Summary
Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.
Abstract
Funcional em imagiologia in vivo tornou-se uma abordagem poderosa para o estudo da fisiologia e função de células e estruturas de interesse cerebrais. Recentemente, um novo método de Ca 2+ -Imaging utilizando o repórter GFP-aequorina bioluminescente (GA) foi desenvolvido. Esta nova técnica baseia-se na fusão dos genes GFP e aequorina, produzindo uma molécula capaz de ligação de cálcio e - com a adição de celenterazina seu cofactor - emissor de luz brilhante que pode ser monitorizado através de um colector de fotões. As linhas transgénicas que transportam o gene de GFP-aequorina foram gerados para ambos os ratos e de Drosophila. Em Drosophila, o gene GFP-aequorina foi colocado sob o controlo do sistema de expressão binário de GAL4 / UAS permite a expressão específica e de imagem no interior do cérebro. Este método tem sido mostrado subsequentemente que ser capaz de detectar tanto para dentro de Ca2 + e Ca 2+ -transients -released interiores de lojas. Mais importante que permite uma maior duração em gravação contínua, imagens em maiores profundidades no interior do cérebro, e gravar em altas resoluções temporais (até 8,3 ms). Aqui nós apresentamos o método básico para usar a imagem de bioluminescência para registrar e analisar Ca 2+ -Atividade dentro dos corpos de cogumelo, uma estrutura central para o aprendizado e memória no cérebro da mosca.
Introduction
A padronização e função de atividade dentro do cérebro e suas estruturas discretas fundamentais são há muito tempo uma área de intenso estudo no campo da neurociência. Talvez algumas das primeiras abordagens de sucesso utilizadas para resolver este problema foram mensuração fisiológica direta da mudança na atividade elétrica - métodos no entanto alternativas que permitem imagens ao vivo de alterações nas concentrações de tensão, de pH ou de cálcio (como proxy para a atividade) trouxe recursos adicionais para o estudo da actividade neuronal 1. Técnicas de imagem transportar uma grande variedade de vantagens, tais como a redução da capacidade de invasão e a capacidade de monitorar a atividade dentro de estruturas inteiras do cérebro. Além disso, em animais com genética tratáveis, incluindo a mosca da fruta Drosophila, desenvolvimento de indicadores de cálcio geneticamente codificados, como cameleon, GCaMPs e outros 1 permitiram que os pesquisadores para monitorar neurônios individuais, populações neuronais e do cérebro inteiroestruturas. Enquanto métodos de imagem de cálcio fluorescentes tradicionais mais usando GCaMPs (GFP fundido a calmodulina) ou FRET (PCP e YFP fundido a calmodulina) provaram ser técnicas úteis que fornecem boa resolução espacial e temporal, o processo subjacente de excitação luz gera algumas limitações em seu experimental aplicações. Devido à natureza da luz de excitação, a autofluorescência, foto-branqueamento, e fototoxicidade é inevitavelmente produzido, o que, por conseguinte, limita a profundidade das estruturas que podem ser visualizados, a duração de gravação assim como a continuidade de gravação em tempo real. Em outras palavras, as gravações deve frequentemente ser executada de forma intermitente a fim de evitar estes efeitos secundários indesejáveis.
Devido a estes desafios, foram desenvolvidos métodos alternativos adicionais de imagiologia de cálcio. Um dos métodos mais promissores é imagiologia bioluminescente, que depende da luz produzida por meio de uma reacção enzimática após ligação ao cálcio. Bioluminescent de imagem não requer luz de excitação e, consequentemente, não experimenta as mesmas dificuldades que imaging cálcio convencional. O repórter bioluminescente Aequorina - isolado de Aequorea victoria, o mesmo Jellyfish a partir do qual GFP também foi isolated- liga de cálcio através dos seus três estruturas mão EF e sofre uma mudança conformacional, levando a oxidação do seu coelenterazina cofator ea liberação de luz azul (λ = 469 nm) de 2,3. A Aequorina tem uma afinidade muito baixa para o cálcio (K d = 10 uM) que o torna ideal para monitorizar transientes de cálcio porque produz muito pouco barulho de fundo e não interfere com o sistema de tamponamento de cálcio intracelular 4. Embora aequorina tenha sido previamente utilizado para monitorizar o processo de indução neural no ovo de Xenopus 5 a luz produzida é muito fraca a ser usado para imagiologia de actividade neuronal em tempo real. Em um esforço para enfrentar este desafio, Philippe Br &# 251; deixe e seus colegas do Instituto Pasteur criou uma construção genética de fusão GFP e a aequorina genes, imitando o estado nativo dentro da água-viva 4. Este produto génico de fusão se liga a cálcio de novo através das três estruturas de mão EF de aequorina, que sofre uma alteração conformacional que conduz à oxidação da coelenterazina, o que transfere energia não radiativamente para o GFP. Esta transferência de energia resulta na liberação de luz verde (λ = 509 nm) da GFP, em vez de luz azul do aequorin. A fusão de GFP e aequorin também confere maior estabilidade da proteína ajudando a proteína de fusão produzir luz de 19 a 65 vezes mais brilhante do que a aequorina sozinha 4. Usando uma abordagem bioluminescente dentro do cérebro expande a aplicação experimental corrente de imagiologia de cálcio, tanto em termos de duração de gravação contínua e o número de estruturas dentro do cérebro que pode ser gravada. Em termos gerais no contexto do trabalho anterior, isso significa que ambos global e uma maiorvariedade de "actividade" regionalizada do cérebro pode ser monitorizada (por meio do proxy de transientes de cálcio). Mais importante actividade pode ser monitorizada por mais tempo, em tempo real e uma base contínua, que se presta facilmente à busca de uma compreensão completa da função basal no cérebro.
Nos últimos anos, o nosso laboratório e outros desenvolveram moscas transgénicas que expressam a GFP-aequorina sob o controlo do sistema de expressão binário (GAL4 / UAS-GFP-aequorina) 5,6. Usámos GFP-aequorina bioluminescência para a actividade ficha produzido por estímulos naturais, tais como aroma de 7,8, bem como os componentes celulares estudadas moduladores Ca2 + -Atividade nos corpos de cogumelo seguintes estimulação do receptor de acetilcolina nicotínico por aplicação directa 9. Além disso, temos também usado GFP-aequorina para abordar uma série de questões experimentais que não puderam ser abordadas anteriormente, como a longo prazoimagens de transientes de cálcio espontâneas e visualização de estruturas mais profundas do cérebro 10. Mais recentemente, temos utilizado o sistema / UAS GAL4 para expressar o receptor de mamífero ATP P2X 2 11 um canal de cátions, nos neurônios de projeção (PNs) e utilizado o sistema de LexA para expressar GFP-aequorina nos corpos de cogumelo (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a cortesia de B. Pfeiffer, Janelia Quinta, EUA). Isto permitiu-nos para ativar as PNs através da aplicação de ATP, que por sua vez ativa os corpos de cogumelo (um alvo a jusante da PNs), imitando condições mais naturais, como a resposta a um estímulo odor. No geral, esta técnica que combina P2X 2 e GFP-aequorina amplia as possibilidades experimentais. Em termos gerais, oferece a oportunidade de compreender melhor os padrões de atividade no cérebro, dando início a novos estudos sobre como os diferentes estímulos e perturbações podem alterar o padrão basal de atividade.
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Protocol
1. Preparação de Amostras
- Preparação das soluções e configurar
- Manter todas as linhas de Drosophila melanogaster a 24 ° C em meio padrão comida. Traseira e mantê-los em baixa densidade no frasco para gerar tamanho padronizado e peso de moscas.
- Adicionar 10 fêmeas virgens com 10 homens em um frasco, deixá-los acasalar e transferi-los a cada 2 dias para um novo frasco. Em seguida, 10 dias mais tarde, quando as moscas começar a EFeche, colher as moscas a cada dia. Mantenha um registro preciso da idade das moscas e mantê-los em boas condições.
- No dia 3, separar os machos das fêmeas e manter as moscas fêmeas 20 por frasco. Grave as moscas em 4 ou 5 dias de idade.
- Preparar a solução de Ringer com as seguintes concentrações: 130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de HEPES, e 36 mM de sacarose e ajustar o pH da solução precisamente a 7,3. Preparar soluções de perfusão de 25 μ; M nicotina e KCl 100 mM em solução de Ringer.
- Prepare 1.000 ponteira ul: utilizando uma forma de ponta de lâmina de barbear para uma inclinação (cerca de 35 ° a partir do final de ponta) e remover o excesso de base para além de 1 ½ centímetros da ponta.
- Caixa para armazenamento (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) de amostra preparar durante a incubação. Colocar duas esponjas (12 cm x 8 cm x 3 cm) saturado com água no fundo [para evitar a dessecação da amostra] abaixo de um aparelho de cremalheira pequena para colocar em amostras como a sua preparação é completada.
- Preparar amostras moscas de modo que eles contêm pelo menos um exemplar do UAS-GFP-aequorina e uma cópia de uma linha de Gal4 para conduzir a expressão de GFP-aequorina de. Linha OK107 Gal4 (a expressão linha de condução principalmente nos corpos de cogumelo) é cruzada com UAS-GFP-aequorina nesta preparação.
NOTA: O interior da caixa deve ser impermeável e exterior deve bloquear a luz a partir da caixa de entrar para evitar a degradação do coelenterazina durante a incubação.
- Manter todas as linhas de Drosophila melanogaster a 24 ° C em meio padrão comida. Traseira e mantê-los em baixa densidade no frasco para gerar tamanho padronizado e peso de moscas.
- Preparaçãoprepara- das amostras
- Gelo anestesiar Drosophila, transferindo-a para um frasco de vidro e manter em gelo durante 2 min antes de ser movido para o prato de Petri arrefecida para posicionamento na ponta da pipeta. Prepare pontas de pipeta em papel de filtro umedecido ligeiramente em 100 ml placa de Petri no gelo sob o microscópio de dissecação.
- Suavemente com uma pinça lugar voar dentro da ponta da pipeta.
- Usando um pincel empurre e alinhar mosca de tal modo que a cabeça está completamente além da borda de ponta e região dorsal é parcialmente exposta pela seção removida durante ponta shaping (Figura 2B).
- Combinar um pequeno (cerca de 3-4 ul) porções dos dois componentes da cola dentária. Aplique a cola cuidadosamente ao redor da frente e de trás da cabeça e pescoço para baixo e ao redor da borda ponta da pipeta - evitando a coroa da cabeça. Deixe a cola seca durante 2 min.
- Ponta lugar pipeta com mosca colada através do furo na câmara de gravação (Figura 2D) e gently pressione para fixar no lugar.
- Combinam-se as duas componentes de cola de silicone (cerca de 3-4 ul). Aplique cola no lado plano da câmara ao longo da borda onde a câmara e ponteira se reúnem para evitar vazamento de solução de Ringer. Deixe a cola seca durante 2 min.
- Dissecação
- Apor fita sobre o canal de perfusão, a borda curta e que se estende para a parte de trás da câmara.
- Coloque câmara com a mosca na quadra dissecção sob o microscópio por sua vez, na lâmpada fluorescente. Pipetar 1 mL de solução de Ringer para dentro da câmara.
- Use bisturi fino para remover a cutícula. Fazer incisões paralelas a partir da parte de trás da cabeça para a região antenal. Em seguida, corte ao longo da borda do olho, em seguida, fazer uma incisão perpendicular acima antena conectando as incisões anteriores. Adicione uma incisão paralela final para que na parte de trás da cabeça. Use as belas pinça afiada para remover a cutícula (Figura 2C).
- Use uma pinça afiada multa para agarrar suavemente umd limpar exposto tecido respiratório até o cérebro e [fluorescente] corpo cogumelo é claramente visualizado.
- Use uma pinça de ultra-afiada para captar com cuidado e beliscar neuroepitelial tecido que cobre o cérebro para permitir a permeação da coelenterazina.
NOTA: Como alternativa papaína pode ser usado para permeabilizar a neuroepithelia 9. - Usando uma pipeta, lavar duas vezes com solução de Ringer para remover qualquer resíduo de dissecção e lugar de exemplo na caixa escura.
- Pipetar 1 mL de solução de Ringer contendo 5 uM benzil-coelenterazina para dentro da câmara. Fechar a caixa e permitir que a incubação com coelenterazina à temperatura ambiente durante um mínimo de 2 horas.
2. Criação de Imagens
- Configuração
- Comece sistema de gravação: ligar microscópio, computador, câmera e sistema de drenagem e sala de definir controles ambientais até 25 ° C.
- Abrir Medição e programa Automation Explorer no computador. Clique em “ dispositivos e interfaces ", em seguida, clique duas vezes no" Ni Devices Movimento "e clique finalmente à direita na"-7334 PCI "e selecione" dispositivo inicializar ".
- Abra Photon Imager. Criar uma nova pasta eo nome do primeiro arquivo de gravação. Câmara deve atingir -80 ° C antes de sistema funcionará.
- Configure o sistema de perfusão - adicionar KCl, nicotina e solução de Ringer para reservatórios e ajustar para cada solução as descargas a 2 ml / min. Lava-se com solução de Ringer antes de iniciar o experimento.
- Prepare amostra
- Montar lugar imaging bloco prato no monte sob o microscópio com uma ampliação de 5X e inserir tubo de perfusão no canal através de punção.
- Defina para o modo de microscópio fluorescente, em seguida, centro e trazer corpos de cogumelo (MB) em foco. Ajuste de 20X e centro-re e foco.
- Posição aparelho de drenagem sobre a associação de drenagem, ajustar a altura da derivação de drenagem para que a ponta é apenas above piscina, e executar a solução de Ringer durante 30 segundos para garantir uma drenagem adequada.
- Puxe para baixo escudo para lacrar aparelhos da luz. Usando o sistema automatizado em fóton imager fazer ajustes finos para o foco e dar uma imagem de referência fluorescente dos MBs.
- Gravação
- Ajuste a velocidade do fóton para velocidade de gravação desejada (de 50 ms até 1 segundo ou mais). Selecione o modo de fótons e obturador aberto. Genótipo Record, sexo, idade e número da amostra nas entradas do registro. Ajuste caixas posição ROI mais de cálice e corpos celulares (CCB) e lobos medial ao clicar nas caixas de ROI e arrastando enquanto mantém controle.
- Ficha de linha de base durante cerca de 5 a 10 min (se for o caso).
- Aplicar nicotina durante 1 min. Nota iniciar / parar em log. Lava-se com solução de Ringer durante 5 min.
- Espere 5 minutos para a recuperação e preparar KCl entrada de log e timer.
- Aplicar KCl durante 1 min. Nota iniciar / parar em log. Lava-se com solução de Ringer durante 1 min.
- Interruptorpara o modo fluorescente, dê imagem fluorescente final, e desligue a solução de Ringer.
- Pressione o botão "Stop". Caixa de diálogo irá pedir para desligar o sistema. Selecione "Não" para continuar a gravação.
- Abrir escudo, sistema de drenagem movimento, lente objetiva interruptor para 5X, remover o tubo de perfusão. Retirar da amostra / gravação prato do palco, limpar lente 20X lavando e limpando a lente duas vezes com água.
- Pressione o botão branco jogo no topo da janela do programa para iniciar a próxima gravação.
3. Análise e Criação de Vídeo
- Extrair valores de fótons
- Abra o programa de análise de fóton (por exemplo, Photon Viewer) e aberto arquivo de planilha primeira amostra.
- Selecione a guia de controle de exibição. Selecione o ROI clicando na região, mantendo o controle. Ajuste o tamanho, a orientação ea forma de regiões de interesse para abranger GFP CCB iluminado e lobos medial.
- Adicionar uma adiçãoal ROI, clicando em "Definir ROI" e clicando e arrastando na tela para criar o novo ROI.
- Selecione a aba "Filme" para reproduzir vídeo fóton. Ajuste "width sec" e "passos SEC" como desejado. Reajuste colocação ROI conforme necessário.
- Selecione capturas de tela representativas de fluorescência da GFP, a resposta nicotina e resposta KCl. Imagem pasta screenshots de culturas e em uma apresentação de slides para posterior análise e comparação.
- Ajuste tanto a "largura sec" e "segundo passo" para a velocidade de gravação em segundos. Selecione duração da análise movendo marcadores de cinza no painel superior para a região do suporte antes do início do estímulo e apenas após o fim resposta.
- Selecione "Suspender vistas ao jogar" imprensa "<< REW" e pressione "PLAY>". Selecione a aba "Contagem Taxa Chart" e unidades de ajustar conforme desejado e cores de linha para combinar a cor ROI.
- Quando a análise é terminada, Pressione "Contagem Export Data Rate". Selecione capturas de tela do combinado gravações CCB e região do lóbulo medial do interesse de cada lado. Imagem pasta screenshots de culturas e em um slide com imagens de resposta. Este slide será utilizada mais tarde na análise final.
- Exemplo Análise: um método para a análise de dados de fotões extraídos detalhados
- Abra os arquivos de planilha na pasta "Contagem Taxa de Exportações".
- Reformatar as células da primeira coluna denominada tempo para exibir a hora em hora e minutos.
- Referência a lâmina correspondente para a amostra. Remova todos os valores, exceto as colunas para o tempo e os dois representante ROIs.
- Determinar estimulação nicotina hora de início - disponível em arquivo de log na entrada principal pasta- remover dados adicionais antes de iniciar ou valor de realce.
- Encontre mais alto / valor de pico tanto para CCB e lóbulo medial e marca / highlight.
- Determinar início de resposta e tempo do fim para ambosCCB e lóbulo medial através da criação de uma estimativa utilizando ponto de tempo de resposta correspondente representada graficamente no slide e selecione valor real pela mudança de valores na proximidade com esses pontos. Destaque a região entre esses pontos, tanto no CCB e lobos medial. Como alternativa, use uma macro 9.
- Combine todas as amostras de um grupo experimental em uma nova planilha.
- Alinhar no pico através da determinação do valor de linha é para cada valor de pico CCB. Subtrair os valores mais baixos a partir do mais alto valor de linha para determinar o valor aproximado linha onde os dados da amostra devem ser copiados novamente para. Verificar que todos os valores de pico estão alinhados.
- Copie a folha duas vezes e apagar tanto as colunas lóbulo medial ou as colunas CCB criação de páginas de única CCB ou valores lóbulo medial.
- Remover dados após as todas as respostas CCB ter terminado. Criar quatro linhas rotulado Total de fótons, a resposta de comprimento (duração), pico de amplitude e latência de resposta. Copie e cole este novamente abaixo dos originais.
- Use a função SUM para determinar total de fótons durante a resposta. Use a função COUNT para determinar o comprimento da resposta. Copie e vincular mais alto célula de valor para determinar o valor de amplitude de pico. Use função COUNT - seleccionar a partir do início da perfusão de nicotina para o início da resposta - para determinar a resposta de latência.
- Copiar valores usando a função de ligação e multiplicar (todos exceto amplitude máxima) pela gravação velocidade em segundos.
- Gráficos Bar / caixa pode ser criada para os parâmetros calculados, como Total de Fótons, Peak Amplitude e Response Corpo, se assim for desejado (ex .: Figura 5B, C, D).
- Na coluna após a resposta de fotões de dados em bruto, a média dos pontos de dados em bruto para cada ponto de tempo utilizando a função média. Se desejado seguimento com uma coluna de determinar o erro padrão da média (SEM), para cada um dos valores de fotões em média de um ponto de tempo.
- Use a coluna média para construir um profil médio de respostae [Graph] para o grupo de amostra CCB. Para fazer isso, selecione a coluna que especifica o tempo que os valores do eixo-x da coluna e dos valores médios de fótons como o eixo-y e, finalmente, selecionar a ferramenta scatterplot criação gráfico.
- Repetir este procedimento de análise com os dados dos lobos mediais.
- Criando imagens para o vídeo
- Visualizador de fóton aberto.
- Selecione a guia de controle de exibição. Clique em ROI, mantendo controle para selecionar, remover e / ou minimizá-la.
- Modificar "width sec" (tempo de acumulação) como desejado para determinar o conteúdo de cada quadro.
- Modificar "sec passo" para definir a sobreposição de cada quadro.
- Selecione "visões de exportação durante a reprodução de" pressionar "<< REW" e "PLAY>". As imagens para o vídeo será exportada para a pasta "Vista exportações" como uma série de arquivos de .png.
- Usando Virtual Dub para fazer vídeo: um método para vídeo creation detalhada
- Crie uma nova pasta chamada "resultats" na pasta vista exportações que contém as imagens.
- Traga de script (renommer.VBS) para a pasta de imagens.
- Clique duas vezes em renommer.VBS para ser executado.
- Imagens serão automaticamente renomeados numericamente e copiados para a pasta "resultats".
- Abrir VirtualDub.exe.
- Selecione o arquivo de vídeo aberto - selecione primeira imagem (imagens subsequentes será carregado automaticamente).
- Selecionar vídeo - selecione a velocidade de fotogramas ajustar conforme desejado.
- Selecionar vídeo - selecione compressão selecione Cinepak Codec pelo raio.
- No arquivo AVI selecione Salvar como o vídeo será criado automaticamente.
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Representative Results
A fusão de GFP a aequorina permite visualizar a região de interesse antes da imagem de bioluminescência através da excitação de GFP em modo fluorescente no microscópio (Figura 3A, 4A, 6A, 6E). Uma das maneiras mais simples para estimular os corpos de cogumelo é através da activação dos receptores nicotínicos de acetilcolina ionotrópicos. Embora a acetilcolina é o ligando endógeno deste receptor, descobrimos que a nicotina produz respostas mais reprodutíveis nos corpos de cogumelo. Isto é em parte porque especificamente expressam os receptores de acetilcolina nicotínicos, e deste modo, utilizando nicotina que podem evitar a activação dos receptores muscarínicos expressos em outras partes do cérebro. Além disso, a nicotina é mais estável do que a acetilcolina, e, portanto, permite uma melhor e mais fiável o controlo do estímulo. Uma resposta típica começa com a ativação rápida de ambas as cálice, célula-corpos (CCB) e lobos mediais (ML) (veja a Figura 4Uma imagem de marcado). Geralmente a resposta CCB dura mais tempo e exibe uma resposta bioluminescente maior do que os lóbulos como se mostra nos painéis sequenciais de resposta (Figura 3C-H). A Figura 4B mostra uma acumulação de 10 seg de fotões gravadas com uma resolução temporal de 100 ms (10 Hz), durante o pico de uma resposta a uma perfusão de 1 min, de 25 uM de nicotina. Após um período de washout e recuperação de 10 min uma segunda estimulação de um 1 min de perfusão de KCl 100 mM é iniciada (Figuras 4C, E) que nos permite confirmar a viabilidade da nossa amostra. As respostas quantitativas podem ser analisados, selecionando ROI durante a análise in visualizador de fóton. Executando a análise in visualizador de fóton produz ambos os gráficos que indicam o número de fótons emitidos no ROI selecionada ao longo do tempo (Figura 4D e E), bem como planilhas exportáveis desses valores. Figura 4D é um example dos gráficos produzidos pelo espectador fótons traçando os fótons emitidos no ROI 2 [verde] (CCB direita) e ROI 4 [blue] (lobos medial direita). Dados semelhantes para a resposta de KCl representado na Figura 4E. Os dados exportadas pode ser usado para reconstruir a curva de resposta (Figura 5A) bem como para extrair dados adicionais sobre vários parâmetros, tais como a duração, amplitude de pico, e resposta total (Figura 5B-D). Recentemente, os sistemas utilizando GAL4-UAS e LexA que desenvolveram um método para desencadear uma resposta mais natural. Resumidamente, o ATP-gated P2X 2 canais de catiões é expressa nos neurónios de projecção (PNS) e GFP-aequorina (GA) é expressa nos corpos de cogumelo - um alvo do SNP; isto permite-nos para excitar selectivamente as PNs embora aplicação do ATP, que pode, por sua vez, produzem resposta em corpos de cogumelo (Figura 6).
Figura 1. Características dos Repórteres bioluminescentes (GFP-aequorina). (A) Esquema de GFP e gene de fusão aequorin com seqüência de ativação a montante. (B) Modelo de emissão de luz azul de aequorina, em resposta a níveis elevados de Ca2 +. (C) Modelo de emissão de luz verde por GFP-aequorina em resposta aos altos níveis de Ca 2+. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Experimental configurar. (A) Fly posicionado na ponta da pipeta. (B) Uma ilustração da técnica de colagem adequado estabilizar a cabeça e a região de vedação entre o corpo da mosca e ponta da pipeta. (C) Esquema de dissecção para abrir cápsula cabeça. (D) 1 ml câmara na exploração do bloco com tubo de perfusão inserido. Dimensões da câmara totais: comprimento: 7,4 cm, largura: 2,7 cm, altura: 0,55 cm. Dimensões câmara interna: comprimento: 1,7 cm, largura: 1,4 cm, altura: 0,35 cm, e o raio do buraco câmara: 0,1 cm. (E) Vista de cabeça mosca mostrando sinal de GFP-positivo nos MBs: baixo luz fraca com fluorescência derivada de OK107-driven GFP-aequorina após a remoção da cutícula. (F) Microscópio com câmera de fótons e sistema de perfusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Representante resposta a 25? M nicotina nos corpos de cogumelo. (A) imagem fluorescente dea expressão GFP-aequorina nos corpos de cogumelo em GA2 / +; OK107 / + (barra de escala = 50 mm) de controle fly cérebro. (B) resposta bioluminescente Peak nos corpos de cogumelos. (C) antes da estimulação. (D) O início da resposta. (E) resposta Peak. (F) Continua resposta CCB. (G) Cair resposta CCB. (H) Fim de resposta (BH: Barra de escala = 33 mm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Análise Representante da gravação da amostra (A) imagem fluorescente do corpo cogumelo do GA2 / +;. OK107 / + controle voar com quatro selecionados ao longo dos CCB e medial lobos (ba escala de ROIR = 50 mm). (B) Acumulação de 10 segundos da resposta bioluminescente para 25 uM de nicotina - resposta de fotões gravado em 100 ms. (C) de acumulação 10 seg de resposta bioluminescente ao KCl 100 mM gravado em 100 ms. (D) Gráfico do número registrado de fótons emitidos durante a resposta a nicotina dentro de ROI de 2 e 4 cobrem o CCB direito e lobos medial respectivamente. (E) Gráfico do número registrado de fótons emitidos durante a resposta dentro de KCl 4 de ROI 2 e abrangendo os lobos CCB e medial direito, respectivamente. Em d, e, o eixo Y à esquerda corresponde ao número total de fótons dentro de todo o campo de visão, enquanto o eixo Y direita corresponde aos fótons dentro do ROI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Parâmetros representativos análise da gravação da amostra análise excel Representante da resposta bioluminescente para ativação nicotínico do corpo cogumelo no GA2 / +;. OK107 / + fly controle. Resposta (A) Photon ao longo do tempo no CCB e lobos medial. (B) Duração das respostas do CCB e lobos mediais. (C) Maior valor de fótons (amplitude máxima) durante a resposta dentro do CCB e lobos medial. (D) Total de fótons dentro CCB e lobos mediais de resposta inteira. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Dois resposta diferente em corpos de cogumelos após a estimulação de PNs through ATP e P2X 2. Amostra 1 mosca expressar P2X 2 em PNs e GFP-aequorina em corpos de cogumelo (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) imagem fluorescente de corpos de cogumelo com de ROI (escala. bar = 50 mm). (B) imagem Bioluminescent do pico de resposta corpos de cogumelo seguintes ativação das PNs por P2X 2 estimuladas com 500 � de ATP, observadas principalmente nos lobos medial. (C) imagem Bioluminescent de resposta de pico KCl. (D ) curso Tempo de emissão de fóton dentro das regiões de ROI, em toda a resposta Amostra 2 fly expressar P2X 2 em PNs e GFP-aequorina em corpos de cogumelo (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh ). (E) da imagem fluorescente com ROI (barra de escala = 50 uM). (F) Bioluminescent imagem da resposta induzida nos corpos de cogumelo na sequência de umctivation das PNs por P2X 2 estimuladas com 1 mM de ATP, em ambos os lobos e CCB. (G) Bioluminescent imagem de pico de resposta KCl. (H) curso Tempo de emissão de fóton dentro das regiões de ROI, em toda a resposta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A abordagem de GFP-aequorina à base bioluminescente recentemente desenvolvido aqui apresentada permite a gravação funcional in vivo de Ca 2+ -Atividade em diferentes neurónios, assim como, se desejado, em outro tipo de células, tais como células estreladas rim como relatado em Cabrero et ai. de 2013 5.
Modificações, resolução de problemas, componentes adicionais e etapas críticas
Drosophila Pecuária
GFP-aequorina transgene (pG5A) 4 foi inserido no vector pUAST para criar linhas de três transformantes independentes 6. Todas as linhas foram testadas quanto à sua bioluminescência, e todas foram capazes de responder aos in vivo Ca2 + -Atividade 6. No entanto experimentos mais recentes têm apontado que a linha GA2 inserido no terceiro cromossomo é gerado um sinal mais robusto do que a linha o GA1 inseridon o segundo cromossomo. Aqui, os resultados representativos foram obtidos usando UAS-GA2 cruzados com a linha OK107 MB specific. Além disso, recentemente, B. Pfeiffer gerada uma construção de GFP-aequorina colocado sob o controlo do elemento regulador 20XUAS (20X-G5A-2) e esta construção foi validado no nosso laboratório. Resumidamente, dá um sinal muito forte, mais forte do que a GA2 padrão, o que, por conseguinte, deve ser mais eficiente e útil para monitorizar mais do Ca2 + -Atividade em estruturas mais profundas do cérebro, tais como o corpo-elipsóide. Além disso, também podem ser úteis para imagiologia de pequenas quantidades de neurónios ou em terminais de axónios (contactos sinápticos).
Os preparativos para a Criação de Imagens
Embora a mosca devem ser anestesiados gelo durante o posicionamento e colagem, é importante minimizar o tempo em gelo. Moscas deve ser transferido para um frasco de vidro e mantidos em gelo durante 2 min antes de ser movido para o prato de Petri arrefecidapara o posicionamento na ponta da pipeta. Temos notado que período de tempo prolongado de anestesia reduz a viabilidade da amostra e pode atenuar a resposta. Idealmente, nós mantemos o tempo de anestesia gelo abaixo de 5-10 min.
Taping e colagem são passos críticos. É crucial para fixar a cabeça de mosca no lugar e para dissecção de imagem, bem como para evitar a fuga de solução de Ringer para a ponta da pipeta e / ou para fora da câmara de gravação. Cola dental (e, em menor medida, a cola de silicone) irá tornar-se pegajosa e subsequentemente iniciar a seco logo que os dois componentes são combinados. Por isso, é crítico para aplicar a cola de forma expedita para evitar ligação fraca e aglutinação da cola. Em alguns casos, temos notado que as variedades alternativas de fita adesiva e cola, quando em contacto com a solução de Ringer, podem liberar contaminantes em solução de Ringer que podem afetar a mosca e sua resposta, particularmente para experimentos dedicados a tele estudo do sistema olfativo, utilizando diferentes odores. Consequentemente, tenha cuidado aqui se materiais de substituição (ver materiais para variedades específicas que usamos).
Diversas formas diferentes de coelenterazina têm sido desenvolvidas de forma a optimizar a sua actividade, tais como a velocidade de emissão de luz, Ca 2+ -affinity (sensibilidade), ou a intensidade de emissão de luz 12. Por exemplo, a coelenterazina nativa é mais estável, portanto, mais adequado de imagem latente a longo prazo como várias horas, enquanto a benzil-coelenterazina (também denominado h-coelenterazina) resulta numa maior emissão de luz mais rapidamente e com mais curta meia-vida. Para obter informações adicionais sobre as diferentes formas de coelenterazina, consulte o endereço da web na lista de materiais.
Imagem
Sinais de bioluminescência pode ser monitorada com uma câmara CCD multiplicador de electrões (EM-CCD, arrefeceu-se até -80 ° C) ajustada sobre um microscópio. Esta configuração deve be alojados dentro de uma caixa escura apertado para evitar qualquer indesejado (ambiente) luz contaminação. A configuração descrita neste manuscrito utiliza uma lente de 20x de imersão-objectivo permitir um campo de visão de 400 x 400 ^ m (512 x 512 pixels). Para melhorar a relação sinal-ruído, os dados foram adquiridos com um tempo de integração de 0,100 s (10 Hz), e 2 x 2 binning foi usada (1 pixel = 1,2 x 1,2 mm). X para adquirir e armazenar dados, cada fóton detectado foi atribuída, y-coordenadas e um ponto de tempo. Entre 500 e 600 nm de comprimento de onda, a câmera EM-CCD (ver descrição precisa na Lista de Materiais) tem uma eficiência quântica de 96%.
Um dos parâmetros mais importantes para a imagem in vivo funcional do cérebro é a resolução temporal. Até agora, a maioria à base de fluorescência de Ca2 + -Imaging técnica tais como GCaMP Cameleon e fornece uma resolução temporal de cerca de 4 Hz (250 ms / quadro). Recentemente, com a baseada em GFP-aequorina bioluminescência temos sido capazes de raise o tempo de aquisição de até 100 ms / frame com a câmera EMCCD e mesmo até 120 frames / seg (8,3 ms / frame) com a câmara ICDD multiplicador de elétrons 10. Neste resolução temporal que se aproxima das técnicas electrofisiológicas (na gama de cerca de 1 ms). Enquanto alta resolução temporal é informativo e crucial para os estudos dedicados a transmissão sináptica e atividade de estímulo induzido, estendido ainda mais lento essencial Ca 2+ -kinetics também ocorre dentro dos neurônios, por exemplo, a liberação de Ca 2+ a partir das intracelulares de Ca2 + -stores (para uma revisão: Berridge et al, 2003. 13). Para este último tipo, uma resolução temporal, mais lenta é ainda aceitável, enquanto que inversamente, que geralmente requerem uma melhor -affinity Ca2 + a partir do sensor a ser detectado. Este requisito tem sido conseguido com GFP-aequorina para detectar a libertação de Ca2 + intracelular no terminal -stores axónio do recept olfactivoORS neurônios 7,8. Em alternativa, dependendo das condições experimentais desejadas, mais lento tempo de aquisição podia ser utilizado. Por exemplo, no longa O / N gravações, temos utilizado um tempo de integração 2 segundos devido ao grande número de pontos de dados coletados (Minocci et al., 2013). Em resumo, um aspecto prático, com a bioluminescência é que a resolução temporal pode ser facilmente ajustado de acordo com as condições experimentais desejados.
Câmaras alternativas adicionais do (mosca) foram desenvolvidas a fim de facilitar os objectivos da experiência. Por exemplo, para os estudos baseados no estímulo odor natural, a antena deve ser mantido livre, portanto, uma abordagem como o desenvolvido por A. Fiala 14 é mais adequado (nós usamos uma abordagem semelhante para Murmu et al. 2010). Resumidamente, nesta abordagem, a mosca é amarrado (colada) num pino minutien no pescoço, que é colada a uma lamela de cobertura de plástico que contém um pequeno orifício. Um selo é criadoao redor do topo da cabeça da mosca. Em seguida, uma gota de campainha é depositado sobre a cabeça, cabeça e a cápsula é dissecado. Em tal modo, as antenas são mantidos livres e estão disponíveis a sentir os odores. Da mesma forma, para a gravação de longo prazo, como O / N ou mesmo alguns dias 10 a mosca tem de ser mantido tão livre de restrição quanto possível, e, em alguns casos alimentados (por exemplo: com um papel capilar embebido numa glucose a 5% solução). Nestas circunstâncias a abordagem de Fiala também é mais adequado do que a abordagem na ponta da pipeta azul (método de snorkeling).
Todas as aplicações de drogas pode ser controlado externamente usando um multi-válvulas do sistema de perfusão gravidade 6 way. O fluxo pode ser controlado usando reguladores de perfusão volumétricas calibrados antes de cada sessão de gravação para um fluxo de 2 ml / min. Aparelho de drenagem extrai líquido a uma velocidade de 2 ml / minuto a partir da câmara de gravação através de bomba peristáltica, permitindo um fluxo contínuo.
Dentroalgumas condições, devido ao custo elevado do fármaco e / ou a quantidade de fármaco a utilizar, um pretende aplicar apenas pequenas quantidades de compostos. Assim, é necessário aplicá-lo directamente no banho, em vez de através do sistema de perfusão. Neste caso, o obturador deve ser fechada durante este processo, para evitar a contaminação de luz.
Métodos de análise
Contagens por segundo ou contagens por segundo por coordenar ambos têm sido utilizados por nosso grupo para análise. As contagens por segundo é, talvez, os mais adequados para respostas brilhantes em estruturas integrais, enquanto que as contagens por segundo e por coordenadas (que representa uma normalização das respostas ao tamanho do ROI) é o mais adequado e preciso para pequenas populações de células. Ambos podem ser facilmente seleccionados no software de análise.
Uma das principais vantagens de utilizar a abordagem de bioluminescência é o caminho que são (x, y, t parâmetros de aquisição e os dados armazenadoscada fótons emitidos). De fato, enquanto todas as outras técnicas de imagem utilizadas modo padrão como uma imagem completa adquirida (geralmente em um formato TIFF), com este sistema, que adquire apenas o sinal relevante e significativo, armazenando apenas as coordenadas de pixel que foram ativados pela luz durante um duração pré-determinado de tempo (o que corresponde ao tempo de aquisição ou resolução temporal). Por conseguinte, o armazenamento dos dados é realmente "leve" em comparação com o armazenamento de uma imagem completa, e, consequentemente, torna mais fácil para analisar os dados. Para análise dos dados, usamos um software relacionado (visualizador de fótons), que permite o ajuste do tempo de acumulação se o desejar. Em seguida, a exibição de uma imagem dos sinais pode ser ajustado como desejado num gol para apresentar os dados de forma convincente. Em paralelo, os resultados são quantificados ao mesmo tempo de resolução do que o seu tempo de aquisição.
Significância e aplicações biológicas de imagiologia bioluminescente
Como mencionado acima a imagem de bioluminescência de cálcio oferece três principais vantagens para técnicas de imagem de cálcio fluorescente: (1) a regiões mais profundas do cérebro podem ser trabalhada, (2) de imagem pode ocorrer continuamente por períodos mais longos como várias horas como O / N e até mesmo em alguns casos até dois dias, e (3), mais recentemente, com uma resolução temporal maior, até 120 quadros / seg (8,3 mseg). A principal limitação da abordagem bioluminescente é devido à sua incompatibilidade com iluminação confocal, o que, consequentemente, não nos permite determinar a profundidade exacta (z-plano) das estruturas ou neurônios ativados.
A primeira vantagem de imagem de bioluminescência, imagiologia de regiões profundas do cérebro, foi anteriormente demonstrado em 2007 pela imagem de uma resposta de cálcio induziu elevados de potássio no corpo elipsóide (EB), uma estrutura profunda localizada no meio do cérebro, sem prévia relatórios electrofisiológicos ou funcionais 6 Ca2 + -Atividade na EB após a aplicação de picrotoxina (um bloqueador dos receptores GABA A) demonstrando que os GABAergic ring-neurônios do eB são neurónios inibitórios de fato (descrito em :. Diaper et al, artigo apresentado).
O segundo benefício, mais longo e tempo de gravação contínua, tem sido explorado em vários estudos do nosso laboratório. Estimulação odor foi utilizado para examinar a actividade dos neurónios cerebrais, em estudos anteriores 11,15,16. Usando a imagem latente mais longo prazo, no entanto, nosso laboratório tem sido capaz de mostrar alterações anteriormente não declaradas na cinética dentro dos neurônios receptores olfativos para odores. O primeiro estudo por Murmu et al. (2010) mostraram que enquanto estímulos odor curto (1-3 seg) exibiu cinética semelhante e uma diferença moderada em amplitude, um estímulo mais odor (5 seg) causou uma amplitude muito maior, bem como um alterações na cinética / structure da resposta que foi atribuído à reservas intracelulares de cálcio. Um estudo posterior mostrou que, embora a 5 aplicações sucessivas de pulsos de 1 segundo de odor na intervalos de 5 minutos não alterou a resposta de cálcio, o aumento do comprimento do estímulo a 5 segundos levou a atenuação progressiva da resposta, sugerindo um processo de adaptação. Além disso, este fenômeno adaptação apareceu a ser iniciada por GABAergic regulação dos estoques de cálcio previamente identificados 8. É importante salientar esta dados também mostra que, nestas condições experimentais, de GFP-aequorina o Ca2 + -sensor pode detectar e seguir o cálcio libertado a partir das intracelulares de Ca2 + -stores. Um estudo exclusivo adicional de nosso laboratório usado bioluminescente imaging O / N para gravar a atividade basal (espontânea) em todo o populações neuronais e gliais no cérebro, bem como a atividade nos corpos de cogumelo 10. Essas gravações revelaram atividade espontânea surpreendente em formigaEnnal mecanosensorial e motor central (AMMC) e lobo antenal. Além disso, células inesperada atividade autônoma na glia ocorrendo durante toda a noite. Dentro do corpo de cogumelo o estudo identificou tanto a atividade punctata e dois picos distintos, um curto e um longo cuja incidência mudou com 10 anos de idade.
No estudo mais recente em nosso laboratório, usamos a imagem de bioluminescência para examinar os efeitos da manipulação de moléculas de sinalização secundárias envolvidas na memória, e como eles afetam a resposta de cálcio dentro dos corpos de cogumelo 9. Com efeito, embora burro e nabo foram identificados mais de 30 anos e são conhecidos por regular o nível de cAMP, os seus efeitos in vivo sobre os mecanismos celulares e fisiológicos e, particularmente, sobre o Ca 2+ -response ainda permanecem largamente desconhecidos. Com a aproximação GFP-aequorina, temos sido capazes de registrar simultaneamente o seu cálice (o structur dendríticaes) e os corpos celulares, bem como as projecções axonais ao nível dos lóbulos, e, assim, permitindo correlacionar o nível e a cinética da resposta nos diferentes compartimentos da presente estrutura altamente complexa.
A aplicação mais recente estamos desenvolvendo imita uma resposta natural através de ativar artificialmente populações neuronais pré-sinápticos para a estrutura de interesse. Para fazer isso, o receptor P2X expressar 2, um canal fechado catião-ligando que é sensível ao ATP, em neurónio pré-sináptico e expressar GFP-aequorina na população neuronal pós-sináptica. A segregação destes dois elementos em diferentes populações neuronais requer dois sistemas de expressão separados. Para este fim construir um LexA contendo GFP-aequorina foi criado. Nas nossas experiências preliminares com este sistema que expressa P2X 2 em um subconjunto do SNP utilizando o Gal4-GH146 com UAS-P2X 2 e GFP-aequorina no corpo cogumeloutilizando a linha de LexA MB247 combinado com LexA-13X-GFP-aequorina. Temos registos com êxito respostas de cálcio no corpo de cogumelo com estímulos de ATP 1 mM para o receptor P2X 2 no SNP (Figura 6).
Em conclusão, o GFP-aequorina abordagem bioluminescência tem provado ser útil no estímulo da gravação de Ca2 + induzida -Atividade, análogos aos de outros Ca2 + -indicators. Mas, mais importante, que também permite a detecção de Ca 2+ espontânea -Atividade dentro do cérebro. Esta abordagem abre possibilidades futuras para experimentos de longa duração e de imagem do cérebro inteiro que podem aumentar a profundidade de nossa compreensão dos fenômenos fisiológicos e padrões de atividade no cérebro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
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