Summary
Здесь мы представляем роман Ca 2+ -imaging подход с использованием биолюминесцентного репортера. Этот подход использует конденсированную конструкт GFP-экворин, который связывается с Са 2+ и излучает свет, устраняя необходимость в возбуждении светом. Значительно этот метод позволяет длительной непрерывной визуализации, доступ к глубинных структур головного мозга и высоким временным разрешением.
Abstract
Функционал естественных изображений стала мощным подход к изучению функции и физиологию клеток головного мозга и структур, представляющих интерес. Недавно был разработан новый метод Ca 2+ -imaging помощью биолюминесценции репортер GFP-экворин (GA). Этот новый метод опирается на слияния GFP и экворин генов, производя молекулу, способную связываться кальций и - с добавлением его кофактора коэлентеразина - излучающих яркий свет, который можно наблюдать через фотонов коллектора. Трансгенные линии, несущие ген GFP в-экворин были получены для мышей и Drosophila. У Drosophila, ген GFP-экворин был помещен под контроль системы двоичной GAL4 / UAS позволяет направленной экспрессии и визуализации в головном мозге. Этот метод впоследствии было показано, чтобы быть способным обнаруживать и внутрь Ca 2+ -transients и Са 2+ -released от внутренних магазинов, Самое главное это позволяет в большей продолжительности в непрерывной записи изображений на больших глубинах в пределах мозга, и записи на высоких временным разрешением (до 8,3 мс). Здесь мы представляем основной метод для использования биолюминесцентного изображений для записи и анализа Ca 2+-активности в течение грибных тел, структуру центрального к обучению и памяти в летучей мозга.
Introduction
Основная рисунка и функции деятельности в головном мозге и его отдельных структур уже давно является областью интенсивного изучения в области неврологии. Возможно, некоторые из самых ранних успешных подходов, используемых для решения этого вопроса были прямыми физиологическое измерение изменения в электрической активности - однако альтернативные методы, которые позволяют жить визуализации изменений напряжения, рН или кальция концентрации (как прокси-сервер для деятельности) привели дополнительные возможности для изучение нейронной активности 1. Методы визуализации выполнять широкий спектр преимуществ, таких как снижение инвазивности и способности контролировать деятельность в целом структур головного мозга. Кроме того, в животных с послушными генетики в том числе плодовой мушки дрозофилы, развитие генетически кодируемых показателей кальция, таких как Cameleon, GCaMPs и других 1 позволили исследователям следить одиночные нейроны, нейронные популяции и весь мозгструктуры. В то время как более традиционные люминесцентные методы визуализации кальция с помощью GCaMPs (GFP, слитый с кальмодулина) или беспокоиться (CFP и YFP, слитый с кальмодулина) оказались полезные методы, обеспечивающие хорошее пространственное и временное разрешение, основной процесс светового возбуждения порождает некоторые ограничения на его экспериментальное Приложения. Из-за природы света возбуждения, флуоресценции, фото-отбеливания, и фототоксичности неизбежно производимого, которые, следовательно, ограничивает глубину структур, которые могут быть отображаемого, продолжительность записи, а также непрерывность реального времени записи. Другими словами, записи, часто должна быть выполнена с перерывами, чтобы избежать этих нежелательных побочных эффектов.
Из-за этих проблем, были разработаны дополнительные альтернативные методы визуализации кальция. Одним из наиболее перспективных методов биолюминесцентного изображений, которая опирается на свете получаемой посредством ферментативной реакции после связывания кальция. Bioluminescenт изображения не требует света возбуждения и, следовательно, не испытывает те же трудности, как и обычные изображения кальция. Биолюминесцентного репортера акворина - изолирован от Aequorea Виктория, то же самое, из которого медузы GFP был также isolated- связывает кальций помощью трех ручных EF структур и проходит конформационное изменение, что приводит к окислению его кофактора коэлентеразином и выхода синего света (λ = 469 нм) 2,3. Акворина имеет очень низкое сродство к кальцию (K D = 10 мкм), что делает его идеальным для мониторинга переходных кальция, поскольку он производит очень мало шума и фонового не мешает системе буферизации внутриклеточного кальция 4. Хотя экворин ранее использовался для наблюдения за процессом индукции нервной в Xenopus яйца 5 свет производится слишком тусклый, чтобы использовать для реального времени визуализации нейронной активности. В целях решения этой проблемы, Филиппа Br &# 251; пусть и коллеги в Институте Пастера создали генетическую конструкцию слияния GFP и экворин гены, имитируя естественное состояние в 4 медуз. Этот ген слитого продукта связывает кальций снова с помощью трех ручных EF структур акворина, которые претерпевает конформационное изменение, ведущий к окислению коэлентеразином, который передает энергию без радиационно к GFP. Эта передача энергии приводит к высвобождению зеленого света (λ = 509 нм) с GFP, а не синим светом от акворина. Слияние GFP и акворина также придает большую стабильность белка помогает слитого белка производят свет от 19 до 65 раз ярче, чем в одиночку экворин 4. Использование биолюминесцентного подход в головном мозге расширяется текущее экспериментальное использование визуализации кальция как с точки зрения длительности непрерывной записи и количества структур в головном мозге, которые могут быть записаны. В широком смысле в контексте предыдущей работы это означает, что как глобальные и большееРазнообразие регионализации "деятельности" мозга могут контролироваться (через прокси-сервер переходных кальция). Что еще более важно деятельность может контролироваться дольше, в режиме реального времени и постоянной основе, которые легко поддается погоне за полного понимания базисной функции в головном мозге.
В последние несколько лет, наша лаборатория и другие разработали трансгенных мух, выражающие GFP-экворин под контролем двоичной системе экспрессии (GAL4 / UAS-GFP-экворин) 5,6. Мы использовали GFP-экворин биолюминесценции для записи активности при естественных раздражителей, таких как запах 7,8, а также изученных клеточных компонентов, модулирующих Ca 2+-активности в грибных тел следующих рецептора ацетилхолина стимуляции прямой никотиновой применения 9. Кроме того, мы также использовали GFP-экворин решить ряд экспериментальных вопросов, которые не смогли быть рассмотрены ранее, как долгосрочныеизображения спонтанных переходных кальция и визуализации глубоких структур головного мозга 10. Совсем недавно мы использовали систему / UAS GAL4 выразить млекопитающих рецептор АТФ Р2Х 2 11 катион канала, в проекционных нейронов (ПНС) и использовать систему Lexa, чтобы выразить GFP-экворин в грибных тел (MB247-Lexa, 13XLexAop2-ИВС-G5A-ВР) (любезность Б. Пфайффер, Janelia Farm, США). Это позволило нам активизировать ПН применением СПС, в свою очередь, активирует грибные тела (вниз по течению целевых ПНС), имитируя более естественные условия, такие как ответ на запах раздражитель. В целом этот метод объединения Р2Х 2 и GFP-экворин расширяет экспериментальные возможности. В широком смысле это дает возможность лучше понять закономерности деятельности мозга, инициируя новые исследования о том, как различные стимулы и возмущения могут изменять базальную паттерна активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение образцов
- Приготовление растворов и настроить
- Поддерживать все дрозофилы линии на 24 ° C по стандартной пищевой среде. Задняя и держать их при низкой плотности во флаконе для генерации стандартизированного размера и веса мух.
- Добавьте 10 девственных самок с 10 мужчин в пробирке, пусть спариваться и передавать их через каждые 2 дня на свежем флакон. Затем 10 дней спустя, когда мухи начинают eclose, урожай мух каждый день. Держите точный учет возраста мух и держать их в хорошем состоянии.
- В 3-й день, отделить самцов от самок и держать самок мух за 20 флакона. Запишите мух на 4 или 5 дней от роду.
- Готовят раствор Рингера с следующих концентрациях: 130 мм NaCl, 5 мМ КСl, 2 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES и 36 мМ сахарозы и регулировать рН раствора, чтобы точно 7,3. Подготовка перфузии решения 25 ц; М никотина и 100 мМ KCl в растворе Рингера.
- Подготовьте 1000 мкл пипетки: с помощью кончика лезвия форма для бритвы уклоном (примерно 35 ° от конца наконечника) и снимите излишки базу за 1 ½ см от кончика.
- Подготовьте коробку для хранения (23 см х 17 см х 8,5 см) образца во время инкубации. Поместите два губки (12 см х 8 см х 3 см) насыщенных водой в низ [для предотвращения высыхания образец] ниже небольшую стойку аппарата разместить образцы на их получение завершено.
- Подготовка образцов мух, так что они содержат, по меньшей мере 1 экземпляр УАС-GFP-акворина и один экземпляр строки Gal4 ездить выражение GFP-акворина. OK107 Gal4 линия (линия выражение вождения в первую очередь в грибных тел) пересекается с UAS-GFP-акворина в этой подготовке.
Примечание: Внутри коробки должно быть водонепроницаемым и снаружи должны блокировать свет от входа окно для предотвращения деградации коэлентеразином во время инкубации.
- Поддерживать все дрозофилы линии на 24 ° C по стандартной пищевой среде. Задняя и держать их при низкой плотности во флаконе для генерации стандартизированного размера и веса мух.
- Приготовительныйтовка образцов
- Лед обезболить дрозофилы путем передачи его в стеклянном флаконе и держать на льду в течение 2 мин, после чего переехал в охлажденной чашке Петри для размещения на кончике пипетки. Подготовка наконечники на слегка смоченной фильтровальной бумаги в 100 мл чашке Петри на льду под микроскопом рассечение.
- Аккуратно пинцетом месте летать внутри пипетки.
- Используя щетку осторожно нажмите и выровнять муху, так что головка полностью за край наконечника и область дорсальной частично подвергается секцией удалены во наконечника формирования (Фигура 2В).
- Комбинат небольшие (примерно 3-4 мкл) части двух компонентов зубной клея. Нанесите клей тщательно вокруг передней и задней головы и шеи до и вокруг пипетки наконечник краю - избежать темя. Пусть клей сохнуть в течение 2 мин.
- Место пипетки с клееного лету через отверстия в записи камеры (рис 2D) и генTLY нажмите чтобы обеспечить на месте.
- Объедините две компоненты клея кремния (примерно 3-4 мкл). Нанесите клей на плоской стороне камеры вдоль края, где камера и пипетки встречаются, чтобы предотвратить утечку раствора Рингера. Пусть клей сохнуть в течение 2 мин.
- Рассечение
- Прикрепите ленты на перфузии канала, коротким краем и распространяется на задней части камеры.
- Поместите камеру с лету на рассечение блока под микроскопом свою очередь на люминесцентной лампе. Внесите 1 мл раствора Рингера в камеру.
- Используйте тонкую хирургическую нож, чтобы удалить кутикулу. Сделайте надрезы параллельно от задней части головы до усиков регионе. Затем разрезать вдоль края глаза затем сделать надрез перпендикулярно над антенной, соединяющей предыдущие разрезы. Сделать окончательный разрез параллельно, что в задней части головы. Используйте мелкие острые щипцы для удаления кутикулы (рис 2С).
- Используйте мелкие острые щипцы осторожно схватитьD убрать подвергается дыхания ткани, пока мозг и [флуоресцирующий] тела гриба не четко визуализируется.
- Используйте ультра-острые щипцы тщательно понять и щепотку нейроэпителиальных ткани, покрывающей мозг, чтобы позволить проникновение в коэлентеразина.
Примечание: В качестве альтернативы папаин можно использовать для проницаемыми нейроэпителия 9. - С помощью пипетки, вымыть два раза с раствором Рингера для удаления любого мусора от вскрытия и место образца в темный ящик.
- Внесите 1 мл раствора Рингера, содержащего 5 мкМ бензил-коэлентеразин в камеру. Закройте окно и позволить инкубации с коэлентеразином при комнатной температуре в течение как минимум 2 ч.
2. изображений
- Настроить
- Начните системы записи: включить микроскоп, компьютер, фотоаппарат и дренажной системы и установленного комнате экологического контроля до 25 ° C.
- Открыть Измерение и программа Automation Explorer на компьютере. Нажмите на “ Устройства и интерфейсы ", а затем дважды нажмите на" NI Motion Devices "и, наконец, щелкните правой кнопкой на" PCI-7334 "и выберите" инициализации устройства ".
- Откройте Photon Imager. Создать новую папку и имя первого файла записи. Камера должна достичь -80 ° С перед система будет функционировать.
- Настройка перфузии система - добавить KCl, никотин, и раствор Рингера для водоемов и регулировать таким образом, каждое решение разрядов в 2 мл / мин. Промыть раствором Рингера до начала эксперимента.
- Подготовка образца
- Место установки блока формирования изображения на блюдо горе под микроскопом на увеличении 5X и вставьте перфузии трубки в канал через прокол.
- Установите микроскоп флуоресцентный режим, то центр и принести грибные тела (MBS) в центре внимания. Отрегулируйте 20X и повторного-центра и фокуса.
- Позиция дренажное устройство дренажной над бассейном, отрегулируйте высоту дренажного шунта так, чтобы кончик просто Абове бассейн, и запустить раствор Рингера для 30 сек, чтобы обеспечить достаточный дренаж.
- Потяните вниз щит для герметизации аппарата от света. Использование автоматизированной системы в фотонной тепловизора точной регулировки фокуса и принять ссылка флуоресцентное изображение МБ.
- Запись
- Регулировка скорости фотонов на необходимую скорость записи (от 50 мс до 1 сек или более). Выберите режим фотонов и открытый затвор. Запись генотип, пол, возраст и номер образца в записи журнала. Отрегулируйте положение коробки ROI более чашечки и клеточных тел (CCB) и медиальной долей нажав на коробках ROI и перетащив удерживая контроль.
- Запись базовой около 5 до 10 мин (по желанию).
- Применить никотина в течение 1 мин. Примечание запустить / остановить в журнале. Промыть раствором Рингера в течение 5 мин.
- Подождите 5 минут для восстановления и подготовки KCl запись журнала и таймер.
- Применить KCl в течение 1 мин. Примечание запустить / остановить в журнале. Промыть раствором Рингера в течение 1 мин.
- Переключательфлуоресцентного режиме, принять окончательное флуоресцентное изображение и выключите раствор Рингера.
- Нажмите "Остановить". Диалоговое окно попросит выключить систему. Выберите "Нет", чтобы продолжить запись.
- Открыть щит, дренажная система шаг, переключатель линзовый объектив с 5-кратным, удалить перфузии трубку. Удалить образец / записи блюдо из стадии очистки от 20X объектив, промывки и протирки линз в два раза водой.
- Нажмите белую кнопку воспроизведения в верхней части окна программы, чтобы начать следующий запись.
3. Анализ и видео Создание
- Извлечение значения фотонов
- Откройте программу анализа фотонов (например, Фотон просмотра) и открыть файл электронной таблицы первый образец.
- Выберите вкладку управления дисплеем. Выберите ROI, нажав на области, удерживая контроль. Отрегулируйте размер, ориентацию и форму регионах, представляющих интерес, чтобы охватить GFP подсветкой CCB и медиальной долей.
- Добавить добавлениеаль ROI, нажав "Определить рентабельность инвестиций" и перетаскивая на экране, чтобы создать новую ROI.
- Выберите вкладку "Кино", чтобы играть фотонов видео. Отрегулируйте ширину "сек" и "шаги ТРЦ" по желанию. Отрегулируйте расположение ROI по мере необходимости.
- Выберите представительства скриншоты GFP флуоресценции, никотина и ответ KCl ответ. Земледелие скриншоты и паста изображения в презентации слайд для последующего анализа и сравнения.
- Отрегулируйте как "ширина сек" и "сек шаг" к скорости записи в секундах. Выберите длину анализа, перемещая серые маркеры на верхней панели, чтобы кронштейн регионе до начала стимула и сразу после окончания реакции.
- Выберите "Приостановить Просмотры играя" нажмите "<< REW" и нажмите "PLAY>". Выберите вкладку "Граф Оценить Chart" и отрегулируйте единиц по желанию и цвета линии в соответствии с цветом ROI.
- Когда анализ завершенНажмите "Экспорт граф скорость передачи данных". Выберите скриншоты комбинированного звукозаписей CCB и медиальной доли интересующей области от каждой стороны. Земледелие скриншоты и паста изображения в слайд с изображением реагирования. Этот слайд будет позже использоваться в конечном счете.
- Пример Анализ: один метод анализа извлеченных данных фотонов подробно
- Откройте файлы электронных таблиц в "скорость счета экспорт" папку.
- Переформатировать ячеек первого столбца помечены время, чтобы показать время в час и минут.
- Ссылки на соответствующий слайд для образца. Удалить все значения, кроме колонн на время и два представительства РИ.
- Определить никотина стимуляции время начала - доступны в файле журнала входа в главный папке- удалить дополнительные данные до начала или выделить значение.
- Найти высокий / пиковое значение для обоих CCB и медиальной доли и марки / подсветки.
- Определить начало отклика и время окончания иБКК и медиальная лопасть, создавая оценку, используя временную точку из соответствующих графике ответа на слайде и выберите фактическое значение по изменению значений в близости к этим пунктам. Выделите область между этими точками как в БКК и средних долях. В качестве альтернативы, используйте макрос 9.
- Смешайте все образцы одной экспериментальной группе на новую электронную таблицу.
- Выравнивание на пике путем определения значения строка для каждой пикового значения CCB. Вычтите более низкие значения от самого высокого значения строки, чтобы определить приблизительное значение строки, где что выборочные данные должны быть переписано в. Убедитесь, что все пиковые значения выравниваются.
- Скопируйте лист два раза и удалить либо медиальной колонки лепестков или CCB столбцы создание страницы только CCB или медиальных значений лепестков.
- Удалить данные после все ответы CCB закончились. Создать четыре строки помечены Всего Фотоны, длина ответа (длительность), максимальная амплитуда и реагирования Latency. Скопируйте и вставьте этот раз ниже оригинала.
- Используйте функцию СУММ для определения общих фотоны во ответ. Используйте функцию COUNT для определения длины ответа. Скопируйте и связать высокую стоимость ячейки для определения пикового значения амплитуды. Использование функции COUNT - выбрать из начала перфузии никотина до начала реакции - для определения реакции задержки.
- Копирование значения с помощью функции связывания и размножаться (все, кроме пиковой амплитуды) по скорости записи в секундах.
- Бар / коробка графики могут быть созданы для расчетных параметров, таких как фотоны, Всего пиковой амплитуды и длины реагирования, при желании (напр .: рис 5B, C, D).
- В столбце после сырого ответ фотонов данные, в среднем сырые баллы данных для каждого момента времени с использованием функции усреднения. При желании следовать с колонки, определяющего стандартную ошибку среднего (SEM), для каждого из усредненных значений фотонов в момент времени.
- Используйте среднюю колонку построить среднюю Profil ответе [График] для образца БКК группы. Для этого выберите столбец с указанием времени, как значения по оси Х и колонки средних значений фотонов как у оси и, наконец, выберите инструмент создания графа рассеивания.
- Повторите эту процедуру анализа с данными медиальных лепестков.
- Создание изображений для видео
- Открыть для просмотра фотонов.
- Выберите вкладку управления дисплеем. Нажмите на ROI, удерживая контроль, чтобы выбрать, удалить и / или минимизации его.
- Измените ширину ", ТРЦ" (время накопления), а требуется определить содержание каждого кадра.
- Изменить "сек шаг", чтобы определить перекрытие каждого кадра.
- Выберите "вид экспорта, играя" нажмите кнопку "<< REW", затем "PLAY>". Изображения для видео будет экспортироваться в папку "вид экспорта" в серии .png файлов.
- Использование Virtual Dub, чтобы видео: один метод для видео Создание подробная
- Создайте новую папку с именем "Обменяй свои PlayMoney" в папке, содержащей вид экспорта изображения.
- Принесите сценарий (renommer.VBS) в папке изображений.
- Двойной щелчок по renommer.VBS бежать.
- Изображения будут автоматически переименована численно и скопировать в папку "Обменяй свои PlayMoney".
- Открыть virtualdub.exe.
- Выберите открытый видео файл - выберите первое изображение (последующие изображения будут автоматически загружать).
- Выберите видео - выберите частоту кадров отрегулировать по желанию.
- Выберите видео - выберите сжатия выберите Cinepak Codec радиусом.
- В файле выберите Сохранить как AVI видео будет создана автоматически.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Слияние GFP в акворина позволяет визуализировать нашу область интереса до биолюминесценции визуализации с помощью возбуждения GFP в люминесцентной режиме на микроскопе (3А, 4А, 6А, 6E). Один из самых простых способов, чтобы стимулировать грибовидные тела через активизацией ионотропных никотиновых рецепторов ацетилхолина. Хотя ацетилхолин эндогенным лигандом этого рецептора мы обнаружили, что никотин производит более воспроизводимые реакции в грибных тел. Это отчасти потому, что они специально выразить никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, и, таким образом, используя никотин можно избежать активации мускариновых ацетилхолиновых рецепторов, выраженных в другом месте в головном мозге. Кроме того, никотин является более стабильным, чем ацетилхолина, и таким образом позволяет лучше и надежный контроль стимула. Типичный ответ начинается с быстрого активации обоих чашечки, клетки-органов (CCB) и медиальной долей (ML) (рисунок 4А при меченого изображения). Обычно ответ БКК длится дольше и имеет больший биолюминесцентного ответ, чем лепестков, как показано на последовательных панелей ответ (3С-Н). 4В показывает накопление 10 сек фотонов, зарегистрированных на временном разрешении 100 мс (10 Гц) во время пика в ответ на 1 мин перфузии 25 мкМ никотина. После вымывания и восстановительного периода 10 мин второй стимуляция 1 мин перфузии 100 мМ KCl инициируется (рис 4C, Е), что позволяет нам подтвердить жизнеспособность нашей выборке. Количественные ответы могут быть проанализированы путем выбора ROI во время анализа в зрителя фотонов. Запуск анализа в зрителя фотонов производит как графики, показывающие количество фотонов, испускаемых в выбранной ROI в течение долгого времени (рис 4D и E), а также для экспорта таблиц этих значений. Рисунок 4D является exampле графиков производства фотонов зрителя заговоре фотоны, испускаемые в ROI 2 [Зеленый] (справа) и CCB ROI 4 [Синий] (правая медиальная лепестков). Аналогичные данные для ответа KCl, представленной на рис. 4E В экспортируемые данные могут быть использованы для восстановления кривую отклика (фиг.5А), а также для извлечения дополнительных данных о различных параметрах, таких как продолжительность, пиковой амплитуды и общей реакции (5В-D). Недавно с помощью системы GAL4-UAS и Lexa мы разработали метод выявлении более естественную реакцию. Вкратце, АТФ-зависимых Р2Х 2 катион канала выражается в проекционных нейронов (ПНС) и GFP-экворин (ГА) выражается в грибных тел - мишени ПНС; это позволяет нам селективно возбуждать ПНС, хотя применение АТФ, которые могут, в свою очередь, производят ответ в грибовидных тел (Рисунок 6).
Рисунок 1. Характеристика БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ Репортеры (GFP-экворин). (А) Схема GFP и гена экворин слияния с верхнего последовательности активации. (Б) Модель синего излучения света на экворин в ответ на высокие уровни Ca 2+. (С) Модель зеленого светового излучения по GFP-акворина в ответ на высокие уровни Ca 2+. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Экспериментальная установка. (A) Fly расположен в пипетки чаевые. (Б) иллюстрация адекватного метода склеивания стабилизации голову и герметизации область между корпусом и летучей пипетки наконечник. (С) Схема вскрытия, чтобы открыть головную капсулу. (D), 1 мл камера о проведении блок с перфузии трубку, вставленную. Всего размеры камеры: длина: 7,4 см, ширина: 2,7 см, высота: 0,55 см. Внутренние размеры камеры: длина: 1,7 см, ширина: 1,4 см, высота: 0,35 см, а радиус камеры отверстие: 0,1 см. (Е) Посмотреть летучей голову, показывая GFP-положительных сигнал в МБ: низкая тусклый свет с флуоресценции, полученного из OK107 приводом GFP-акворина после удаления кутикулы. (F), микроскоп с фотонной камеры и системы перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель ответ на 25 мкМ никотина в грибных тел. (А) Люминесцентная образGFP-экворин выражение в грибов органов в GA2 / +; OK107 / + управление муха мозга (шкала бар = 50 мкм). (Б) Пик биолюминесцентное ответ в грибовидных тел. (С) до стимуляции. (D) Начало ответа. (Е) максимальной чувствительностью. (F) Продолжение ответа CCB. (G) Падение БКК ответ. (Н) Конец ответа (ВН: шкала бар = 33 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель анализ записи образца (А) флуоресцентное изображение гриба тела GA2 / +;. OK107 / + управление летать с четырьмя выбран в течение CCB и медиальной долей (масштаб ба ROI вR = 50 мкм). (В) накопление 10 сек биолюминесцентной ответ на 25 мкМ никотина - ответ фотонов записанной на 100 мс. (С) накопления 10 сек биолюминесцентного ответ на 100 мМ KCl записан в 100 мс. (D) График зарегистрированное число фотонов, испускаемых при никотиновой ответ в исследуемой зоны 2 и 4, охватывающих правильный CCB и средних долях соответственно. (Е) График зарегистрированное число фотонов, испускаемых при KCl ответ в исследуемой зоны 2 и 4 охватывает правильные CCB и медиальной долей, соответственно. В д и е, слева Y-оси соответствует общему числу фотонов в пределах всей области зрения, в то время как правая ось ординат соответствует фотонов внутри ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Представитель параметры анализ записи образца представитель Excel анализ биолюминесценции ответ на никотиновой активации грибной тела в GA2 / +;. OK107 / + управление лету. (А) Фотон ответ в течение долгого времени в БКК и средних долях. (Б) Продолжительность реакций в БКК и средних долях. (С) Наибольшее значение фотона (максимальная амплитуда) в течение ответ в БКК и средних долях. (D) Всего фотоны в пределах CCB и средних долях всего ответ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Два разных ответ в грибовидных тел после стимуляции ПН Четух АТФ и Р2Х 2. Образец 1 муха выражения Р2Х 2 в ПН и GFP-акворина в грибных тел (GH146 / +; Р2Х 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-ИВС-G5A-ВР (объявления) (А) флуоресцентное изображение грибных тел с ROI в (масштабе. бар = 50 мкм). (Б) Биолюминесцентный образ пикового ответ в грибовидных тел после активации ПНС по P2X 2 стимулированных 500 мкМ АТФ, наблюдаемых в основном в средних долях. (С) Биолюминесцентный образ пика ответ KCl. (D ) Время Конечно испускания фотона в регионах ROI, в течение ответ Образец 2 муха выражения Р2Х 2 в ПН и GFP-акворина в грибных тел (GH146 / +;. Р2Х 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-ИВС-G5A-ВР (а ). (Е) флуоресцентное изображение с (масштаб бар ROI в 50 мкм =). (F) Биолюминесцентный образ индуцированного ответ в грибовидных тел послеctivation ПНС по P2X 2 стимулировали с 1 мМ АТФ, в обеих долях и CCB. (G), Биолюминесцентный образ пика ответ KCl. (Н) Время курс испускания фотона в регионах ROI, на протяжении ответ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Недавно разработанный биолюминесцентного основе GFP-экворин Представленный здесь подход позволяет в естественных условиях функциональной записи Ca 2+-активности в различных нейронов, а также, при желании, в другой вид клеток, таких как почки звездчатых клеток, как сообщается в Кабреро др. 2013 5.
Изменения, устранения неисправностей, дополнительные компоненты, и критические шаги
Дрозофилы Животноводство
GFP-экворин трансген (pG5A) 4 была вставлена в вектор pUAST для создания независимых трансформантов три линии 6. Все линии были испытаны на их биолюминесценции, и все они были способны реагировать на в естественных условиях Са 2+-активности 6. Однако более поздние эксперименты указали, что GA2 линия вставляется в третьем хромосомы порождает более четкого сигнала, чем GA1 линии, вставленной Oн второй хромосомы. Здесь представительные результаты были получены с помощью UAS-GA2 скрещенные с МБ-специфической линии OK107. Кроме того, в последнее время Б. Пфайффер породило GFP-экворин конструкцию помещается под контролем регуляторного элемента 20XUAS (20X-G5A-2) и эта конструкция была утверждена в нашей лаборатории. Вкратце, это дает очень сильный сигнал, сильнее, чем наши стандартные GA2, которые, следовательно, должны быть более эффективным и полезным для дальнейшего мониторинга Ca 2+-активности в глубоких структурах мозга, таких как эллипсоида тела. Кроме того, он также может быть полезен для визуализации малых количеств нейронов или аксонов в синаптических контактов ().
Препараты для визуализации
Несмотря на то, муха должна быть льда анестезии во время позиционирования и склеивания, важно свести к минимуму время на льду. Мухи должны быть переданы в стеклянную пробирку и выдерживают на льду в течение 2 мин, а затем перемещается к охлажденному чашке Петридля размещения на кончике пипетки. Мы заметили, что длительного периода времени анестезии снижает жизнеспособность образца и может ослаблять реакцию. Оптимально, мы сохраняем время льда анестезии ниже 5-10 мин.
Обмотка и склеивание критические шаги. Это имеет решающее значение для обеспечения полетов голову на место для вскрытия и обработки изображений, а также для предотвращения утечки раствора Рингера в кончике пипетки и / или из записи камеры. Стоматологический клей (и, в меньшей степени, кремний клей) станет липкой и впоследствии начинают сушить, как только двух компонентов. Поэтому очень важно, чтобы применить клей оперативно, чтобы избежать склеивания и слабый комков клея. В некоторых случаях мы заметили, что альтернативные варианты ленты и клея, при контакте с раствором Рингера, может освободить загрязнители в растворе Рингера, которые могут повлиять на муху и свой ответ, в частности, так и для экспериментов, посвященный тон изучению обонятельной системы, используя различные запахи. Следовательно, будьте осторожны здесь, если подставляя материалов (см материалы для конкретных сортов, которые мы используем).
Несколько различных форм коэлентеразином были разработаны для того, чтобы оптимизировать ее активности, такие как скорость испускания света, Ca 2+ -affinity (чувствительность) или интенсивности светового излучения 12. Например, родной коэлентеразин является более стабильным, таким образом, больше подходит долгосрочного изображений в несколько часов, в то время как бензил-коэлентеразин (также названный Н-коэлентеразин) приводит к более быстрой и более высокой эмиссии света с коротким периодом полувыведения. Для получения дополнительной информации о различных формах коэлентеразина, посетите веб-адрес в список материалов.
Изображений
Биолюминесценции сигналы могут контролироваться с электронный умножитель CCD камеры (EM-CCD, охлаждают до -80 ºC), установленного на микроскопе. Эта установка должна бе расположен внутри герметичного темный ящик, чтобы избежать нежелательного (окружающей среды) загрязнение света. Установка описана в этой рукописи использует 20X погружением объектива, позволяющий поле зрения 400 х 400 мкм (512 х 512 пикселей). Для улучшения отношения сигнал-шум, данные были получены с временем интегрирования 0,100 сек (10 Гц), и был использован 2 х 2 бининг (1 пиксель = 1,2 х 1,2 мкм). Для получения и хранения данных, каждый зарегистрированный фотон был назначен х, у-координаты и время точка. Между 500 и 600 нм длины волны, ЭМ-ПЗС-камеры (см точное описание в список материалов) имеет квантовую эффективность 96%.
Один из наиболее важных параметров для функциональной визуализации мозга в естественных условиях является временное разрешение. До сих пор большинство флуоресценции на основе Са 2+ -imaging техники, таких как GCaMP и Cameleon обеспечивает временное разрешение приблизительно 4 Гц (250 мсек / кадр). В последнее время с биолюминесценции на основе GFP-акворина мы смогли Раисе время приобретение до 100 мс / кадр с EMCCD камерой и даже до 120 кадров / сек (8,3 мс / кадр) с ICDD камеры электронного умножителя 10. В этом временном разрешении приближается к электрофизиологических методов (в диапазоне от около 1 мс). В то время как высокая временное разрешение и информативным и решающее значение для исследований, посвященных синаптической передачи и стимула индуцируется деятельности, продлен еще медленнее важно Ca 2+ -kinetics также происходит в течение нейронов, например Са 2+ освобождение от внутриклеточных Са 2+ -stores (обзор: Берридж др, 2003 13).. Для этого последнего типа, медленнее временное разрешение еще приемлемо, а наоборот, они обычно требуют лучше Са 2+ -affinity от датчика для обнаружения. Это требование было достигнуто с GFP-экворин обнаружить освобождения внутриклеточных Са 2+ -stores на аксона обонятельной ReceptORS нейроны 7,8. Кроме того, в зависимости от желаемых условий эксперимента, медленнее время захвата можно использовать. Например, в длинной O / N записей, мы использовали интеграции 2 сек раз из-за большого количества точек данных, собранных (Minocci и др., 2013). Вкратце, один практический функция с биолюминесценции в том, что временное разрешение можно легко регулировать в зависимости от желаемых условий эксперимента.
Альтернативные камеры (настройки мухи) были разработаны для облегчения задачи эксперимента. Например, для исследования на основе натурального запаха стимул, антенна должна быть свободна, поэтому подобный подход, разработанному А. Фиала 14 лучше всего подходит (мы использовали аналогичный подход для Murmu и др. 2010). Вкратце, в этом подходе, муха привязаны (приклеены) на minutien штифта на шее, который приклеен к пластиковой крышке, содержащей скольжения небольшое отверстие. Уплотнение создаетсявокруг верхней части головы на лету. После этого падение звонка осаждается на голове, а голова капсула расчленены. Таким образом, антенны были свободными и доступны ощутить запахи. Точно так же, для длительного записи, а O / N или даже пару дней 10 муха должно быть сохранено как свободный принуждения, как это возможно, а в некоторых случаях подается (например: с капиллярной бумаги, смоченной в 5% глюкозы в решение). В этих условиях подход Фиала является также более подходящим, чем подход в синем наконечнике пипетки (метод подводное плавание).
Все приложения наркотиков может управляться извне с помощью 6-путь мульти клапаны тяжести перфузии системы. Поток можно регулировать с помощью регуляторов объемные перфузии откалиброван до каждой сессии записи для потока 2 мл / мин. Устройство извлекает Дренаж жидкости со скоростью 2 мл / мин из камеры записи с помощью перистальтического насоса, позволяющего непрерывный поток.
Внекоторые условия, из-за дорогой стоимости препарата и / или количества лекарственного средства, чтобы использовать, хотелось бы применять только в небольших количествах соединений. Таким образом, необходимо, чтобы непосредственно применять его в ванну, а не через систему перфузии. В этом случае затвор должен быть закрыт во время этого процесса, чтобы избежать светового загрязнения.
Методы анализа
Графы в секунду или счет в секунду в координата оба были использованы в нашей группе для анализа. Графы в секунду, возможно, лучше всего подходит для ярких ответов в целом, тогда как структуры отсчетов в сек и за координат (которая представляет собой нормализацию ответов на размер рентабельности) лучше всего подходит для точной и малых популяциях клеток. Оба из них могут быть легко выбраны в программном обеспечении анализа.
Одним из основных преимуществ использования подхода биолюминесценции является способом, которым приобретаются и хранятся данные (X, Y, т параметрыкаждый испускаемых фотонов). В самом деле, в то время как любые другие методы визуализации используются стандартный режим, как приобретенного полного изображения (как правило, в формате TIFF), с помощью этой системы, мы приобретает только актуальную и значительный сигнал за счет сохранения только координаты пикселя, которые были активированы света во время предварительно фиксированной длительности времени (что соответствует времени накопления или временным разрешением). Следовательно, хранение данных на самом деле "свет" по сравнению с хранением полного изображения, а следовательно, делает его легче анализировать данные. Для анализа данных, мы используем соответствующее программное обеспечение (фотон просмотра), которая позволяет устанавливать время накопления по желанию. Тогда отображение изображения сигналов можно регулировать по желанию в цель убедительно представить данные. Параллельно результаты количественно одновременно разрешением, чем их время сбора.
Значение и биологические приложения биолюминесценции изображений
Как уже упоминалось выше биолюминесценции визуализации кальция предлагает три основных преимущества для методов визуализации люминесцентные кальция: (1) более глубокое участки мозга могут быть отображены, (2) изображения может произойти непрерывно в течение более длительные, как несколько часов, как O / N и даже в некоторых случаях до двух дней, и (3) в последнее время, с более высоким временным разрешением, до 120 кадров / сек (8,3 мс). Основным ограничением биолюминесцентной подхода связано с его несовместимости с конфокальной освещения, которые, следовательно, не позволяет нам определить точное глубину (Z-плана) активированных структур или нейронов.
Первое преимущество биолюминесценции визуализации, визуализации глубоких областей мозга, ранее продемонстрирована в 2007 году визуализации в индуцированной ответ кальция высокой калия внутри эллипсоида тела (EB), глубокая структура находится в середине мозга, без предварительного электрофизиологические или функциональные отчеты 6 Ca 2+-активности в EB после нанесения пикротоксина (блокатора ГАМК А -рецепторов) демонстрируя, что ГАМКергические кольцевые нейроны EB действительно ингибирующие нейроны (описано в :. Пеленки и др статьи представлены).
Второе преимущество, больше и непрерывное время записи, было использовано в ряде исследований от нашей лаборатории. Запах стимуляции был использован для изучения активности нейронов головного мозга в предыдущих исследованиях 11,15,16. Использование более длительный срок визуализации, однако, наша лаборатория была в состоянии показать ранее не сообщалось изменения в кинетике в обонятельных нейронов рецепторов к запахам. В первом исследовании с помощью Murmu и др. (2010) показали, что в то время короткого запах раздражители (1-3 сек) выставлены аналогичные кинетику и умеренную разницу в амплитуде, больший запах раздражитель (5 сек) вызвало гораздо большую амплитуду, а также изменить в кинетики / структурыЮр ответа, который был отнести к внутриклеточных депо кальция. Последующее исследование показало, что в то время как 5 последовательного применения импульсов запаха 1 сек при 5-минутными интервалами не меняют кальциевый ответ, увеличивая длину стимула до 5 сек привело к прогрессивному ослаблению реакции, что указывает на процесс адаптации. Кроме того, это адаптация явление представлялось быть инициировано ГАМКергической регулирования ранее выявленных кальция магазинах 8. Важно эти данные также доказывает, что в этом экспериментальном состоянии, GFP-акворина в Са 2+ -sensor может обнаруживать и следить за кальций высвобождается из внутриклеточных Са2 + -stores. Дополнительный уникальное исследование из нашей лаборатории используются биолюминесцентное изображений O / N, чтобы записать базальной (спонтанное) деятельность в целом нейронных и глиальных населения в головном мозге, а также деятельность в грибных тел 10. Эти записи показали удивительную спонтанную активность в муравьяennal механосенсорных и двигатель центр (АГМК) и усиков доли. Кроме того, неожиданным клеток автономной активности в глии происходит в течение всей ночи. В грибной тела исследование выявило как точечный активность и две отличительные пики, один короткий и один длинный которого частота изменилась с 10 лет.
В самом недавнем исследовании в нашей лаборатории, мы использовали биолюминесцентного изображений, чтобы изучить последствия манипулирования молекулами средних сигнализации, вовлеченных в памяти, и как они влияют на реакцию кальция внутри грибных тел 9. В самом деле, хотя и балбес брюква были определены более 30 лет назад, и, как известно, регулирует уровень цАМФ, их эффекты в естественных условиях на клеточных и физиологических механизмов и, в частности на Ca 2+ -ответ по-прежнему остаются в значительной степени неизвестными. С GFP-экворин подхода, мы смогли одновременно записывайте чашечки (дендритные СтруктурES) и сотовые органы, а также аксонов прогнозы на уровне долей, и, таким образом, позволяет нам соотнести уровень и кинетики реакции в различных отсеках этой весьма сложной структурой.
Самое последнее приложение, которое мы развиваем имитирует естественную реакцию через искусственно активирующих нейронных популяций пресинаптических к структуре интересов. Для этого мы выражаем Р2Х 2 рецептор, лиганд закрытого катионов канал, который реагирует на АТФ, в пресинаптической нейрон и выразить GFP-экворин в пост-синаптической нейронов населения. Разделение этих двух элементов в различных нейрональных популяций требует двух отдельных систем экспрессии. С этой целью LexA конструкции, содержащей GFP-экворин был создан. В наших предварительных экспериментах с этой системой мы выразили Р2Х 2 в подгруппе ПНС с помощью Gal4-GH146 с UAS-P2X 2 и GFP-акворина в грибной телаиспользуя линию LexA MB247 сочетании с Lexa-13X-GFP-акворина. Мы успешно записаны ответы кальция в организме гриба с раздражениями 1 мМ АТР с рецепторами Р2Х 2 в ПН (рис 6).
В заключение, биолюминесценции GFP-экворин подход оказался полезным в записи стимул, индуцированный Ca 2+-активности, аналогичный другим Са 2+ -indicators. Но что еще более важно, он также позволяет обнаружить спонтанного Ca 2+-активности в головном мозге. Этот подход открывает возможности для будущих долгосрочных экспериментов и всей визуализации головного мозга, что может увеличить глубину нашего понимания физиологических явлений и закономерностей деятельности в мозгу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
