Summary
ここでは、生物発光レポーターを使用してアプローチを-imaging小説のCa 2+を提示します。このアプローチは、Ca 2+に結合し、励起光の必要性を排除し、光を発する融合構築物のGFPエクオリンを使用しています。重要なことは、この方法は、長い連続撮影、脳深部構造へのアクセス、高時間分解能を可能にします。
Abstract
in vivoイメージングにおける機能は、脳細胞や興味の構造の機能と生理学を研究するための強力なアプローチとなっています。最近、生物発光レポーターGFP-エクオリン（GA）を用いて、-imaging の Ca 2+新しい方法が開発されました。その補因子セレンテラジンを添加した - - 光子コレクタを介して監視することができ、明るい光を発するこの新しい技術は、カルシウムと結合することができる分子を産生する、GFPおよびエクオリン遺伝子の融合に依存しています。 GFP-エクオリン遺伝子を有するトランスジェニック系統は、マウスやショウジョウバエの両方のために生成されている。 ショウジョウバエでは、GFP-エクオリン遺伝子は、脳内の標的発現とイメージングを可能にするGAL4 / UASバイナリ発現系の制御下に置かれています。この方法は、その後に検出することが可能であることが示されている両方のCa 2+内側に-transientsとCa 2+が内部店から-released。最も重要なことは、連続記録でより長い期間を可能にする脳内の大きい深さでのイメージング、および（8.3ミリ秒まで）高時間分解能での記録。ここでは、キノコ体の中にハエの脳内の学習と記憶の中心構造をの Ca 2+ -活性を記録し、分析するために生物発光イメージングを使用するための基本的な方法を提示します。
Introduction
脳とその離散構造内の活動の基本的なパターニングおよび機能は、長い神経科学の分野内の強烈な研究分野となっています。おそらく、この問題に対処するために使用される最も初期の成功のアプローチのいくつかは、電気的活動の変化の直接的な生理学的測定した - への追加機能を持ってきた（活性のためのプロキシとして）電圧、pHまたはカルシウム濃度の変化のライブイメージングを可能にするが、代替の方法は、神経活動1の研究。イメージング技術は、減少侵襲性および全脳構造内のアクティビティを監視する能力などの利点の広い配列を運びます。また果物ショウジョウバエを飛ぶなど、扱いやすい遺伝学と動物では、そのようなカメレオン、GCaMPs、その他1と遺伝的にコードされたカルシウム指標の開発は、研究者は、単一ニューロン、ニューロン集団と脳全体を監視することができました構造。 GCaMPs（GFPはカルモジュリンに融合）またはFRET（CFPとYFPがカルモジュリンに融合された）を使用して、より伝統的な蛍光カルシウムイメージング法は、良好な空間と時間分解能を提供する有用な技術であることが証明されているが、光励起の基本プロセスは、実験的に、いくつかの制約がengendersアプリケーション。光による励起、自家蛍光、光退色、及び光毒性の性質上避けられない結果的に画像化することができる構造の深さ、記録の期間だけでなく、記録のリアルタイムの継続を制限する、製造されています。つまり、録音は、多くの場合、これらの望ましくない副作用を回避するために、断続的に実行する必要があります。
なぜなら、これらの課題の、カルシウムイメージングのさらなる代替的な方法が開発されています。最も有望な方法の一つは、カルシウムが結合した後、酵素反応によって生成される光に依存している生物発光イメージングです。 Bioluminescenトンイメージングは、光励起を必要とせず、その結果、従来のカルシウムイメージングと同じ問題が発生しません。生物発光レポーターイクオリン- オワンクラゲから分離し、λ（、GFPはまたisolated-たのと同じクラゲは、その3 EFハンド構造を経由して、カルシウムを結合し、その補因子セレンテラジンの酸化と青色光の放出をもたらす、構造変化を起こします= 469 nm）の2,3。エクオリンは、それが非常に少ないバックグラウンドノイズを生成し、細胞内カルシウム緩衝系4と干渉しないため、カルシウムトランジェントを監視することが理想的カルシウム（K dを = 10μM）に対して非常に低い親和性を有します。エクオリンは、以前にアフリカツメガエルの卵5の神経誘導の過程をモニターするために使用されてきたが生成された光は、ニューロンの活動のリアルタイムイメージングのために使用するにはあまりに暗いです。この課題、フィリップのBr＆に対処するための努力の中で＃251;てみましょうと、パスツール研究所の同僚はクラゲ4内の天然の状態を模倣する、GFPおよびエクオリン遺伝子を融合遺伝子構築物を作成しました。この融合遺伝子産物は、GFPに非放射エネルギーを転送セレンテラジンの酸化につながる構造変化を起こし、エクオリンの3 EFハンド構造を介して再びカルシウムをバインドします。代わりに、エクオリンからの青色光のGFPからの緑色光（λ= 509 nm）でのリリースでは、このエネルギー移動の結果、。 GFPとエクオリンの融合はまた、単独の4イクオリンよりも19〜65倍明るい融合タンパク質の生産の光を助けるより大きなタンパク質の安定性を付与します。脳内の生物発光のアプローチを使用すると、連続記録の期間および記録することができる脳内の構造体の数の点では両方のカルシウムイメージングの現在の実験のアプリケーションを拡張します。大まか前作の文脈では、両方のグローバルと大きいことを意味します脳の地域化「活性」の様々な（カルシウム過渡応答のプロキシを介して）監視することができます。さらに重要な活動は容易に脳における基底関数の完全な理解の追求に役立つリアルタイムかつ継続的に、より長くのために監視することができます。
ここ数年では、私たちの研究室などがバイナリ発現系の制御下でGFP-エクオリン（GAL4 / UAS-GFP-エクオリン）5,6を発現するトランスジェニックハエを開発しました。私たちは、このような香り7,8と同様に、直接ニコチンアプリケーション9によりアセチルコリン受容体刺激後のキノコ体中のCa 2+ -活性を調節する細胞成分を研究などの自然の刺激によって生産活動を記録するために、GFP-エクオリン生物発光を使用しています。また、我々はまた、長期のような以前に対処することができていない実験的な質問の数に対処するために、GFP-エクオリンを使用していました自発的カルシウムトランジェントと深い脳構造の視覚化10の撮像 。最近では、我々は、投射ニューロン（PNS）で、哺乳類のATP受容体P2X 2 11陽イオンチャネルを発現することがGAL4 / UASシステムを使用し、キノコ体（MB247-のLexA中のGFP-エクオリンを表現するのLexAシステムを使用していました13XLexAop2-IVS-G5A-BP）（B.ファイファー、Janeliaファーム、米国）の礼儀。これは、私たちは、このような匂い刺激に対する応答として、より自然条件を模倣し、今度はキノコ体（PNSの下流の標的）を活性化ATPの適用により手形債権を活性化することができました。全体的にこのP2X 2を組み合わせた技術およびGFP-エクオリンは、実験の可能性を拡張します。広義には、活動の基礎パターニングを変更することができますどのように異なる刺激と摂動についての新しい研究を開始し、より良い脳の活動のパターンを理解する機会を提供しています。
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Protocol
試料の調製
- ソリューションの作成と設定
- 標準の食品媒体に24℃ですべてのキイロショウジョウバエのラインを維持します。ハエの標準化されたサイズと重量を生成するために、バイアルに低密度でそれらを維持し、背面。
- バイアル中の10人の男性と10処女雌を追加し、それらを交尾させ、新鮮なバイアルに2日おきにそれらを転送します。ハエが孵化するために起動したときに続いて10日後に、毎日ハエを収穫。ハエの年齢の正確な記録を維持し、良好な状態で保管してください。
- 3日目に、女性から男性を分離し、女性に1バイアル当たり20ハエを保ちます。 4、5日齢でハエを記録します。
- 以下の濃度でリンゲル液を準備します。130のNaCl、5mMのKCl、2のMgCl 2、2mMのCaCl 2を、5 mMのHEPES、および36mMのスクロースと正確に7.3に溶液のpHを調整します。 25μの灌流溶液を調製します;リンゲル液中のMニコチン及び100mMのKCl。
- 斜めに（先端の端から約35°）をカミソリの刃の形状チップを使用し、先端から1½センチを超えて過剰の塩基を除去：1,000μlのピペットチップを準備します。
- インキュベーション中にサンプルを保存するための箱（23センチメートルX 17センチメートルX 8.5センチメートル）を準備します。置き2のスポンジ（12×8 cmでcmで×3 cm）を、それらの準備が完了するようにサンプルを配置するために小型の装置ラックの下に[サンプル乾燥を防ぐために、ボトムに水で飽和させました。
- これらは、GFP-エクオリンの発現を駆動するために、UAS-GFP-エクオリンとのGal4ラインのコピーの少なくとも1コピーを含むように、ハエのサンプルを準備します。 OK107のGal4ライン（主にキノコ体のライン駆動式）がこの製剤にUAS-GFP-エクオリンと交配されます。
注：ボックスの内側には防水でなければならず、外側はインキュベーション中にセレンテラジンの劣化を防止するために、ボックスに入るの光を遮断しなければなりません。
- 標準の食品媒体に24℃ですべてのキイロショウジョウバエのラインを維持します。ハエの標準化されたサイズと重量を生成するために、バイアルに低密度でそれらを維持し、背面。
- 予備校サンプルのaration
- 氷をガラスバイアルに移すことによって、ショウジョウバエを麻酔し、ピペットチップ内に位置決めするために冷却したペトリ皿に移動される前に、2分間氷上に保ちます。解剖顕微鏡下で氷の上で100ミリリットルのペトリ皿に少し湿らせたろ紙上にピペットチップを準備します。
- 静かに鉗子場所にピペットチップの内側に飛びます。
- そっと押して、頭が先端の端を越え、完全であり、背部が部分的に先端整形（ 図2B）の間に除去部により露出するようにフライを揃えるブラシを使用しました。
- 歯科接着剤の二つの成分の小さい（約3〜4μL）部分を結合します。ピペットチップのエッジにと周りにダウン前面と背面の頭と首の周りに慎重に接着剤を適用します - 頭の冠を回避することができます。 2分間の接着剤が乾燥してみましょう。
- 記録チャンバー（ 図2D）とGENの穴に接着されたフライのある場所ピペットチップTLYの場所に固定するために押します。
- シリコン接着剤（約3〜4マイクロリットル）の2つのコンポーネントが結合します。室とピペットチップは、リンゲル液の漏れを防止するために会う縁に沿って室内の平らな面に接着剤を適用します。 2分間の接着剤が乾燥してみましょう。
- 解剖
- 灌流チャネルを介してテープを貼って、短辺及び室の背面に拡張します。
- 蛍光灯の顕微鏡ターンの下で解剖台のフライと室を置きます。ピペット室へのリンゲル液の1ミリリットル。
- キューティクルを除去するために、細かい手術用メスを使用してください。触角の領域に頭の後ろから並列の切開を行います。その後、前の切開部を接続するアンテナ上の垂直切開を行い、目の縁に沿って切断。頭の後ろのそれへの最終的な切開を平行にしてください。キューティクル（ 図2C）を除去するために細かい鋭いピンセットを使用してください。
- 静かに把握する細かい鋭いピンセットを使用してください脳と[蛍光]キノコ体が明確に可視化されるまで離れて露出した呼吸組織をクリアdは。
- 慎重に把握し、セレンテラジンの浸透を可能にするために脳を覆っている神経上皮組織を挟ま超鋭いピンセットを使用してください。
注：またはパパインneuroepithelia 9を透過するために使用することができます。 - ピペットを用いて、解剖から任意の破片を除去し、暗箱内のサンプルを配置するためにリンゲル溶液で2回洗い流します。
- ピペットでチャンバー内に5μMベンジルセレンテラジンを含むリンゲル液の1ミリリットル。ボックスを閉じて、2時間の最小室温でセレンテラジンとのインキュベーションを可能にします。
2.イメージング
- セットアップ
- システムの記録を開始：25℃に顕微鏡、コンピュータ、カメラや排水システムの電源をオンにし、設定室内環境制御。
- コンピュータで開い計測およびオートメーションエクスプローラプログラム。クリック ＆＃8220;デバイスとインタフェース」、その後をダブルクリックし、「NIモーションデバイス」との最後に右クリックし、「PCI-7334」を選択し ""デバイスを初期化。
- フォトンイメージャを開きます。新しいフォルダを作成し、最初の記録ファイルに名前を付けます。システムが機能するためにカメラを-80℃に到達しなければなりません。
- 灌流システムのセットアップ - のKClを追加し、ニコチン、および貯水池にリンゲル液をインクルードし、各溶液を2 ml /分で放電ように調整。実験を開始する前リンゲル液で洗います。
- サンプルを準備します
- 場所イメージングは5倍の倍率で顕微鏡下でマウント上にブロック皿をマウントし、穿刺を通してチャンネルに灌流チューブを挿入します。
- その後、蛍光モードに顕微鏡を設定し、中心と焦点にキノコ体（MBS）をもたらします。 20Xおよび再中心と焦点を調整します。
- 先端があるように排水プールの上に位置排水装置は、ちょうどabov排水シャントの高さを調整Eのプール、十分な排水を確保するために30秒間リンゲル液を実行します。
- 光から装置を密封するためにシールドをプルダウン。光子イメージャに自動化システムを使用して、フォーカスの微調整を行い、MBの参照蛍光画像を取ります。
- レコーディング
- （1秒以上まで50ミリ秒から）所望の記録速度に光子の速度を調整します。フォトンモードとオープンシャッターを選択します。レコード遺伝子型、性別、年齢、およびログエントリのサンプル数。 ROIボックスをクリックし、コントロールを押しながらドラッグすることで、がくと細胞体（CCB）と内側ローブの上に位置ROIボックスを調整します。
- 約5〜10分間の録音のベースライン（希望として）。
- 1分間のニコチンを適用します。ログに開始/停止に注意してください。 5分間リンゲル液で洗浄します。
- 回復のために5分待ってから、塩化カリウムログエントリとタイマーを準備します。
- 1分間のKClを適用します。ログに開始/停止に注意してください。 1分間のリンゲル液で洗います。
- スイッチ蛍光モードに、最終的な蛍光画像を取り、リンゲル液をオフにします。
- 押し、「停止」。ダイアログボックスには、システムを遮断するように依頼します。記録を継続するために「いいえ」を選択します。
- オープンシールド、灌流チューブを取り外し、5倍に排水システム、スイッチレンズ対物レンズを移動させます。段階からサンプル/記録皿を取り出し、水で2回レンズをすすぐと拭いて20Xレンズをきれいに。
- 次の記録を開始するために、プログラムウィンドウの上部にある白い再生ボタンを押します。
3.分析とビデオの作成
- 光子値を抽出
- 光子解析プログラム（例えば、フォトンビューア）を開き、最初のサンプルのスプレッドシートファイルを開きます。
- 表示制御]タブを選択します。コントロールを押しながら地域をクリックすることでROIを選択します。 GFP照らさCCBと内側ローブを包含するように関心領域の大きさ、向きや形状を調整します。
- さらに追加アルROI「投資収益率の定義」をクリックし、クリックして新しいROIを作成するために、画面上でドラッグすることもできます。
- 光子動画を再生するには「ムービー」タブを選択します。必要に応じて、「秒幅」と「秒のステップ」を調整してください。 ROIの配置は、必要に応じて再調整します。
- GFP蛍光、ニコチン応答とのKCl応答の代表的なスクリーンショットを選択します。後で分析や比較のためのプレゼンテーションのスライドに作物スクリーンショットとペーストイメージ。
- 「秒幅」と秒単位で記録速度を「秒ステップ」の両方を調整します。刺激開始前だけ応答終了後ブラケット領域にトップパネルの灰色のマーカーを移動させることにより、分析の長さを選択します。
- 押して "<< REW」を押して「PLAY>」を「再生しながら景色を一時停止」を選択します。 「レートチャートをカウント」し、必要に応じてユニットを調整し、線の色は、ROIの色に合わせて、タブを選択します。
- 分析が完了すると、押して「エクスポート速度データ」を参照して下さい。組み合わせ録音のCCBと各側面からの関心の中葉領域のスクリーンショットを選択します。応答画像をスライドに作物スクリーンショットとペーストイメージ。このスライドは、後に最終的な分析に使用されます。
- 例分析：詳述抽出光子データの分析のための一つの方法
- 「料金の輸出をカウント」フォルダ内のスプレッドシートファイルを開きます。
- 細胞を時間と分で時間を表示するには、最初の列ラベルの時間を再フォーマットします。
- サンプルに対応するスライドを参照。時間の列と2つの代表的なのROIを除くすべての値を削除します。
- ニコチン刺激開始時刻を決定する - 主にログエントリファイルで使用可能な起動またはハイライト値の前に追加のデータを削除するフォルダ - 。
- CCBと中葉とマーク/ハイライトの両方のための最高/ピーク値を検索します。
- 両方の応答の開始および終了時間を決定します以下からの時間のポイントを使用して推定値を作成することにより、CCBと内側ローブは、スライド上の応答をグラフ化し、これらの点に近接した値の変化により、実際の値を選択するには、対応します。 CCBと内側ローブの両方で、これらの点の間の領域を強調表示します。また、9マクロを使用します。
- 新しいスプレッドシートの上に1つの実験グループのすべてのサンプルを結合します。
- 行の値を決定することによりピークに位置合わせし、各CCBピーク値のためのものです。そのサンプルデータはに再コピーする必要がありますおおよその行の値を決定するために、最も高い行値から低い値を引きます。すべてのピーク値が合っていることを確認します。
- 二回シートをコピーし、内側ローブ列のみCCBまたは内側ローブ値のページを作成CCBの列のいずれかを削除します。
- すべてのCCB応答が終了した後にデータを削除します。総光子、応答長（持続時間）、ピーク振幅をラベル4つの行を作成し、応答待ち時間。再び原稿の下にこれをコピーして貼り付けます。
- 応答の間に合計光子を決定するために、SUM関数を使用してください。応答の長さを決定するために、COUNT関数を使用してください。ピーク振幅値を決定するために、最も高い値のセルをコピーしてリンクします。 COUNT関数を使用してください - 応答レイテンシを決定するために - ニコチンの灌流の開始からの応答の開始に選択します。
- コピー値リンク機能を使用して、秒でスピードを記録することによって、（ピーク振幅を除くすべて）を掛けます。
- そう（例： 図5B、C、D）必要に応じて、バー/ボックスのグラフは、そのような総光子、ピーク振幅、および応答長として計算されたパラメータのために作成することができます。
- 生データ光子応答後の欄に、平均関数を用いて、各時点での生データポイントを平均。時点における平均光子値のそれぞれについて、平均値の標準誤差（SEM）を決定する列を持つ場合、所望の追跡。
- 平均応答プロフィールを構築するために、平均列を使用CCBのサンプルグループの電子[グラフ]。これはx軸の値のような時間を指定するカラムとy軸として、平均光子値の列を選択し、最終的に散布グラフ作成ツールを選択することができません。
- 内側ローブからのデータをこの解析手順を繰り返します。
- ビデオ用の画像を作成します
- オープン光子ビューア。
- 表示制御]タブを選択します。 、選択削除、および/またはそれを最小限にするための制御を保持しながら、ROIをクリックします。
- 「秒幅」とは、各フレームの内容を決定するために、所望のように（蓄積時間）を変更します。
- 各フレームのオーバーラップを定義するには、「秒ステップ」を変更します。
- 押して "<< REW」、次に「演奏中にエクスポート・ビュー」を「PLAY>」を選択します。ビデオ用の画像は、.PNGファイルのシリーズとして「ビューの輸出」フォルダにエクスポートされます。
- ビデオを作るために、仮想ダブを使用して：ビデオcのための1つの方法は詳細reation
- 画像を含むビューをエクスポートしたフォルダに「resultats」という名前の新しいフォルダを作成します。
- 画像のフォルダにスクリプト（renommer.VBS）を持参してください。
- renommer.VBSをダブルクリックして実行します。
- 画像は自動的に数値的に名前を変更し、「resultats」フォルダにコピーされます。
- VirtualDub.exeを開きます。
- オープンビデオファイルを選択します - （後続の画像は自動的にロードされます）最初の画像を選択します。
- 動画を選択 - 選択フレームレート、必要に応じて調整します。
- 選択圧縮半径にCinepakコーデックを選択 - ビデオを選択します。
- ファイルでは、ビデオが自動的に作成されたAVIとして保存]を選択します。
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Representative Results
エクオリンへのGFPの融合は、私たちは顕微鏡（ 図3A、4A、6A、6E）に蛍光モードでGFPの励起されて前の生物発光イメージングに興味のある私たちの地域を可視化することができます。キノコ体を刺激する最も簡単な方法の一つは、イオンチャネル型ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化によるものです。アセチルコリンは、この受容体の内因性リガンドであるが、我々はニコチンがキノコ体でより再現性の応答を生成することを見出しました。それらは、特にニコチン性アセチルコリン受容体を発現し、したがって、ニコチンを使用することによって、我々は、脳の他の場所で表さムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化を回避することができるので、これは一部にはあります。また、ニコチンは、アセチルコリンよりも安定であるため、より良く、より信頼性の高い刺激制御を可能にします。典型的な応答は、萼、細胞体（CCB）と内側ローブ（ML）の両方の高速起動を開始します （図4を参照してくださいラベルされた画像のためのA）。一般的にCCB応答が長く続くと、応答（ 図3C-H）の連続のパネルに示すように、ローブよりも大きな生物発光応答を示す。 図4Bは、100ミリ秒（10の時間分解能で記録された光子の10秒の蓄積を示しています25μMのニコチンの1分灌流に対する応答のピーク時のヘルツ）。 10分の休薬と回復期間の後、100mMのKClを1分灌流の第二の刺激は私達が私達のサンプルの実行可能性を確認することができます（ 図4C、E）を開始します。定量的な応答は、光子ビューアで分析中にROIを選択することによって分析することができます。光子ビューアで分析を実行すると、それらの値の両方の時間（ 図4DおよびE）で選択されたROI内で放出された光子の数を表示するグラフと同様にエクスポートスプレッドシートを作成します。 図4Dは exampですルロア2 [緑]（右CCB）とROI 4 [青]（右内側ローブ）で放出された光子をプロット光子ビューアによって生成されたグラフの。 図4Eに示され塩化カリウム応答のための同様のデータ。エクスポートされたデータは、応答（ 図5A）の曲線を再構成するために、ならびにそのような持続時間、ピーク振幅、及び全応答（ 図5B-D）などの様々なパラメータに関する追加のデータを抽出するために使用することができます。最近、我々はより自然な応答を誘発する方法を考案したのGal4-UASとのLexAシステムを使用。簡単に言えば、ATP依存性P2X 2陽イオンチャネルは、投射ニューロン（PNS）において発現され、GFP-エクオリン（GA）は、キノコ体で発現される-のPNの目標を、これは、私たちが選択的に順番に、キノコ体（ 図6）で応答を生成することができ、ATPのアプリケーションしかし手形債権を励起することができます。
上流活性化配列と生物発光レポーター（GFP-エクオリン）GFPの。（A）回路図およびエクオリン融合遺伝子の図1の特性 。 （B）のCa 2+の高レベルに応じて、イクオリンによって青色発光のモデル。 Caを高レベルに応じて、GFP-エクオリンにより緑色発光の（C）モデル2+。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.実験は、ピペットチップ内に配置。（A）フライを設定します。 （B）十分な接着技術のイラスト頭部を安定化させ、フライ本体とピペットチップとの間の領域を封止します。 （C）頭部カプセルを開くために解剖の模式図。 （D）を挿入灌流チューブでブロックを保持する上で1ミリリットル室。全室寸法：長さ7.4センチ、幅2.7センチ、高さ0.55 cmです。内部チャンバ寸法：長さ1.7センチ、幅1.4センチ、高さ0.35 cmであり、室孔の半径：0.1 cmでした。 MB単位でGFP陽性シグナルを示すハエの頭の（E）表示：キューティクルを除去した後にOK107主導型GFP-エクオリン由来の蛍光を持つ低薄暗いです。光子カメラと灌流システムとの（F）顕微鏡。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
キノコ体で、25μMニコチン図3.代表的応答。（A）の蛍光画像GA2でキノコ体におけるGFP-エクオリン発現/ +; OK107 / +制御ハエ脳（スケールバー=50μm）を。 （B）キノコ体のピーク生物発光反応。刺激の前に（C）。 （D）応答のスタート。 （E）のピーク応答。 （F）は、CCBの応答を継続します。 （G）の立ち下がりCCB応答。 （H）応答の終了（BH：スケールバー= 33ミクロン）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サンプル記録の図4。代表的な分析 （A）GA2のキノコ体の蛍光画像/ +;。OK107 / +コントロール（4 ROIのCCBにわたって選択および内側の葉を飛ぶ規模BAR = 50ミクロン）。 （B）、25μMニコチンに対する生物発光反応の10秒の蓄積- 100ミリ秒で記録された光子応答。 （C）100ミリ秒で記録された100mMのKClに対する生物発光反応の10秒の蓄積。それぞれ右CCBをカバーし、ROIの2と4内のニコチン応答の間に放出された光子と内側ローブの記録数の（D）のグラフ。 ROIの2と4は、それぞれ、右CCBおよび内側の葉をカバー内のKCl応答の間に放出された光子の記録数の（E）のグラフ。右Y軸は、ROI内の光子に対応しているd及びeは、左Y軸は、全視野内の光子の合計数に相当する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サンプル記録の図5.代表的なパラメータ解析 GA2 / +でキノコ体のニコチン活性化に生物発光反応の代表的なExcelの分析;。OK107 / +制御フライ。 （A）CCBと内側ローブの経時光子応答。 （B）CCBに対する応答と内側ローブの持続時間。 CCBと内側ローブ内に応答中の（C）最高光子値（最大振幅）。 （D）CCBと応答全体の内側ローブ内の総光子。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
THR手形債権の刺激後のキノコ体における図6.二つの異なる応答ウワーッATP及びP2X 2。キノコ体でのPNおよびGFP-エクオリン（GH146 / +にP2X 2を発現しているサンプル1フライ; P2X 2 / MB247-のLexA、13XLexAop2-IVS-G5A-BP（広告）（A）のROI（スケールとキノコ体の蛍光画像。 =50μmのバー）。（B）P2X 2でのPNをアクティブにした後のキノコ体におけるピーク応答の生物発光画像は、内側の葉に主に認められ、500μMのATPで刺激した。ピークのKCl応答の（C）生物発光画像。（D応答を通して、ROI領域内の光子放出の）時間経過、キノコ体でのPNおよびGFP-エクオリンにP2X 2を発現しているサンプル2フライ（GH146 / +; P2X 2 / MB247-のLexA、13XLexAop2-IVS-G5A-BP（EH ）。（E）のROI（スケールバー=50μm）を有する蛍光画像。（F）以下のキノコ体で誘導される応答の生物発光画像P2X 2によって手形債権のctivationはローブとCCBの両方で、1mMのATPで刺激しました。 （G）のピークのKCl応答の生物発光画像。 （H）応答を通じて、ROI領域内の光子放出の時間経過は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
必要に応じて、ここで紹介する最近開発された生物発光ベースのGFP-エクオリンアプローチは、Cabrero らに報告されているように腎臓星状細胞などの細胞の他の種類で、異なる神経細胞におけるCa 2+ -活性のインビボで機能的記録で可能にする、など。 2013年5。
修正、トラブルシューティング、追加のコンポーネント、および重要なステップ
ショウジョウバエ畜産
GFP-エクオリン導入遺伝子（pG5A）4は、3つの独立した形質転換株6を作成するためのpUASTベクターに挿入しました。すべての行は、その生物発光について試験した、すべてがin vivoでのCa 2+ -活性6に応答することができました。しかし、より最近の実験では、第3染色体上に挿入されたGA2ラインはGA1ライン挿入Oよりも強いシグナルを生成することを指摘していますn個の第2染色体。ここでは、代表的な結果は、MB-特定ラインOK107と交差GA2は、UASを用いて得ました。また、最近B.ファイファーは20XUAS調節要素（20X-G5A-2）の制御下に置かれたGFP-エクオリン構築物を生成し、この構築物は、我々の研究室で確認されています。簡単に言えば、それは、したがって、より効率的で、さらに、楕円体などの脳のより深い構造中のCa 2+ -活性を監視するために有用であるはずである私達の標準GA2、より強い非常に強いシグナルを与えます。さらに、それはまた、神経細胞または軸索末端（シナプス接点）で少量を画像化するために有用であり得ます。
イメージングのための準備
フライは氷位置決めおよび接着の際に麻酔をかけなければならないが、それは氷の上での時間を最小限に抑えることが重要です。ハエは、冷却されたペトリ皿に移動される前に、ガラスバイアルに移し、2分間氷上に保持しなければなりませんピペットチップの位置決めのために。我々は、麻酔の持続時間は、サンプルの生存度を低下させ、反応を弱めることができることに気づきました。最適には、我々は5〜10分間の下に氷の麻酔の時間を保ちます。
テーピングと接着は重要なステップです。これは、解剖およびイメージングのための場所にフライヘッドを確保するだけでなく、および/または記録チャンバーからピペットチップへのリンゲル液の漏洩を防止することが重要です。歯科接着剤（およびより少ない程度にシリコン接着剤）が粘着性になり、その後、すぐに2つの成分が組み合わされるように乾燥し始めます。従って、弱い結合と接着剤の凝集を避けるために迅速に接着剤を適用することが重要です。いくつかのケースでは、リンゲル液と接触して、その場、その応答に影響を与えることができるリンゲル液中に汚染物質を放出することができるときに、テープや接着剤の代替品種に気づいた特に実験をtに専念するためにそう彼は別のにおいを使用して、嗅覚系の研究しています。材料を代入した場合その結果、（私たちが使用する特定の品種のための材料を参照）、ここで注意してください。
セレンテラジンのいくつかの異なる形態は、発光の速度、 の Ca 2+ -アフィニティー（感度）、または発光12の強度とその活性を最適化するために開発されてきました。ベンジル - セレンテラジンは短い半減期を有する、より速く、より高い発光が得られる（また、H-セレンテラジンと命名）しながら、例えば、ネイティブセレンテラジンは、数時間などの長期的なイメージングのため、より適した、より安定です。セレンテラジンの異なる形式の詳細については、マテリアルリストのWebアドレスを参照してください。
イメージング
生物発光シグナルは、電子増倍CCDカメラでモニターすることができる顕微鏡に装着（EM-CCD、-80ºCに冷却しました）。このセットアップでは、bの必要がありますeは、望ましくない（周囲）光の混入を避けるために、厳しい暗箱内部に収容。この原稿に記載されセットアップが400×400ミクロン（512×512ピクセル）の視野を可能にする20X液浸対物レンズを使用しています。信号対雑音比を改善するために、データは、0.100秒の積分時間（10ヘルツ）で取得し、2×2ビニングを使用した（1ピクセル= 1.2×1.2ミクロン）。データを取得し、記憶するために、各検出された光子は、x、y座標及び時点に割り当てました。 500〜600 nmの波長、EM-CCDカメラは、（材料リストの正確な記述を参照のこと）96％の量子効率を有します。
in vivoでの脳機能イメージングのための最も重要なパラメータの1つは、時間分解能です。今までは、蛍光ベースのCa 2+ -imagingなどGCaMPような技術とカメレオンの大部分は、約4ヘルツ（250ミリ秒/フレーム）の時間分解能を提供します。最近では、生物発光ベースのGFP-エクオリンで我々はRAISすることができました最大100ミリ秒/ EMCCDカメラでフレームとさえ電子増倍管ICDD カメラ 10で120フレーム/秒（8.3ミリ秒/フレーム）までに電子取得時間。この時間分解能で（約1ミリ秒の範囲で）電気生理学的手法のことに近づきます。高い時間分解能が遅く、まだ本質的なのCa 2+ -kinetics拡張作用を誘発され、シナプス伝達と刺激に特化した研究のため、有益で重要なの両方ですが、細胞内のCa 2+保管さからインスタンスのためのCa 2+放出 、神経細胞内で起こります（レビューのために：Berridge ら 、2003年13。）。逆に、彼らは一般的に検出するセンサからのより良いの Ca 2+ -アフィニティーを必要としながら、この後者のタイプでは、遅い時間分解能は、まだ許容可能です。この要件は、嗅覚RECEPTの軸索末端に細胞内Ca 2+保管さのリリースを検出するために、GFP-エクオリンで達成されていますORSニューロン7,8。あるいは、所望の実験条件に依存して、より遅い捕捉時間を使用することができます。例えば、長いO / Nの記録では、我々が原因収集されたデータポイントの数が多い（Minocci ら 、2013）に2秒の積分時間を使用しています。簡単に言えば、生物発光と実用的な一特徴は、時間分解能を容易に所望の実験条件に応じて調整することができるということです。
代替室（フライセットアップ）は、実験の目的を容易にするために開発されてきました。例えば、自然の匂い刺激に基づいて研究のために、アンテナは、したがって、A.フィアラ14によって開発されたようなアプローチは、（我々はMurmu らのために同様のアプローチを使用していました。2010）に最適です、自由に保たれなければなりません。簡単に言えば、このアプローチでは、フライは小さな穴を含有するプラスチックカバースリップに接着され、首にminutienピン、上（糊付け）繋がれています。シールが作成されますハエの頭の上の周り。その後、リンガーの低下は頭の上に堆積され、ヘッドカプセルが切開されます。このように、アンテナは、自由に保ち、臭いを感知するために利用可能です。同様に、長期的な記録のために、O / Nまたは10日のさえカップルフライは、例えば、（可能な限り制約のように自由に保持され、いくつかのケースで供給される必要がある：5％ブドウ糖に浸し、毛細管紙で溶液）。このような状況でフィアラのアプローチはまた、ブルーピペットチップ（シュノーケリング法）でのアプローチよりも適しています。
全ての薬物アプリケーションは、外部から6ウェイマルチバルブ重力灌流システムを用いて制御することができます。フロー前2ml /分の流れのための各記録セッションに対して較正容積灌流レギュレータを用いて制御することができます。排水装置は、連続的な流れを可能にする蠕動ポンプを介して、記録室から2ml /分の速度で液体を抽出します。
に薬物および/または使用するための薬物の量の高価な費用のいくつかの条件は、一つには、化合物の少量のみを適用したいです。したがって、直接浴ではなく、灌流システムを介して印加する必要があります。この場合、シャッターは光汚染を避けるために、このプロセスの間に閉じる必要があります。
分析方法
座標あたり毎秒秒または数あたりのカウント数は、両方の分析のために私たちのグループで使用されてきました。秒あたりのカウントは（ROIの大きさに対する応答の正規化を表す。）秒あたりの座標あたりのカウント数に対し、全体の構造で明るい応答のため、おそらく最も適していることは細胞の小集団に最適かつ正確です。それらの両方が容易に解析ソフトウェアで選択することができます。
生物発光法を使用することの主な利点の1つは、取得したデータの（X、Y、Tパラメータが格納されている方法であります各）光子を放出されました。実際、（一般的にTIFF形式で）取得フルイメージとして標準モードを使用し、他のイメージング技術は、このシステムでは、我々は時の光によって活性化された唯一の画素座標を格納することによってのみ関連し、重要な信号を取得しながら、 （取得時間や時間分解能に相当）は、時間の前の固定期間。したがって、データのストレージは、ストレージ全体画像に比べて実際には「光」であり、その結果、それが簡単にデータを分析することができます。データ分析のために、我々は、必要に応じて蓄積時間を設定することができます関連ソフトウェア（光子ビューア）を使用します。説得力のあるデータを提示する目的で、所望のように信号の画像の表示を調整することができます。並行しての結果は、その取得時間よりも同じ解像度時に定量化されます。
意義と生物発光イメージングの生物学的応用
生物発光カルシウムイメージング上述したように蛍光カルシウムイメージング技術に三つの主な利点があります：（1）は、脳の深部領域を画像化することができる、（2）イメージングは、O / Nであり、さらにいくつかのように数時間より長い持続時間のために継続的に発生する可能性があります2日までの場合、および（3）最近では、高い時間分解能で、120フレーム/秒（8.3ミリ秒）まで。生物発光のアプローチの主な制限は、結果的に、私たちは、活性化構造や神経細胞の正確な深さ（Z-計画）を決定することはできません共焦点照明、との非互換性に起因するものです。
生物発光イメージング、深い脳領域の画像の第一の利点は、以前のない前と楕円体（EB）、脳の中央に位置深い構造、内高カリウム誘発性カルシウム応答のイメージングによって2007年に実証されました電気生理学的または機能的なレポート6 A -受容体の遮断薬）の適用後にEBの自然のCa 2+ -活性の記録です（ ：おむつら 、論文投稿中）。
第2の利点は、より長い、連続時間記録、私たちの研究室からのいくつかの研究に利用されてきました。匂い刺激は、以前の研究11,15,16に脳神経細胞の活性を調べるために使用されてきました。長期的イメージングを使用して、しかし、私たちの研究室は、匂いに対する嗅覚受容ニューロン内動態で以前に報告されていない変更を表示することができました。 Murmu らの最初の研究。（2010）は、短い臭気刺激（1-3秒）が同様の動態と振幅の緩やかな違いを示しながら、長い臭気刺激（5秒）だけでなく、はるかに大きな振幅を発生させたことを示しました動力学/構造の変化細胞内カルシウムストアに起因していた応答のURE。その後の研究では、適応プロセスを示唆し、反応の進行性の減衰につながった5秒の刺激の長さを増加させる、5分間隔で1秒間臭パルスの5連続アプリケーションながらは、それらのカルシウム応答を変化させなかったことを示しました。さらに、この適応現象は、以前に同定されたカルシウム貯蔵8のGABA作動性規制によって開始されるように思われました。重要なのは、このデータはまた、この実験条件では、GFP-エクオリンのの Ca 2+ -sensorを検出し、 細胞内Ca 2+保管さから解放カルシウムに従うことができ、ことを証明しています。私たちの研究室からの追加のユニークな研究では、キノコ体10に基礎（自発的）は、脳全体のニューロンとグリア集団での活動だけでなく、活動を記録するために生物発光イメージングO / Nを使用していました。これらの録音はアリで驚くべき自発的な活動を明らかにしましたennal機械刺激と運動センター（AMMC）と触角葉。また、グリアの予想外の細胞自律的な活動は、一晩中発生します。キノコ体の中での研究では、短い1つずつ、その発症年齢10で変更長い、点状の活動と2特徴的なピークの両方を同定しました。
私たちの研究室で最も最近の研究では、メモリに関与する二次シグナル伝達分子の操作の影響を調べるために生物発光イメージングを使用し、どのように彼らはキノコ体9内のカルシウム応答に影響を与えます。 劣等生とルタバガは 30年以上前に同定し、cAMPのレベルを調節することが知られているが、実際、細胞および生理学的メカニズムに特にの Ca 2+ -responseにそれらのインビボ効果はまだほとんどわかっていません。 GFP-エクオリンアプローチで、我々は同時に萼（樹状structurの両方を記録することができましたES）および細胞体だけでなく、ローブのレベルでの軸索投射、したがって、私たちはレベルと、この非常に複雑な構造の異なる区画における応答の動態を相関させることができます。
我々は人工的に関心のある構造にシナプス前ニューロン集団を活性化を通じて模倣自然な反応を開発している最新のアプリケーション。これを行うために、我々は、シナプス前ニューロンにおけるP2X 2受容体 、ATPに応答するリガンド依存性陽イオンチャネルを発現し、シナプス後ニューロン集団でGFP-エクオリンを発現します。異なるニューロン集団に、これら二つの要素の分離は、2つの別々の発現系を必要とします。このためのLexAは、GFP-エクオリンが作成されている含む構築します。このシステムとの予備実験では、UAS-P2X 2とのGal4-GH146を使用して、手形債権のサブセットにおいてP2X 2を表明しているとキノコ体におけるGFP-エクオリンLexA-13X-GFP-エクオリンと組み合わせたLexA MB247ラインを使用。我々は成功し手形債権におけるP2X 2受容体（ 図6）に1mMのATPの刺激とキノコ体にカルシウム応答を記録しました。
結論として、生物発光GFP-エクオリンアプローチは、Ca 2+誘導性の刺激-活性、他のCa 2+ -indicatorsに類似を記録する際に有用であることが証明されています。しかし、もっと重要なのは、それはまた、脳内の自発的なのCa 2+ -活性の検出を可能にします。このアプローチは、脳内の生理現象や活動パターンの我々の理解の深さを増加させることができ、長期間の実験と全脳イメージングのための将来の可能性を開きます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
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