फ्लैट टिप संदंश, कागज तौलिये, कचरे की थैली, 70% इथेनॉल और 2 विदारक व्यंजन (3.5 सेमी व्यास) बर्फ पर 2 एमएल हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) प्रत्येक के साथ भरा सहित सामग्री तैयार । सुनिश्चित करें कि शल्य चिकित्सा उपकरणों के हैं बाँझ (आटोक्लेव) प्रक्रिया से पहले और अन्य सभी सामग्री (astrocyte चढ़ाना माध्यम का उपयोग: DMEM + 5% घोड़े सीरम +1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, घोड़े सीरम, HBSS, 0.25% trypsin, कांच coverslips, पेट्री डिश, 15/50 एमएल ट्यूबों, T25 बोतल, आदि) के रूप में पूर्व बाँझ।
  2. धीरे पकड़ और स्प्रे सिर और माउस पिल्ला की गर्दन 70% इथेनॉल के साथ और तेज बाँझ कैंची का उपयोग सिर काटना [चित्रा 1 (1)]।
  3. खोपड़ी मस्तिष्क [चित्रा 1 (2-3)] को बेनकाब करने के साथ-साथ छोटे कैंची के साथ खोपड़ी पूर्वकाल के लिए पीछे से एक midline चीरा प्रदर्शन करना।
  4. छोटी कैंची से नाक को गर्दन से ध्यान से कपाल कट। फिर खोपड़ी आधार से कपाल डिस्कनेक्ट करने के लिए सेरिबैलम के लिए घ्राण बल्ब को कपाल पूर्वकाल और अवर काटा।
  5. खोपड़ी के आधार पर एक छोटा सा चीरा और midline के साथ काटा। खोपड़ी दूर छील करने के लिए बाँझ फ्लैट टिप संदंश का प्रयोग करें। एक घुमावदार संदंश की मदद से मस्तिष्क स्टेम निकालें। कपाल से मस्तिष्क निकालें और पहले विदारक डिश में रखें [चित्रा 1 (4-9)] 21।
  6. एक घुमावदार संदंश का प्रयोग, मस्तिष्क फ्लिप इतना है कि मस्तिष्क के उदर सतह का सामना करना पड़ रहा है और फिर एक तेज बाँझ सर्जिकल ब्लेड [चित्रा 1 (10,11)] के साथ दोनों गोलार्द्धों अलग
  7. पील वापस मस्तिष्क गोलार्द्धों और ध्यान से हिप्पोकैम्पस, औसत दर्जे का टेम्पोरल लोब [चित्रा 1 (12-14)] में एक छोटी सी, समुद्री घोड़े के आकार का संरचना प्रकट करने के लिए एक बाँझ फ्लैट घुमावदार संदंश के साथ उभड़ा मध्यमस्तिष्क और thalamic ऊतक को हटा दें।
  8. हटाये दोनों पालियों हिप्पोकैम्पस [चित्रा 1 (15,16)] और ध्यान से ठीक संदंश के साथ खींच कर पालियों से तानिका काटना। यह कदम तानिका कोशिकाओं और fibroblasts द्वारा अंतिम astrocyte संस्कृति के प्रदूषण से बचा जाता है।
  9. दूसरी HBSS के साथ भरा डिश में तैयार हिप्पोकैम्पस पालियों स्थानांतरण और इसे पर बर्फ [चित्रा 1 (17,18)] वापस। हिप्पो की तैयारी के लिए - एक माउस से पूल दोनों पालियों हिप्पोकैम्पस (p2 P0)campal astrocyte संस्कृतियों। इस astrocyte उचित घनत्व देता है। एक तेज बाँझ सर्जिकल ब्लेड (लगभग 4 बार) का उपयोग कर हिप्पोकैम्पस पालियों कीमा।
  10. डिश से महाप्राण HBSS एक बाँझ 1 एमएल पिपेट से जुड़ी टिप का उपयोग और 0.25% trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण, एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण और कोमल झटकों के साथ 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक सेते हैं।
  11. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला ध्यान से एक बाँझ कांच पिपेट एक शून्य रेखा से जुड़ी इस्तेमाल करते हैं। (- 30 गुना 20) एक आग पॉलिश कांच पिपेट का उपयोग कर जब तक ऊतक टुकड़े homogenize 10 एमएल astrocyte चढ़ाना मध्यम और Triturate जोड़ें।
  12. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और ताजा prewarmed astrocyte चढ़ाना मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें। एक नया 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक 70 माइक्रोन जाल फिल्टर (सेल झरनी) के माध्यम से कोशिकाओं गुजरती हैं।
  13. एक पाली-D-लाइसिन / laminin लेपित बाँझ T25 संस्कृति के 3 एमएल युक्त कुप्पी पर प्लेट पूरे सेल निलंबनastrocyte चढ़ाना मीडिया, तो एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं।
  14. दिन में महाप्राण पूरी मीडिया मैं n-विट्रो (DIV) 1, 3 और DIV DIV 7, और ताजा astrocyte चढ़ाना मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें। प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हर बार प्रगति और astrocytic संगम का निरीक्षण करते हुए astrocyte चढ़ाना मीडिया की जगह ले।
    नोट: div 1 में, सभी व्यवहार्य astrocytes संस्कृति कुप्पी की सतह और मृत या मर कोशिकाओं शामिल है कि न्यूरॉन्स सतह पर तैरनेवाला में तैर रहे हैं से जुड़े होते हैं। DIV 3 में संलग्न कोशिकाओं astrocytic सेल परत के रूप में विभाजित करने के लिए शुरू करते हैं। सहायक शर्तों के अभाव में, संस्कृति में किसी भी न्यूरोनल विकास के लगभग रहित है। 90% मिला हुआ है और कुछ microglia के साथ ही oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं रहे हैं astrocytic परत के शीर्ष पर वर्तमान - DIV 7, astrocyte परत के बारे में 80 है।
  15. , कुप्पी से चढ़ाना मध्यम Aspirate ताजा prewarmed astrocyte चढ़ाना मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ने, कुल्ला एकएन डी DIV 11 बजे फिर से हटा दें, जब astrocytes मिला हुआ है और संवर्धन के उप के लिए तैयार हैं।
  16. 0.25% trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ने, धीरे कुप्पी एक बार कुछ बारी बारी से और महाप्राण trypsin एक बाँझ कांच pipet का उपयोग।
  17. 0.25% trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें और कुप्पी 4 के लिए टिशू कल्चर हुड में बैठते हैं - आरटी पर 5 मिनट।
  18. Trypsin निकालें और 10 मिनट के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी रहते हैं। 5 एमएल prewarmed चढ़ाना मध्यम astrocyte जोड़ें और अपने हाथ की हथेली के खिलाफ कुप्पी दोहन से astrocytic परत को अलग - पूरा टुकड़ी को प्राप्त करने और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में astrocytes इकट्ठा करने के लिए (3 से 4 बार) कोमल विचूर्णन द्वारा पीछा किया।
  19. अपकेंद्रित्र ट्यूब 5 मिनट के लिए 300 XG पर तैरनेवाला aspirate, और 1 एमएल ताजा astrocyte चढ़ाना माध्यम जोड़ें।
  20. सेल निलंबन के 10 μL एक hemocytometer में जोड़ें और एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप (10X उद्देश्य) का उपयोग बड़े केंद्रीय gridded क्षेत्र (1 मिमी 2) में कोशिकाओं की गिनती। एमयूएलtiply 10 4 से एमएल प्रति कोशिकाओं की संख्या का अनुमान है। एक T25 कुप्पी ~ 1 एक्स 10 6 कुल अलग कोशिकाओं निकलेगा। बीज ~ 1 एक्स 10 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश के कुएं में एक 12 मिमी व्यास पाली-D-लाइसिन precoated कांच coverslip पर 2 एमएल astrocyte मध्यम चढ़ाना में 5 कोशिकाओं।
  21. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 14 (धारा 2) - DIV 12 पर OGD / REOX प्रदर्शन करना।
  22. DIV 11 तक के साथ 5 मिमी एल leucine मिथाइल एस्टर (एलएमई) हाइड्रोक्लोराइड DIV 3 पर astrocyte संस्कृतियों का इलाज है microglia से रहित हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों वांछित हैं। एलएमई ऊष्मायन के बाद, मिलाते (1 घंटे के लिए 300 आरपीएम) के अधीन संस्कृतियों microglia contaminating हटा दें।
    नोट: एलएमई एक microglial साइटोटोक्सिक एजेंट है कि microglia 22 proliferating को खत्म करने की एक विधि के रूप में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है।

2. OGD / REOX उपचार

  1. coverslip से महाप्राण मीडिया पक्षपाती astrocyte संस्कृति युक्त (DIV 12 - 14) और कुल्ला 3 गुनाधीरे 24 अच्छी तरह से संस्कृति coverslip पकड़े 1 एमएल isotonic OGD समाधान (7.4 पीएच) (मिमी में) युक्त के साथ एक दो बार पकवान घूर्णन द्वारा: 0 ग्लूकोज, 21 NaHCO 3, 120 सोडियम क्लोराइड, 5.36 KCl, 0.33 ना 2 HPO 4, 0.44 के.एच. 2 4 पीओ, 1.27 CaCl 2, और 0.81 MgSO 4।
  2. 0.2 एमएल OGD अच्छी तरह से करने के लिए समाधान coverslip को कवर करने के लिए और युक्त 94% एन 2, 1% 2 हे एक hypoxic इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए सेते हैं, और 5% सीओ 2 जोड़े। धीरे हाइपोक्सिया के पहले 30 मिनट गैस विनिमय की सुविधा के लिए के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) के साथ मिश्रण।
  3. एक बफर 5.5 मिमी ग्लूकोज के अलावा के अलावा OGD समाधान करने के लिए समान में 5% सीओ 2 और वायुमंडलीय हवा में 2 घंटे के लिए normoxic नियंत्रण कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. REOX, महाप्राण OGD समाधान के लिए और चढ़ाना मध्यम astrocyte के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 और वायुमंडलीय हवा में सेते हैं।

3. immunocytochemical धुंधला </ P>

  1. एक बाँझ कांच पिपेट एक शून्य रेखा से जुड़ी का उपयोग करते हुए संस्कृति मीडिया Aspirate और जल्दी से 0.1 एम Tris बफर खारा (टीबीएस) के 1ml जोड़कर coverslip एक बार कुल्ला (154 मिमी NaCl, 16 मिमी Trizma बेस, 84 मिमी Tris एचसीएल, 7.4 पीएच) अच्छी तरह से करने के लिए। महाप्राण और 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 2 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. महाप्राण और 0.1 एम टीबीएस के 1 एमएल जोड़ने, तो 2 मिनट के लिए एक कमाल प्रकार के बरतन पर जगह है। 3 बार दोहराएँ। समाधान (10% बकरी सीरम, 0.1 एम टीबीएस में 10 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 0.025% ट्राइटन X-100) अवरुद्ध 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक कमाल प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. महाप्राण समाधान को रोकने और प्राथमिक माउस मोनोक्लोनल विरोधी GFAP एंटीबॉडी जोड़ने के 60 मिनट के लिए (एक 1 से 0.2 एमएल: समाधान को रोकने में 500 कमजोर पड़ने) और खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी S100B (1: 500) या खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी HIF1α (200 1) एक कमाल प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. और माउस सोम: वैकल्पिक रूप से, कुछ astrocytes खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी IBA1 (200 1) के साथ incubated हैंoclonal विरोधी MAP2 संस्कृति पवित्रता का उपयोग करने के लिए।
  5. महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी और 0.1 एम टीबीएस के 1 एमएल जोड़ने और 2 मिनट के लिए और फिर महाप्राण के लिए एक कमाल प्रकार के बरतन पर रखकर coverslip कुल्ला। दो बार दोहराएँ।
  6. एक कमाल प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए समाधान को रोकने में माध्यमिक बकरी विरोधी खरगोश 488 संयुग्मित और विरोधी माउस 568 संयुग्मित एंटीबॉडी के 200 कमजोर पड़ने: एक 1 से 0.2 एमएल जोड़ें।
  7. महाप्राण माध्यमिक एंटीबॉडी और 2 मिनट के लिए और फिर महाप्राण के लिए एक कमाल प्रकार के बरतन पर 0.1 एम टीबीएस के 1 एमएल जोड़ने और जगह से coverslip कुल्ला। दो बार दोहराएँ।
  8. अच्छी तरह से और सूखे से coverslip हटाये एक स्लाइड एक स्लाइड सुखाने की मशीन पर तैनात पर रखकर। Vectashield की एक बूंद पर inverting द्वारा एक नई स्लाइड पर माउंट coverslip DAPI (1.5 एनजी / μL) के साथ बढ़ते मध्यम hardset।
  9. एक confocal खुर्दबीन या तो 20X सूखा या 60X तेल उद्देश्य के प्रयोग पर छवि coverslips। DAPI (405 एनएम पूर्व / 450 एनएम ईएम) और fluorochrome 488 के लिए छवियों (512 x 512) मोल टैग की GFAP एंटीबॉडी (488 एनएम पूर्व / 515 एनएमईएम)। 20X 60X और समूहों के भीतर लगातार अधिग्रहण पैरामीटर रखें।

4. लिंग निर्धारण पीसीआर का उपयोग

  1. हीट पिल्ला पैर के अंगूठे या 50 मिमी NaOH में 45 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उंगली की कतरनों और 1 एम Tris, पीएच 6.8 से बराबर मात्रा के साथ बेअसर।
  2. Myog और Sry जीनों के लिए प्राइमरों के 5 pmoles, 1x प्रतिक्रिया बफर, 0.2 मिमी प्रत्येक deoxynucleotide और 8 यू Taq पोलीमरेज़: निम्नलिखित मिश्रण के 19 μL के लिए निकाले गए डीएनए समाधान के 1 μL जोड़ें।
  3. प्राइमरों दृश्यों का उपयोग करें; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' और Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23।
  4. 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट के लिए फिर 30 विकृतीकरण के चक्र 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस, annealing के लिए 58 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए, और बढ़ाव: निम्नलिखित पीसीआर प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना। इस 30 चक्रों के बाद, प्रतिक्रिया 1 मिनट के लिए एक अंतिम 72 डिग्री सेल्सियस बढ़ाव के साथ समाप्त होती है।
  5. अलग पीसीआर उत्पादों एक ethidium ब्रोमाइड युक्त 2% agarose जेल पर electrophoretically और यूवी रोशनी के तहत कल्पना। (2A चित्रा।) चेतावनी! Ethidium ब्रोमाइड एक संभावित कैसरजन है और ध्यान से संभाला और संस्था के नियमों के अनुसार ठीक से निपटाया जाना चाहिए।

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Representative Results

शारीरिक या pathophysiological शर्तों के तहत sexed astrocyte कार्यों की भूमिका को समझना बेहद इन विट्रो की शर्तों के तहत इन कोशिकाओं संवर्धन द्वारा elucidated किया गया है। sexed संवर्धन के प्रदर्शन के महत्वपूर्ण पहलू माउस पिल्ला के लिंग का निर्धारण करने के लिए इसके उपयोग से पहले है। हम आनुवंशिक रूप से पीसीआर द्वारा और दृश्य मूल्यांकन (चित्रा 2) 16 से माउस की सेक्स चुना गया। पीसीआर का उपयोग लिंग निर्धारण की पद्धति McClive और सिंक्लेयर से संशोधनों के साथ अपनाया गया था, त्वरित, सरल, और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है विधि 23। चित्रा 2A पीसीआर का उपयोग लिंग निर्धारण के प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है। पीसीआर उत्पादों दो प्रतिनिधि P1 पुरुष और महिला पूंछ snips से निकाले गए डीएनए के साथ उत्पन्न किया गया। प्रतिक्रिया Sry और Myog जीनों के लिए मल्टिप्लेक्स प्राइमर जोड़े कि 441 बीपी और महिला के पुरुष विशिष्ट विशिष्ट बैंड उत्पन्न शामिल245 बीपी, क्रमशः के आईसी बैंड। नवजात (पी 1 - 3) के दृश्य दृढ़ संकल्प नग्न आंखों के साथ माउस सेक्स केवल पुरुषों (चित्रा 2 बी) 16,24 में anogenital के उद्घाटन के बीच छोटे काली स्थान की उपस्थिति के लिए देख द्वारा स्थापित किया गया था।

हालांकि, astrocytes के संवर्धन के लिए सुविधाजनक और प्रयोगशाला की स्थापना के तहत स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, यह लाभ मुख्य रूप से microglia या एक हद तक कम करने के लिए न्यूरॉन्स के साथ अपने संदूषण द्वारा बाधा जा सकता है। astrocytes के प्रदूषण को आसानी से या तो microglia (IBA1) या न्यूरॉन्स (MAP2) के लिए सेल विशिष्ट मार्कर के साथ संवर्धित कोशिकाओं के immunolabeling द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, हिप्पोकैम्पस प्राथमिक monolayer संस्कृतियों में बढ़ astrocytes के रूप में कुछ कोशिकाओं है कि IBA1 (चित्रा 3) व्यक्त ने सुझाव दिया है, DIV 14 में दूषित microglia की ~ 6% है मनाया गया। इसके विपरीत, कोशिकाओं में से कोई भी सुझाव MAP2 व्यक्त करने के लिए पाए गएसंस्कृति किसी भी न्यूरोनल संदूषण (चित्रा 3) का पूरी तरह से रहित था। 3 दिन पुरानी माउस पिल्ले 25 - नाबालिग microglial हमारी संस्कृति में मनाया संदूषण अन्य रिपोर्टों के अनुसार, जिसमें लेखकों 1 से निकाली गई उनकी प्राथमिक cortical astrocyte संस्कृतियों में 5% की microglial संदूषण की सूचना दी है। Astrocytes एक विशिष्ट cytoarchitecture कि उन्हें हाइपोक्सिया सहित उनके microenvironment में परिवर्तन करने के लिए प्रतिक्रिया करने की अनुमति होती है। आदेश में इन विट्रो ischemia के लिए किसी भी सेक्स विशिष्ट astrocytic प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए हम OGD / REOX को sexed हिप्पोकैम्पस astrocytes अधीन है। Normoxic शर्तों के तहत कोशिकाओं में HIF1α भाव (चित्रा 4 की तुलना में OGD / REOX के सफल प्रेरण हाइपोक्सिया inducible कारक 1 अल्फा की वृद्धि की परमाणु अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित किया गया था (HIF1α 2 घंटे OGD 5 h REOX के द्वारा पीछा करने के लिए अधीन GFAP + astrocytes में मनाया )।

(चित्रा 5) "1"> GFAP या S100B (astrocyte मार्कर परिपक्व) के साथ sexed हिप्पोकैम्पस सुसंस्कृत astrocytes के Immunocytochemical धुंधला हो जाना एक अत्यधिक चयनात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धुंधला पैटर्न में हुई। GFAP और S100B astrocytes की कोशिका द्रव्य और सेल शरीर में colocalized रहे थे, एक परिपक्व astrocytic विकास मंच निस्र्पक जहां इन कोशिकाओं को उनके तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) संभावित 26 खो देते हैं। के रूप में उनके संबंधित normoxic और OGD / REOX उपचार समूहों में मनाया आकृति विज्ञान और GFAP या S100B immunoreactivities का घनत्व दोनों पुरुष और महिला astrocyte संस्कृतियों में समान थे। के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन; normoxic शर्तों के तहत, हिप्पोकैम्पस astrocytes तकली जैसा करने के लिए एक बहुभुज और फ्लैट आकृति विज्ञान [चित्रा 5 ए, बी (तीर 60X normoxia)] प्रस्तुत किया। इन कोशिकाओं को OGD / REOX की प्रेरण से पहले लगभग 2 सप्ताह के लिए मिला हुआ है जब तक विभाजित करने में सक्षम थे। बाद 2 घंटे OGD और 5 h REOX, astrocytes शास्त्रीय reacti का प्रदर्शनastrocyte आकृति विज्ञान मुकर प्राथमिक प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करने, सोमा और प्रक्रियाओं की अतिवृद्धि, और GFAP की वृद्धि की अभिव्यक्ति या S100B ve [चित्रा 5 ए, बी (OGD / REOX, 60X, नोक)]। OGD / REOX के बाद, GFAP / S100B धुंधला हो जाना भी एक व्यापक meshwork दोनों पुरुष और महिला हिप्पोकैम्पस astrocytes में कोशिका द्रव्य भर में विस्तार देने का प्रदर्शन किया। GFAP धुंधला की कमी GFAP अशक्त चूहों से सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस astrocytes में मनाया एक नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 5 ब, इनसेट) के रूप में कार्य किया। ऊपर परिणाम प्रत्यक्ष प्रमाण है कि GFAP / S100B-immunoreactive astrocytes की आकृति विज्ञान महत्वपूर्ण परिवर्तन आए जब OGD-REOX के अधीन हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. P1 चूहे से hippocampal निकालना तकनीक का रेखांकन। 1। पिल्ला सिर काटना सिर हटा दें।2, 3. ठीक कैंची का प्रयोग, त्वचा की एक midline चीरा बनाने, पीछे पूर्वकाल के लिए, और एक फ्लैट टिप संदंश की मदद से त्वचा वापस छील। 4, 5, 6। के आधार पर एक छोटा सा चीरा खोपड़ी। Midline के साथ खोपड़ी कट और दूर मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए दो हिस्सों छील। 7, 8। एक घुमावदार संदंश की मदद से सेरिबैलम निकालें। 9। ध्यान से एक बाँझ पेट्री डिश में कपाल और जगह से मस्तिष्क को हटा दें। 10, 11। मस्तिष्क फ्लिप इतना है कि मस्तिष्क के उदर सतह एक घुमावदार संदंश का उपयोग सामना करना पड़ रहा है, तो एक तेज बाँझ सर्जिकल ब्लेड। 12 के साथ दोनों गोलार्द्धों अलग, 13, 14। हिप्पोकैम्पस (छोटे सी के आकार का संरचना) उभड़ा मध्यमस्तिष्क और thalamic ऊतक बरकरार जा गोलार्द्ध अंतर्निहित और हिप्पोकैम्पस खुलासा निकालें। 15, 16। निकालें। 17, 18. तुरंत दोनों से प्राप्त हिप्पोकैम्पस पालियों जगह एक में गोलार्द्धों बाँझ HBSS युक्त अलग पेट्री डिश। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा नवजात चूहों के 2. लिंग निर्धारण। ए। (; एम एफ 1 1) माउस सेक्स आनुवंशिक रूप से Myog (एक्स गुणसूत्र) और Sry (वाई गुणसूत्र) जीन उंगली या पैर के अंगूठे की कतरनों से निकाले गए डीएनए का उपयोग करने के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था। पीसीआर के बैंड यूवी रोशनी के तहत ethidium ब्रोमाइड के साथ एक 2% agarose जेल पर कल्पना थे। एफ 2 और एम 2 क्रमश: महिला और पुरुष के रूप में सकारात्मक नियंत्रण सेवा की। बी। महिला से पुरुष के दृश्य दृढ़ संकल्प anogenital उद्घाटन (तीर) के बीच एक अंधेरे स्थान की पहचान के द्वारा स्थापित किया गया था।urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा neuronal मार्कर MAP2 (लाल) और microglia मार्कर IBA1 (हरा) के साथ प्राथमिक माउस hippocampal astrocyte संस्कृति। Astrocyte संस्कृति के immunostaining की 3. पवित्रता। नाभिक 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (नीला) के साथ दाग रहे हैं। तीर microglia संदूषण इंगित करता है। स्केल पट्टी:। 50 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. HIF1α अभिव्यक्ति में थासंवर्धित hippocampal Astrocytes OGD / REOX को उजागर में वृद्धि। immunofluorescent प्रतिनिधि GFAP (लाल) और HIF1α (हरा) (ए) normoxia या (बी) OGD (2 घंटे) / REOX (5 ज) अधीन astrocytes में लेबलिंग दिखा छवियों। नाभिक 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (नीला) के साथ दाग रहे हैं। तीर, कम HIF1α अभिव्यक्ति; नोक, HIF1α परमाणु अभिव्यक्ति उठाया। स्केल पट्टी:। 25 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. अप-विनियमन OGD-REOX निम्नलिखित Sexed हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृतियों में S100B की या GFAP अभिव्यक्ति। Sexed सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस astrocytes normoxic शर्तों के अधीन या 2 के बाद S110b या GFAP अभिव्यक्ति के लिए दाग थेज OGD REOX के 5 ज (OGD / REOX) द्वारा पीछा किया। इनसेट: हिप्पोकैम्पस astrocytes से 60X की छवि GFAP अशक्त चूहों से सुसंस्कृत। स्केल पट्टी: 30 माइक्रोन।

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Discussion

सेक्स शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत astrocytes के गुणों में मतभेद और समारोह का अध्ययन करने के लिए, सेल संस्कृति में sexed प्राथमिक astrocytes की तैयारी का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। वर्तमान अध्ययन में हम एक अत्यंत कुशल और संस्कृति के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि में इन विट्रो नवजात शिशु से sexed हिप्पोकैम्पस astrocytes की एक अत्यधिक समृद्ध सजातीय आबादी (P0-P2) C57BL / 6 (जंगली प्रकार) या K19F (GFAP नल) माउस पिल्ले की रिपोर्ट। इस पद्धति की स्थापना में मदद करता है जांचकर्ताओं इन विट्रो ischemia के बाद sexed हिप्पोकैम्पस astrocytes की शारीरिक और रोग कार्यों को समझते हैं।

वहाँ trypsinization दौरान बाँझपन और हिप्पोकैम्पस पालियों की पर्याप्त पाचन के रखरखाव के क्रम में एकल कक्ष निलंबन को प्राप्त करने में पचा ऊतक के विचूर्णन के द्वारा पीछा सहित इस पद्धति स्थापित करने में दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। से प्राथमिक astrocytes की रोकथामदूषित हो रही संस्कृति प्रक्रिया में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक है। बैक्टीरियल और / या फंगल संक्रमण के दो आम मोड कि संवर्धित कोशिकाओं बेकार है, जबकि तकनीक के प्रदर्शन प्रदान कर सकते हैं अगर उचित देखभाल नहीं अपनाया है। इसलिए, क्रम में प्रयोगात्मक सफलता सुनिश्चित करने के लिए, यह जरूरी एक बाँझ काम की स्थापना भी शामिल है कि के तहत प्रक्रिया को पूरा करने के लिए, काम के स्थान का उपयोग करने से पहले, बाँझ सर्जिकल उपकरण और सामग्री का उपयोग disinfecting, nonsterile सतहों के साथ बाँझ सामग्री के संपर्क से बचने के लिए, एक का उपयोग कर रहा है लामिना का प्रवाह हुड और लामिना हुड से बाहर नवोदित संस्कृति बोतल लेने से बचें। इसके अलावा, एंजाइमी हदबंदी के दौरान व्यापक भौतिक विचूर्णन के द्वारा पीछा trypsin के साथ हिप्पोकैम्पस के ऊतकों की अब ऊष्मायन उसके ऊपर पाचन गरीब सेल व्यवहार्यता और संस्कृति बोतल के लिए अलग कोशिकाओं का अकुशल लगाव है, जिसके परिणामस्वरूप पैदा कर सकते हैं।

इसके विपरीत, मस्तिष्क के ऊतकों की underdigestion अपर्याप्त प्रदान करता हैglia कोशिकाओं जिससे गरीब उपज और बड़े गुच्छों के रूप में कोशिकाओं के बोने में जिसके परिणामस्वरूप की हदबंदी। इसलिए, ताकि स्वस्थ astrocyte संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए, यह आवश्यक है हिप्पोकैम्पस ऊतक का इष्टतम पाचन प्राप्त करने के लिए trypsin एकाग्रता, ऊष्मायन समय और विचूर्णन अनुकूलन करने के लिए है। हमारे हाथ में, आरटी पर 20 मिनट 20 के लिए कोमल विचूर्णन के द्वारा पीछा के लिए 0.25% trypsin के काम एकाग्रता के साथ हिप्पोकैम्पस पालियों की ऊष्मायन - 30 गुना मजबूत पक्षपाती, स्वस्थ और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य astrocyte संस्कृतियों झुकेंगे। इसके अलावा, ठंड और हर समय का उपयोग करने के लिए उनके प्रभाव को कम कर सकते हैं प्रायर अभिकर्मकों के विगलन दोहराया। इसलिए, यह छोटे वांछनीय मात्रा और फ्रीज में विभाज्य अभिकर्मकों के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, दुकान trypsin, पेनिसिलिन / 5 एमएल aliquots और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक कई बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में 50 एमएल aliquots के रूप में भ्रूण गोजातीय सीरम के रूप में स्ट्रेप्टोमाइसिन। हम समाप्ति की तारीख से परे एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग नहीं करने की सलाह है।

GFAP ओ हैपक्ष-विशेषता प्रतिक्रियाशील रेशेदार astrocytes की मार्कर। बाद OGD / REOX, प्रतिक्रियाशील astrogliosis के जवाब में GFAP अभिव्यक्ति की upregulation 20 सूचित किया गया है। हालांकि, यह प्रस्ताव किया गया है कि GFAP overexpression विशिष्ट लक्ष्य के रूप में न्यूरोनल मरम्मत रणनीतियों के लिए 27 हिप्पोकैम्पस नुकसान में अपनी भूमिका HI बाद नवजात शिशुओं में इस्तेमाल किया जा सकता है अभी भी स्पष्ट नहीं है। GFAP साथ astrocytes की immunohistochemical धुंधला शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत इन कोशिकाओं की पहचान करने और चिह्नित करने के लिए सक्षम बनाता है। किसी भी अन्य की तरह मार्कर GFAP धुंधला कुछ सीमाएं मान्यता प्राप्त होने की जरूरत है। astrocytes की GFAP धुंधला की सीमाओं में से एक नहीं है कि सभी astrocytes शारीरिक शर्तों के तहत GFAP व्यक्त करते हैं। विशेष रूप से GFAP के अपरिपक्व astrocyte अभिव्यक्ति दर शारीरिक शर्तों 28 के तहत 40% से अधिक नहीं है। astrocytes की उम्र और प्रकार विशिष्ट उपयोग पर निर्भर करता है, अपनी पसंद की अन्य मार्करों ऐसे GLAST, ALD के रूप में माना जा सकता हैH1L1, BLBP, Aquaporin-4 और S100B 29।

इसके अलावा, एनएससी की उपस्थिति प्रच्छन्न रूप में प्राथमिक संस्कृतियों में astrocytes की संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता। ये एनएससी phenotypical और ultrastructural विशेषताओं पेश करने के लिए GFAP की अभिव्यक्ति सहित astrocytes परिपक्व करने के लिए इसी तरह के दिखाया गया है। इसलिए, आणविक मार्कर है कि पूरी तरह से अलग-अलग और परिपक्व astrocytes के लिए विशिष्ट हैं की पहचान के लिए बहुत जरूरी है। Astrocytes उनके बाद पूरी तरह से भेदभाव कर विकास के चरणों में व्यक्त S100B की सूचना मिली। हाल ही में, यह बताया गया है कि नवजात cortical GFAP + astrocytes S100B अभिव्यक्ति की शुरुआत है कि div 15 26 के आसपास होने के साथ उनके पूर्वज स्टेम सेल संभावित खो देते हैं। इसी तरह DIV 14 पर हमारी संस्कृति की स्थिति में, GFAP व्यक्त कोशिकाओं के 91% पाए गए coexpress S100B, जो बताते हैं कि मुख्य रूप से संस्कृतियों टर्मिनली विभेदित परिपक्व हिप्पोकैम्पस astrocytes से मिलकर बनता है।

यह लगभग शुद्ध प्राथमिक हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृतियों microglial कोशिकाओं है कि ऊपर और नीचे astrocyte monolayer रहते contaminating का पूरी तरह से रहित प्राप्त करने के लिए असंभव है। इसलिए, यह astroglial संस्कृतियों में microglia दूषित है और यह भी इस अनुपात के रूप में संभव के रूप में कम रखने के लिए के अनुपात में जानना महत्वपूर्ण है। वर्तमान अध्ययन में हम आदेश में किसी भी microglia या संभावित contaminants के रूप में न्यूरॉन्स की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए microglia विशिष्ट मार्कर IBA1 या neuronal मार्कर MAP2 साथ astrocyte संस्कृतियों दाग। कृंतक astrocyte संस्कृति में microglia के अनुपात में कई कारकों है कि पशु उम्र, प्रजाति, क्षेत्र, संस्कृति के माध्यम से, विधि subculturing 30 मिलाते शामिल आधार पर 1% से 30% तक भिन्न हो सकते हैं। हमारी संस्कृति में हम microglial संदूषण का लगभग 6% है जो अन्य रिपोर्टों 25 के साथ तुलनीय है मनाया। astrocyte संस्कृति का इरादा उपयोग सूजन में हिप्पोकैम्पस astrocytes की भूमिका का अध्ययन करने के लिए है, तो यह जरूरी हैDIV 3. एलएमई से शुरू astrocyte संस्कृतियों में संभव microglial प्रदूषण को खत्म करने के लिए 10 डी के लिए 5 मिमी एलएमई के साथ संस्कृतियों के इलाज के लिए एक microglial साइटोटोक्सिक एजेंट है कि एक विधि के रूप में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है microglia 20,22 proliferating दूर करने के लिए है। इसके अलावा, एलएमई इलाज संस्कृतियों एक मिलाते हुए प्रोटोकॉल (1 घंटे के लिए 300 आरपीएम) के अधीन किया जाना चाहिए।

OGD / REOX प्रदर्शन में एक और तकनीकी चुनौती निर्धारित करने के लिए यदि हाइपोक्सिया के लिए पर्याप्त डिग्री astrogliosis प्रेरित करने के लिए हासिल किया गया है। astrocytes में हाइपोक्सिया के लिए मार्कर GFAP के नियमन और HIF-1α की प्रेरण शामिल हैं। इस प्रकार, इस अध्ययन हाइपोक्सिया में GFAP immunoreactivity में वृद्धि से इस बात की पुष्टि की गई थी (डेटा) नहीं दिखाया और HIF1-α धुंधला की अपरेगुलेशन (चित्रा 4)।

सारांश में, sexed नवजात हिप्पोकैम्पस astrocyte संस्कृतियों से प्राप्त परिणामों स्वस्थ सजातीय astrocyte परत di के साथ सफल सेल लगाव दिखायाइन विट्रो ischemia की प्रेरण पर coverslips पर ठेठ आकृति विज्ञान और प्रमुख प्रतिक्रियाशील astrocytic मार्कर GFAP की अभिव्यक्ति और S100B splaying। हमारा मानना ​​है कि प्रोटोकॉल यहाँ अपनाया संभावित पुरुष और महिला के दिमाग के विकास में astrocytes की भूमिका से संबंधित महत्वपूर्ण यंत्रवत और translational सवालों का जवाब देना है। पूरे संवर्धन प्रक्रिया के रूप में मौजूदा तकनीक के बहुमत के लिए विरोध किया, दो सप्ताह में परिपक्व और मिला हुआ sexed हिप्पोकैम्पस astrocytes उत्पन्न प्रयोगों की एक तेजी से बदलाव और तकनीक की सादगी देने सेक्स अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में astrocytic संवर्धन विधि के प्रयोग की सुविधा होगी मस्तिष्क जिससे विकासशील मस्तिष्क अनुसंधान के क्षेत्र में अपने व्यापक प्रचार-प्रसार के लिए अनुमति देने में glia कोशिकाओं की विशिष्ट भूमिका।

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Disclosures

लेखकों में से कोई प्रतिस्पर्धा है या परस्पर विरोधी हितों।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose cellgro 10-013-CV
Horse Serum Gibco 26050-070 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Cellgro  30-002-CI Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride Aldrich L1002-25G Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
Trypsin cellgro 25-050-CI Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips  Corning 354087
Water Sigma W3500 Cell-culture grade
PBS cellgro 21-040-CV Cell-culture grade
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies 25300-062
70 μm Sterile cell strainer  Fisher scientific 22363548
3.5 cm Petri dish BD Falcon 353001
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070
Forceps, fine  Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Confocal Microscope Nikon A1RSi 
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450 
Anti-IBA1 Wako 019-19741 Rabbit monoclonal
Anti-MAP2 Sigma M2320 Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha abcam ab179483 Rabbit monoclonal
Anti-S100B Sigma HPA015768 Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail) Biolegend 837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector Labs PK-6101 Contains 4 Reagents 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 Invitrogen A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 Invitrogen A11004

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References

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Chanana, V., Tumturk, A., Kintner, D., Udho, E., Ferrazzano, P., Cengiz, P. Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia. J. Vis. Exp. (116), e53695, doi:10.3791/53695 (2016).

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