Method Article

在基于生物发光钙指标GFP的水母体内脑功能成像方法

DOI:

10.3791/53705

⸱

January 8th, 2016

 ,  , 
1Equipe: Imagerie Cérébrale Fonctionnelle et Comportements (ICFC), Institut des Neurosciences Paris-Saclay (Nero-PSI), UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Graduate College, University of Iowa, 3Department of Anesthesia, Carver College of Medicine, University of Iowa

In This Article

Summary

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在这里，我们提出了一个新颖的钙利用生物发光记者-imaging方法。这种方法使用的稠构建GFP-水母发光蛋白，其结合的 Ca 2+并发光，省去了光激发。显著此方法允许长时间连续成像，获得脑深部的结构和高时间分辨率。

Abstract

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功能体内成像已经成为一个强大的方法来研究功能和脑细胞和利益结构的生理机能。近来已经开发的 Ca 2+使用生物发光性报告的GFP-水母发光蛋白（GA）-imaging的一种新方法。这种新的技术依赖于的绿色荧光蛋白和水母发光蛋白的基因融合，产生分子能够结合钙和 - 与另外的辅助因子腔肠中 - 发光明亮的光线可以通过光子收集器进行监控。已经产生对小鼠和果蝇携带GFP的水母发光蛋白基因的转基因品系，在 果蝇中，绿色荧光蛋白水母发光蛋白基因已被放置在GAL4 / UAS二进制表达系统允许大脑内针对性表达和成像的控制之下。这个方法后来被证明是能够检测两个向内的 Ca 2+ -transients和Ca 2+从内存储-released。最重要的是它允许在连续记录，成像在大脑内的更深的深度更大的持续时间，并记录在高时间分辨率（高达8.3毫秒）。在这里，我们提出了利用生物发光成像记录和分析钙蘑菇体中2+ -activity，结构中心在飞大脑学习和记忆的基本方法。

Introduction

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基本构图和大脑及其离散结构中的活性作用长期以来一直是神经科学领域内的紧张的学习领域。也许有人用来解决这个问题的最早的成功做法是在电活动变化的直接生理测量 - 但是替代方法，允许电压，pH或钙离子浓度的变化（作为活动代理）的实时成像带来了额外的功能，研究神经元活动1。成像技术携带的优点各种各样如降低侵袭和全脑结构内监控活性的能力。此外，在动物听话遗传学，包括果蝇 ，遗传编码的钙指标，如卡默莱昂，GCaMPs和其他发展1已使研究人员能够监测单个神经元，神经元群体和全脑结构。而更传统的荧光钙成像方法使用GCaMPs（GFP融合至钙调蛋白）或FRET（CFP和YFP融合至钙调蛋白）已被证明是提供良好的空间和时间分辨率有用的技术，光激发的基础过程滋生于它的实验一些限制应用程序。由于光激发，自体荧光，光漂白，并且光毒性的性质都不可避免地产生，这进而限制了可以被成像的结构的深度，记录的持续时间，以及记录的实时连续性。换句话说，记录必须经常进行间歇地避免这些不希望的副作用。

因为这些挑战的，​​已经开发了钙成像的其他替换的方法。其中最有希望的方法之一是生物发光成像，这依赖于通过后的钙结合的酶反应产生的光。 Bioluminescen牛逼成像不需要光激发，因此不会遇到同样的困难，传统的钙成像。所述生物发光性报告水母发光蛋白-从水母中分离，同样水母从中GFP也isolated-经由它的三个的EF手结构结合钙和发生构象....

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Protocol

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1.样品的制备

  1. 溶液的制备和设置
    1. 保持在标准的食品中，在24℃的所有果蝇线。后与他们保持低密度小瓶生成标准化的尺寸和重量的苍蝇。
      1. 添加10处女女性，10名男性在小瓶中，让它们交配，每2天他们转移到一个新的小瓶。然后用10天后，当苍蝇开始E关闭，每天收获苍蝇。保持苍蝇的年龄的准确记录，并让他们在良好的状态。
      2. 在第3天，分开女性的男性和保持女性20苍蝇每小瓶。记录苍蝇在4或5天之久。
    2. 制备林格氏溶液具有以下浓度:130毫摩尔NaCl，5mM的氯化钾，2mM的MgCl 2的，2mM的氯化钙 ，5mM的HEPES，和36毫蔗糖和调节的溶液，以精确地7.3的pH值。准备25μ灌注液，M尼古丁和100毫米氯化钾的林格氏液。
    3. 准备1000微升的枪头:用刀片形状尖斜面（约35从尖到底°），除去过量的碱以外，从尖端1个半厘米。
    4. 孵育期间准备的样品箱用于储存（23厘米×17厘米×8.5厘米）。放置两个海绵（12厘米×8厘米×3厘米）水饱和的底部[防止样品干燥]的小齿条装置下面放置样品它们的制备完成。
    5. 制备苍蝇样品，使它们包含在UAS-GFP-水母发光蛋白中的至少1个拷贝和一个副本的Gal4线的驱动的GFP-水母发光蛋白的表达。 OK107 Gal4的线（线驱动，主要表现在蘑菇体）是越过UAS-GFP-水母制定工作。
      注:....

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Results

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将GFP对水母发光蛋白的融合可以让我们通过GFP的激发形象化我们之前生物发光成像的兴趣区域在显微镜上（图3A，4A，6A，6E）荧光模式。一个刺激的蘑菇体的最简单的方法是通过激活离子型乙酰胆碱受体。虽然乙酰胆碱是该受体的内源性配体，我们已发现，尼古丁产生在蘑菇体更具有可重复性的响应。这部分是因为它们特异性表达的烟碱乙酰胆碱受体，从而通过使用尼古丁我们能够避免在大脑别处所表示的毒蕈碱性乙酰胆碱受体的活化。此外，尼古丁是比乙酰更稳定，且因此允许更好和更可靠的刺激控制。同时与花萼，细胞体（CCB）和内侧叶片（ML）的快速激活典型的响应开始（参见图4一种用于标记的图像）。一般建行响应持续时间更长，表现出比所述叶片的更大的生物发光响应中所示的响应的连续面板（ 图3C-H）。 图4B示出记录在100毫秒的时间分辨率的光子10秒的积累（10赫兹）到1分钟灌注25μM尼古丁响应的高峰期。继10分钟启动1分钟灌注100毫米氯化钾的第二个刺激（ 图4C，E），

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Discussion

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这里介绍的最近开发的生物发光型绿色荧光蛋白水母发光蛋白的方法允许在 钙 -activity在不同的神经元体内功能记录功能，如果需要的话，以及在其他类型的细胞，如肾星状细胞的报道中卡夫雷罗等。 2013年5。

修改后，故障排除，附加部件及关键步骤

果蝇畜牧

GFP-水母发光蛋白转基因（pG5A）4插入到pUAST矢量创建三个独立转化体线 6。所有行进行了测试的生物发光，并都能够向体内 的 Ca 2+ -activity 6响应。然而最近的实验中已经指出，插在第三染色体上的GA2线产生更强大的信号比GA1线插入Øn中的第二染色体。在这里，代表结果通过使用UAS-GA2.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们非常感谢来自美国 Sciences Wares 的 E. Karplus，感谢他宝贵而有用的帮助和建议。我们感谢 E. Carbognin、A. Avet-Rochex、M. Murmu、P. Pavot、D. Minocci、G. Vinatier 和 J. Stinnakre 为该技术的开发和改进做出的贡献。我们还感谢美国阿什本 H.H.M.I. Janelia Farm 的 B. Pfeiffer 和 G. Rubin 提供 pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP 系列。这项工作得到了美国华盛顿法国大使馆夏多布里昂奖学金对 A. Lark、美国国家科学基金会 （IOS 1352882） 对 T. Kitamoto 以及法国 ANR（ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin，2005 和 FlyBrainImaging，2011）、法兰西岛地区委员会（NeRF 和 DIM）、IFR-144、CNRS 的体格-化学生物学接口程序（2009 年）的支持， 以及 CNRS 的法国 JR Martin。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NaClSigma-AldrichS3014
CaCl2Merck1023911000
HEPESSigma-Aldrich7365-45-9
KClprolabo26 764.298normapur
MgCl2prolabo25 108.295normapur
蔗糖Sigma-AldrichS0389
尼古丁Sigma-AldrichN3876
ATPSigma-AldrichA2383腺苷 5′-三磷酸二钠盐水合
苄基腔肠素Prolume，纳米光 猫 #301 腔肠素 hhttp://www.prolume.com/
牙科胶水3M ESPE™46954Protemp IV
硅胶3M ESPE™36958Express 2 常规本体快速
胶带3M Scotch122s3M Scotch Magic Tape
移液器吸头康宁公司4868100-1,000 µl Univesal 移液器吸头
室和支架（载物台）手工制作
的孵化盒手工制作
的镊子（5 号）Fine Science Tools11252-00显微解剖钳
弯曲镊子Sigma-AldrichF4142显微解剖钳
胶水涂抹器 手工制作 
刀精细科学工具10316-145毫米深度 15度; 刺
EM-CCD相机 AndorDU-897E-CS0-#BViXon（冷却至 -80 °C）
显微镜尼康Eclipse-E800
浸没物镜尼康20X Fluor .5w
荧光解剖显微镜徕卡 MZ Fl III徕卡解剖镜和荧光灯
紧密的暗箱Science Wares定制 由 Science Wares
蠕动泵制造 GilsonMinipuls 2
管Fisher Scientific取决于厚度Tygon R3603，St-Gobain
灌注系统Warner64-0135  （VC-66CS）注阀控制系统，完整，带夹管阀，6 通道
灌注调节器Leventon201108Dosi-flow 3
测量和自动化浏览器Sciences Wares &National InstrumentsN/A软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
光子成像仪 科学产品 &National InstrumentsN/A软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewerScience Wares &国家机构N/A软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
ExcelMicrosoftN/A软件 https://www.microsoft.com
虚拟配音开放获取 不适用软件 http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2Martin et al.， 2007， Ref. 1 N/A没有库存 {目前} 公开可用 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP  B. Pfeiffer，Janelia Farms，美国阿什本。（库存 #1117340）pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2Lima 和 Misenboeck，参考文献 11 N/A没有库存 {目前} 公开可用 
OK107布卢明顿股票中心854http://flystocks.bio.indiana.edu/
物 灌

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
  2. Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci....

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Bioluminescent ImagingCalcium TransientGFP aequorinDrosophila BrainMushroom BodiesPhoton ImagerCoelenterazineNicotine StimulationPotassium ChlorideFluorescent Imaging

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