Summary
Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.
Abstract
Functionele in vivo beeldvorming is een krachtige aanpak om de functie en fysiologie van hersencellen en structuren van belang te bestuderen. Recent werd een nieuwe methode ontwikkeld Ca2 + -Imaging met de bioluminescente GFP reporter-aequorine (GA). Deze nieuwe techniek is gebaseerd op de fusie van GFP en aequorine genen produceren van een molecuul kan binden calcium en - de toevoeging van de coelenterazine cofactor - fel licht uitzenden dat kan worden bewaakt door een foton collector. Transgene lijnen die het GFP-aequorine gen werden gegenereerd voor zowel muis en Drosophila. In Drosophila is de GFP-aequorine-gen onder controle van de GAL4 / UAS binaire expressiesysteem waardoor gerichte expressie en beeldvorming in de hersenen gebracht. Deze methode is vervolgens aangetoond dat het opsporen van te zijn, zowel naar binnen Ca 2+ -transients en Ca 2+ -released van innerlijke winkels. Belangrijker het zorgt voor een grotere duur in continue opname, weergave op grotere diepte in de hersenen, en de opname op hoge temporele resoluties (tot 8,3 msec). Hier presenteren we de basis-methode voor het gebruik van bioluminescentie beeldvorming te registreren en te analyseren Ca 2+ -activity binnen de paddestoel lichamen, een structuur centraal in leren en geheugen in de vlieg hersenen.
Introduction
De fundamentele patronen en functie van activiteit in de hersenen en de discrete structuren lang een gebied van intensief onderzoek op het gebied van neurologie. Misschien enkele vroegste succesvolle benaderingen voor dit probleem waren direct fysiologische meting van de verandering in de elektrische activiteit - maar alternatieve methoden die levende beeldvorming van veranderingen in spanning, pH of calciumconcentraties (als indicatie voor activiteit) laten hebben extra mogelijkheden voor gebracht de studie van neuronale activiteit 1. Beeldvormingstechnieken voeren een breed scala van voordelen zoals verminderde invasiviteit en de mogelijkheid om te controleren activiteit in gehele hersenstructuren. Verder bij dieren met handelbare genetica, waaronder de fruitvlieg Drosophila, de ontwikkeling van genetisch gecodeerd calcium indicatoren, zoals cameleon, GCaMPs en anderen 1 hebben toegestaan onderzoekers enkele neuronen, neuronale populaties en hele hersenen te controlerenstructuren. Terwijl meer traditionele TL calcium beeldvormende methoden gebruiken GCaMPs (GFP gefuseerd met calmoduline) of FRET (GVB en YFP gefuseerd met calmoduline) hebben bewezen nuttige technieken verstrekken van goede ruimtelijke en temporele resolutie te zijn, het onderliggende proces van licht excitatie wekt een aantal beperkingen op de experimentele toepassingen. Vanwege de aard van het excitatie licht, autofluorescentie, foto-bleken en fototoxiciteit onvermijdelijk worden geproduceerd die dientengevolge beperkt de diepte van de structuren die kunnen worden afgebeeld, de duur van de opnames en de continuïteit van real time opname. Met andere woorden, opnamen moeten vaak intermitterend uitgevoerd om de ongewenste bijwerkingen te voorkomen.
Vanwege deze problemen zijn aanvullende alternatieve calcium beeldvorming ontwikkeld. Een van de meest veelbelovende methoden bioluminescentie beeldvorming, die berust op licht geproduceerd door een enzymatische reactie na calcium binding. Bioluminescent beeldvorming niet licht excitatie vereisen en dus niet dezelfde problemen als conventionele calcium imaging ervaren. Het bioluminescente reporter aequorine - geïsoleerd uit Aequorea victoria, dezelfde kwal waaruit GFP werd isolated- bindt calcium via de drie EF kant structuren en ondergaat een vormverandering, die leidt tot de oxidatie van de coelenterazine cofactor en de vrijlating van blauw licht (λ = 469 nm) 2,3. Aequorine heeft een lage affiniteit voor calcium (Kd = 10 uM) dat ideaal toezicht calcium transiënten omdat het zeer weinig ruis en niet interfereert met het intracellulaire calcium buffersysteem 4 maakt. Hoewel aequorine eerder is gebruikt om het proces van neurale inductie monitoren de Xenopus ei 5 het geproduceerde licht is te zwak om te gebruiken voor real time imaging van neuronale activiteit. In een poging om deze uitdaging, Philippe Br & pakken# 251; laat en collega's bij het Instituut Pasteur creëerde een genetisch construct fuseren GFP en aequorine genen, het nabootsen van de inheemse staat binnen de kwallen 4. Dit fusiegen product bindt calcium weer via de drie EF kant structuren van aequorine, waarbij een conformationele verandering die leidt tot oxidatie van coelenterazine, welke energie niet radiatief overdraagt aan de GFP ondergaat. Deze energieoverdracht resulteert in het vrijkomen van groen licht (λ = 509 nm) van GFP, in plaats van blauw licht van aequorine. De fusie van GFP en aequorine verleent ook een grotere eiwitstabiliteit helpen het fusie-eiwit te produceren licht 19-65 keer helderder dan alleen 4 aequorine. Met een bioluminescente benadering in de hersenen breidt de huidige experiment met calcium beeldvorming zowel wat de duur van continue registratie en het aantal structuren binnen de hersenen die kan worden opgenomen. In grote lijnen in de context van eerder werk betekent dat zowel globale en meerverscheidenheid van geregionaliseerde "activiteit" van de hersenen kan worden bewaakt (door de proxy van calcium transiënten). Belangrijker kan worden geregistreerd langer, in real time en continu, die gemakkelijk leent voor de uitoefening van een volledig begrip van basale functie in de hersenen.
In de laatste jaren hebben ons laboratorium en anderen transgene vliegen expressie brengen van het GFP-aequorine onder de controle van de binaire expressiesysteem (GAL4 / UAS-GFP-aequorine) 5,6 ontwikkeld. We hebben gebruik GFP-aequorine bioluminescentie naar record activiteit door natuurlijke stimuli zoals geur 7,8, en bestudeerden de cellulaire componenten modulerende Ca2 + -activity de mushroom bodies volgende acetylcholine receptor stimulering door directe nicotinezuur toepassing 9. Daarnaast hebben we ook GFP-aequorine een aantal experimentele vragen die niet in staat zijn eerder gericht, zoals langdurige pakkenbeeldvorming van spontane calcium transiënten en visualisatie van diepere hersenstructuren 10. Recenter hebben we de GAL4 / UAS systeem om de zoogdierlijke ATP receptor P2X 2 11 een kation kanaal in de projectie neuronen (PN) expressie en gebruikt het LexA systeem GFP-aequorine in de champignon organen expressie (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (een hoffelijkheid van B. Pfeiffer, Janelia Boerderij, Verenigde Staten). Daardoor hebben we de PN activeren toepassing van ATP, dat op zijn beurt activeert de champignon organen (een stroomafwaarts doel van de PN), nabootsen meer natuurlijke omstandigheden, zoals de respons op een stimulus geur. Overall deze techniek combineren P2X 2 en GFP-aequorine breidt de experimentele mogelijkheden. In grote lijnen biedt de mogelijkheid om de activiteitspatronen beter inzicht in de hersenen, het initiëren van nieuwe studies over verschillende stimuli en perturbaties de basale patronen van activiteit kan veranderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de monsters
- Bereiding van oplossingen en het opzetten
- Handhaven alle Drosophila melanogaster lijnen bij 24 ° C op standaard voedsel medium. Achter en houd ze bij lage dichtheid in de flacon gestandaardiseerde grootte en het gewicht van vliegen genereren.
- Voeg 10 maagdelijke vrouwtjes met 10 mannen in een flesje, laat ze paren en over te brengen om de 2 dagen om een nieuwe flacon. Vervolgens 10 dagen later, toen de vliegen beginnen te Eclose, oogsten de vliegen elke dag. Houd een nauwkeurige registratie van de leeftijd van de vliegen en bewaar ze in goede staat.
- Op dag 3, scheiden de mannetjes van de vrouwtjes en houden de vrouwtjes 20 vliegen per flacon. Noteer het vliegen op 4 of 5 dagen oud.
- Bereid Ringer's oplossing met de volgende concentraties: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES en 36 mM sucrose en de pH van de oplossing nauwkeurig 7,3. Bereid perfusie-oplossingen van 25 μ; M nicotine en 100 mM KCl in Ringer-oplossing.
- Bereid 1000 ui pipet tip: met behulp van een scheermesje vorm tip om schuin (ongeveer 35 ° ten opzichte van het einde van de tip) en verwijder overmaat base dan 1 ½ cm van tip.
- Bereiden doos voor opslag (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) van het monster tijdens incubatie. Plaats twee sponzen (12 cm x 8 cm x 3 cm) verzadigd met water in de bodem onder een kleine rek apparaat [monster uitdroging te voorkomen] om monsters te plaatsen op hun voorbereiding is voltooid.
- Bereid vliegt monsters, zodat ze ten minste 1 kopie van de UAS-GFP-aequorine en één kopie van een Gal4 lijn om de expressie van GFP-aequorine rijden. OK107 Gal4 lijn (een lijn rijden expressie voornamelijk in de paddestoel lichamen) wordt gekruist met UAS-GFP-aequorine in deze voorbereiding.
LET OP: De binnenkant van de doos moet waterbestendig zijn en de buitenkant moet licht te blokkeren van het invoeren van in om degradatie van coelenterazine tijdens incubatie te voorkomen.
- Handhaven alle Drosophila melanogaster lijnen bij 24 ° C op standaard voedsel medium. Achter en houd ze bij lage dichtheid in de flacon gestandaardiseerde grootte en het gewicht van vliegen genereren.
- Prepreiding van de monsters
- Ice verdoven Drosophila door de overdracht naar een glazen flesje en blijf op ijs gedurende 2 minuten alvorens te worden verplaatst naar de gekoelde petrischaal voor het positioneren in de pipetpunt. Bereid pipet tips over licht bevochtigde filterpapier in 100 ml petrischaal op ijs onder de dissectie microscoop.
- Voorzichtig met een pincet plaats vliegen binnenkant van pipetpunt.
- Met behulp van een borstel duw en lijn vlieg zodanig dat de kop is volledig voorbij de rand van de tip en de dorsale regio is gedeeltelijk blootgelegd door de sectie verwijderd tijdens tip vormgeving (Figuur 2B).
- Combineer een klein (ongeveer 3-4 ul) delen van de twee componenten van de tandheelkundige lijm. Breng de lijm zorgvuldig rond de voor- en achterkant van hoofd en nek naar beneden om en rond de pipet tip rand - het vermijden van de kruin van het hoofd. Laat de lijm droog gedurende 2 minuten.
- Plaats pipetpunt met gelijmde vliegen door het gat in de opname kamer (figuur 2D) en genTLY drukken om vast te zetten.
- Combineer de twee componenten van silicium lijm (ongeveer 3-4 ul). Breng lijm op de platte kant van de kamer langs de rand waar de kamer en pipettip samenkomen om lekken van de Ringer-oplossing te voorkomen. Laat de lijm droog gedurende 2 minuten.
- Ontleding
- Bevestig tape over de perfusie kanaal, korte zijde en zich uitstrekt tot de achterkant van de kamer.
- Plaats kamer met een vlieg op dissectie blok onder de microscoop zijn beurt op tl-lamp. Pipet 1 ml Ringer-oplossing in de kamer.
- Gebruik fijne chirurgische mes nagelriem verwijderen. Voeg parallelle insnijdingen vanaf de achterkant van het hoofd antennal regio. Snijd vervolgens langs de rand van het oog te maken dan een loodrechte incisie boven antenne aansluiten van de vorige insnijdingen. Een definitieve snede evenwijdig aan die aan de achterkant van het hoofd. Gebruik de fijne scherpe tang om cuticula (figuur 2C) te verwijderen.
- Gebruik fijne scherpe tang om voorzichtig te begrijpen eend Ruim blootgesteld respiratoire weefsel tot de hersenen en [fluorescerende] paddestoel lichaam duidelijk wordt gevisualiseerd.
- Gebruik ultra-scherpe pincet om zorgvuldig te begrijpen en knijp neuro-weefsel dat de hersenen om voor permeatie van de coelenterazine.
Opmerking: Als alternatief papaïne kan worden gebruikt om de neuroepithelia 9 permeabilize. - Met behulp van een pipet, wassen tweemaal met Ringer-oplossing voor elk puin van dissectie en plaats monster in het donker vakje te verwijderen.
- Pipetteer 1 ml Ringer's oplossing bevattende 5 pM benzyl-coelenterazine in de kamer. Sluit de doos en laat incubatie met coelenterazine bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur.
2. Imaging
- Opstelling
- Start de opname systeem: schakel microscoop, computer, camera en drainagesysteem en zet kamer milieucontroles tot 25 ° C.
- Open Meet- en Automation Explorer programma op de computer. Klik op “ Apparaten en Interfaces ", dubbelklik dan op" NI Motion Devices "en klik tenslotte recht op" PCI-7334 "en selecteer" initialiseren apparaat ".
- Open Photon Imager. Maak een nieuwe map en de naam van de eerste opname bestand. Camera moet -80 ° C te bereiken voordat het systeem zal functioneren.
- Instellen perfusiesysteem - voeg KCl, nicotine en Ringer's oplossing voor reservoirs en passen zodat het elke oplossing lozingen op 2 ml / min. Wassen met Ringer's oplossing vóór het begin experiment.
- Bereid monster
- Plaats imaging monteren blok schotel op de berg onder de microscoop bij 5x vergroting en steek perfusie buis in kanaal door punctie.
- Stel microscoop om fluorescerende modus dan midden en breng paddestoel lichamen (MB) in beeld. Pas om 20X en re-center en focus.
- Positie drainage apparaat dan drainage zwembad, stel hoogte van de drainage shunt, zodat de tip is gewoon Above zwembad, en lopen Ringer-oplossing voor 30 sec om voldoende waterafvoer te garanderen.
- Trek schild af te sluiten apparaat uit licht. Met behulp van het automatische systeem in foton imager maken fijne aanpassingen aan de focus en een verwijzing fluorescerende beeld van de MB's te nemen.
- Opname
- Pas foton snelheid gewenste opnamesnelheid (van 50 msec tot 1 seconde of meer). Selecteer foton-modus en open blind. Record genotype, geslacht, leeftijd, en sample nummer logboekvermeldingen. Stel de positie ROI dozen over kelk en mobiele lichamen (CCB) en mediale lobben door te klikken op de ROI dozen en te slepen terwijl controle.
- Neem basislijn gedurende ongeveer 5 tot 10 min (zoals gewenst).
- Breng nicotine gedurende 1 min. Opmerking starten / stoppen in logboek. Wassen met Ringer-oplossing gedurende 5 min.
- Wacht 5 min voor het herstel en de voorbereiding KCl logboekvermelding en timer.
- Breng KCl gedurende 1 min. Opmerking starten / stoppen in logboek. Wassen met Ringer's oplossing gedurende 1 min.
- Schakelaarfluorescerende modus, neem uiteindelijke beeld fluorescerende, en zet Ringer's oplossing.
- Druk op "Stop". Dialoogvenster vraagt af te sluiten van het systeem. Selecteer "Nee" om de opname voort te zetten.
- Open schild, verplaatsen drainagesysteem, switch lens doel 5X, verwijderen perfusie buis. Verwijder monster / opnemen gerecht uit het podium, schoon uit 20X lens door het spoelen en de lens tweemaal vegen met water.
- Druk op de play-knop wit aan de bovenkant van het programmavenster om de volgende opname te starten.
3. Analyse en Video Creation
- Extract foton waarden
- Open het foton analyse programma (bijvoorbeeld Photon Viewer) en een open eerste monster spreadsheet bestand.
- Selecteer het tabblad scherm controle. Selecteer de ROI door te klikken op de regio terwijl controle. Pas grootte, oriëntatie en vorm van de regio van belang zijn voor GFP verlicht CCB en mediale lobben omvatten.
- Voeg een toevoegingal ROI door te klikken op "Definieer ROI" en te klikken en te slepen op het scherm om de nieuwe ROI te creëren.
- Selecteer het tabblad "Movie" naar foton video af te spelen. Passen "sec breedte" en "sec stappen" zoals gewenst. Bijstellen ROI plaatsing als dat nodig is.
- Selecteer vertegenwoordiger screen shots van GFP fluorescentie, nicotine respons en KCl reactie. Afbeelding plakken gewas screenshots en in een presentatie dia voor latere analyse en vergelijking.
- Pas zowel de "sec breedte" en "sec stap" om de opnamesnelheid in seconden. Selecteer de lengte van de analyse door het verplaatsen van grijze markeringen op het bovenpaneel om beugel regio voordat stimulus aanvang en net na het einde respons.
- Selecteer "Uitstellen uitzicht tijdens het spelen van" druk "<< REW" en druk op de "PLAY>". Selecteer het tabblad 'Count Rate Chart "en pas eenheden zoals gewenst en lijn kleuren om ROI kleur overeenkomen.
- Wanneer analyse is voltooid, Druk op de "Export Count Rate Data". Select screen shots van gecombineerde opnames CCB en mediale kwab regio interesse van beide kanten. Afbeelding plakken gewas screenshots en in een dia met respons beelden. Deze schuif zal later worden gebruikt in laatste instantie.
- Voorbeeld Analyse: een methode voor de analyse van gewonnen foton gegevens gedetailleerd
- Open de spreadsheet-bestanden in 'Count Rate export "map.
- Formatteert u de cellen van de eerste kolom de tijd om de tijd in uren en minuten weergegeven.
- Verwijzen naar de overeenkomstige glijbaan voor het monster. Verwijder alle waarden met uitzondering van de kolommen voor de tijd en de twee representatieve ROI.
- Bepaal nicotine stimulatie starttijd - verkrijgbaar in logboekvermelding bestand in de belangrijkste Dossier aanvullende gegevens voor de start of markeer de waarde te verwijderen.
- Zoek hoogste / piekwaarde voor zowel de CCB en de mediale kwab en merk / highlight.
- Bepaal reactie begin- en eindtijd voor zowelCCB en mediale kwab door het creëren van een schatting met tijdstip van overeenkomstige grafiek respons op dia en selecteer actuele waarde door veranderingen in de waarden in de nabijheid van deze punten. Markeer het gebied tussen deze punten in zowel de CCB en de mediale lobben. U kunt ook gebruik maken van een macro-9.
- Combineer alle monsters van een experimentele groep op een nieuw werkblad.
- Uitlijnen op piek door het bepalen van de rij waarde is voor elke CCB piekwaarde. Aftrekken van de lagere waarden van de hoogste rij waarde geschatte waarde rij waarin dat monster gegevens moeten worden gekopieerd om te bepalen. Controleer of alle piekwaarden zijn uitgelijnd.
- Kopieer de plaat twee keer en zowel de mediale kwab kolommen of de CCB kolommen maken van pagina's van slechts CCB of mediale kwab waarden verwijderen.
- Gegevens te verwijderen na de CCB alle reacties zijn beëindigd. Maak vier rijen gelabeld Totaal Fotonen, Response lengte (duur), Peak Amplitude en Response Latency. Kopieer en plak deze weer onder de originelen.
- Gebruik de functie SOM totale fotonen bepalen tijdens respons. Gebruik de COUNT functie op lengte van de respons te bepalen. Kopiëren en koppelen hoogste waarde cel om piekamplitudewaarde bepalen. Gebruik COUNT functie - selecteren van het begin van de perfusie van nicotine aan de start van de reactie - bepalen Response Latency.
- Kopieer waarden met behulp van de koppeling functie en vermenigvuldigen (alle behalve piek amplitude) door het opnemen van de snelheid in seconden.
- Bar / box grafieken worden gecreëerd berekende parameters zoals Total fotonen, piekamplitude en respons lengte desgewenst (ex .: Figuur 5B, C, D).
- In de kolom na de ruwe gegevens foton reactie, het gemiddelde van de ruwe gegevenspunten voor elk tijdstip via average functie. Desgewenst volgen met een kolom bepalen van de standaardfout van het gemiddelde (SEM) voor elk van de gemiddelde foton waarden op een tijdstip.
- Gebruik de gemiddelde kolom een gemiddelde respons profil construerene [Graph] voor de CCB steekproef. Om dit te doen selecteert u de kolom met vermelding van het moment als de x-as waarden en de kolom van de gemiddelde foton waarden als de y-as en selecteer tot slot de puntenwolk grafiek creatie tool.
- Herhaal deze analyseprocedure met de gegevens van de mediale lobben.
- Het creëren van Beelden voor de Video
- Open foton kijker.
- Selecteer het tabblad weergave controle. Klik op ROI terwijl controle te selecteren, te verwijderen en / of minimaliseren.
- Wijzigen "sec width" (accumulatie), zoals gewenst om de inhoud van elk frame te bepalen.
- Wijzigen "sec stap" om de overlap van elk frame te definiëren.
- Selecteer "uitzicht export tijdens het spelen van" druk "<< REW" en vervolgens "PLAY>". De beelden van de video naar de "view export" map worden geëxporteerd als een reeks .png-bestanden.
- Een methode voor video-c: met behulp van Virtual Dub om video te makenreation gedetailleerde
- Maak een nieuwe map met de naam "resultats" in de folder view export met de beelden.
- Breng script (renommer.VBS) in de map met afbeeldingen.
- Dubbelklik op renommer.VBS te lopen.
- Afbeeldingen worden automatisch numeriek worden hernoemd en gekopieerd naar "resultats" map.
- Open VIRTUALDUB.EXE.
- Selecteer geopende videobestand - selecteer eerste afbeelding (volgende afbeeldingen wordt automatisch geladen).
- Selecteer video - selecteer frame rate aan te passen zoals gewenst.
- Selecteer video - select compressie selecteren Cinepak Codec door straal.
- In het bestand selecteert u Opslaan als AVI de video zal automatisch worden aangemaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fusie van de GFP tot aequorine stelt ons in staat om onze regio van belang voorafgaand aan bioluminescentie imaging visualiseren door de excitatie van GFP in fluorescerende modus op de microscoop (Figuur 3A, 4A, 6A, 6E). Een van de eenvoudigste manieren om de paddestoel lichamen te stimuleren is door activering van de ionotrope nicotine acetylcholinereceptoren. Hoewel acetylcholine is de endogene ligand van deze receptor hebben wij gevonden dat nicotine produceert meer reproduceerbare responsen in de mushroom bodies. Dit komt gedeeltelijk omdat ze specifiek de expressie nicotinerge acetylcholine receptoren, en dus door het gebruik van nicotine kunnen we de activering van de muscarinische acetylcholinereceptoren elders in de hersenen tot expressie te vermijden. Bovendien nicotine is stabieler dan de acetylcholine en maakt daardoor een betere en betrouwbaarder stimuluscontrole. Een typische reactie begint met een snelle activering van zowel de kelk, cel-organen (CCB) en mediale lobben (ML) (zie figuur 4Een label voor afbeelding). Algemeen CCB reactie langer duurt en vertoont een grotere bioluminescente respons dan de lobben zoals in de opeenvolgende panelen van de respons (Figuur 3C-H). Figuur 4B toont een 10 sec accumulatie van fotonen opgenomen met een tijdsresolutie van 100 msec (10 Hz) tijdens de piek van een reactie op een 1 min perfusie van 25 uM nicotine. Na een wash-out en de herstelperiode van 10 minuten een tweede stimulatie van een 1 min perfusie van 100 mM KCl wordt geïnitieerd (Figuren 4C, E), die ons in staat stelt om de levensvatbaarheid van onze steekproef te bevestigen. De kwantitatieve reacties kunnen worden geanalyseerd door het selecteren ROI tijdens analyse foton viewer. Het uitvoeren van de analyse foton viewer produceert beide grafieken tonen het aantal fotonen uitgezonden in geselecteerde ROI in de tijd (Figuur 4D en E) en uitvoerbare spreadsheets van die waarden. Figuur 4D is een voorble van de door foton kijker het uitzetten van de fotonen in het ROI 2 [groen] (rechts CCB) en ROI 4 [blue] (rechts mediale lobben) grafieken. Vergelijkbare gegevens van de KCl reactie weergegeven in figuur 4E. De geëxporteerde data kunnen worden gebruikt om de curve van de respons (Figuur 5A) te reconstrueren en aanvullende gegevens over de verschillende parameters zoals de duur, amplitude piek en de totale reactie (Figuur 5B-D) extract. Onlangs met het Gal4-UAS en LexA systemen hebben we een werkwijze voor het opwekken van een natuurlijke reactie ontwikkeld. In het kort wordt het ATP-gated P2X 2 kationenkanaal uitgedrukt in de projectie neuronen (PN) en GFP-aequorine (GA) wordt uitgedrukt in de champignon lichamen - een doelstelling van de PN; Deze kunnen we de PN hoewel toepassing van ATP, die op hun beurt kunnen produceren in respons mushroom organen (figuur 6) selectief exciteren.
Figuur 1. Kenmerken van Bioluminescent Reporters (GFP-aequorine). (A) Schematische voorstelling van GFP en aequorine fusiegen met upstream activeringssequentie. (B) Model van blauwe lichtemissie door aequorine vanwege de hoge niveaus van Ca2 +. (C) Model van groen licht emissie door GFP-aequorine in reactie op de hoge niveaus van Ca 2+. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Experimentele opstelling. (A) Fly gepositioneerd pipet tip. (B) Een illustratie van geschikte lijmtechniek stabiliseren van het hoofd en afdichten van de regio tussen de vlieg lichaam pipet tip. (C) Schematische voorstelling van dissectie om het hoofd capsule te openen. (D) 1 ml kamer over het houden van blok met perfusie buis gestoken. Totaal Kamer afmetingen: lengte: 7,4 cm, breedte: 2,7 cm, hoogte: 0,55 cm. Binnenkamer afmetingen: lengte: 1,7 cm, breedte: 1,4 cm, hoogte: 0,35 cm, en de straal van de kamer gat: 0,1 cm. (E) bekijken van vlieg hoofd zien GFP-positief signaal in de MB: lage gedimd licht met fluorescentie afgeleid van OK107-driven GFP-aequorin na het verwijderen van de cuticula. (F) microscoop met foton camera en perfusie-systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Vertegenwoordiger reactie op 25 uM nicotine in paddenstoelen lichamen. (A) Fluorescentie beeld vanhet GFP-aequorine tot uitdrukking in de paddestoel lichamen in GA2 / +; OK107 / + controle fly hersenen (schaal bar = 50 pm). (B) Peak lichtgevende respons in de paddestoel lichamen. (C) Voorafgaand aan de stimulatie. (D) Start van de respons. (E) Peak reactie. (F) Vervolg CCB reactie. (G) Falling CCB reactie. (H) Einde van de respons (BH: schaal bar = 33 micrometer). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve analyse van het monster opname (A) TL-beeld van de paddestoel lichaam van de GA2 / +;. OK107 / + controle vliegen met vier ROI's geselecteerd over de CCB en de mediale lobben (schaal bar = 50 pm). (B) 10 sec accumulatie van de bioluminescente reactie op 25 uM nicotine - foton respons geregistreerd op 100 msec. (C) 10 sec accumulatie van bioluminescente reactie op 100 mM KCl geregistreerd op 100 msec. (D) Grafiek van opgenomen aantal fotonen uitgestoten tijdens nicotine antwoord binnen ROI's 2 en 4 voor de juiste CCB en mediale lobben respectievelijk. (E) Grafiek van opgenomen aantal fotonen uitgestoten tijdens KCl antwoord binnen ROI's 2 en 4 voor de juiste CCB en mediale lobben, respectievelijk. In d en e, de linker Y-as komt overeen met het totale aantal fotonen binnen het gehele gezichtsveld, terwijl de rechter Y-as komt overeen met de fotonen binnen het ROI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 5. Representatieve parameters analyse van het monster opname Vertegenwoordiger excel analyse van de bioluminescent reactie op nicotine-activering van de paddestoel lichaam in de GA2 / +;. OK107 / + controle vliegen. (A) Photon respons na verloop van tijd in de CCB en mediale lobben. (B) Duur van de reacties in de CCB en mediale lobben. (C) Hoogste foton waarde (maximale amplitude) in antwoord binnen de CCB en de mediale lobben. (D) Totaal fotonen binnen CCB en mediale lobben van de gehele reactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Twee andere reactie in paddestoel lichamen na stimulatie van PN thrdoorgedreven ATP en P2X 2. Voorbeeld 1 vlieg uiten P2X 2 in PN en GFP-aequorine in paddestoel lichamen (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) TL-beeld van de paddestoel organen met ROI's (schaal. bar = 50 pm). (B) Bioluminescent beeld van de grootste gevoeligheid bij een paddestoel organen als gevolg van de activering van de PN door P2X 2 gestimuleerd met 500 uM ATP, waargenomen in de eerste plaats in de mediale lobben. (C) Bioluminescent beeld van de piek KCl reactie. (D ) Tijd loop van fotonemissie binnen ROI regio's, de hele reactie Voorbeeld 2 vliegen uiten P2X 2 in PN en GFP-aequorine in paddestoel lichamen (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh ). (E) TL-afbeelding met ROI's (schaal bar = 50 pm). (F) Bioluminescent beeld van de geïnduceerde reactie in de paddestoel lichamen na eenctivation van de PN van P2X 2 gestimuleerd met 1 mM ATP, zowel lobben en CCB. (G) Bioluminescent beeld van de piek KCl respons. (H) Tijd loop van fotonemissie binnen ROI regio's, de hele reactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het recent ontwikkelde bioluminescente gebaseerde GFP-aequorine benadering hier gepresenteerde maakt in vivo functionele opname van Ca2 + -activity verschillende neuronen, alsmede indien gewenst, in andere soorten cellen zoals bruine stellaatcellen zoals in Cabrero et al. 2013 5.
Modificaties, trouble shooting, extra componenten en kritische stappen
Drosophila Veehouderij
GFP-transgen aequorine (pG5A) 4 werd in de pUAST vector drie onafhankelijke transformant lijnen 6 maken. Alle lijnen werden getest op hun bioluminescentie, en al konden reageren op de in vivo Ca2 + -activity 6. Maar meer recente experimenten hebben erop gewezen dat de GA2 regel ingevoegd op de derde chromosoom genereert robuuster signaal dan de GA1 lijn geplaatst on de tweede chromosoom. Hier, de representatieve resultaten werden verkregen door het gebruik van UAS-GA2 gekruist met de MB-specifieke lijn OK107. Bovendien recent B. Pfeiffer is een GFP-aequorine-construct onder controle van 20XUAS reguleringselement (20X-G5A-2) die gegenereerd en dit construct werd gevalideerd in ons laboratorium. Kort samengevat, geeft een zeer sterk signaal, sterker dan de standaard GA2, die derhalve efficiënter en nuttig voor de Ca2 + -activity in diepere structuren van de hersenen, zoals de ellipsoïde-orgaan verder monitoren. Bovendien kan het ook nuttig zijn voor het afbeelden van kleine hoeveelheden neuronen of axon terminals (synaptische contacten) zijn.
Voorbereidingen voor Imaging
Hoewel de vlieg ijs worden verdoofd tijdens het positioneren en lijmen, is het belangrijk om de tijd op ijs minimaliseren. Vliegen worden overgebracht naar een glazen flesje en op ijs gehouden gedurende 2 minuten voordat de koppen aan de gekoelde petrischaalvoor het positioneren in de pipetpunt. We hebben gemerkt dat langere periode van de anesthesie vermindert de levensvatbaarheid van het monster en kan de reactie verzwakken. Optimaal, houden wij de tijd van ijs anesthesie onder 5-10 min.
Taping en lijmen zijn kritische stappen. Het is cruciaal om de vlieg hoofd te vergrendelen voor dissectie en imaging en lekkage van de Ringer-oplossing in de pipet tip en / of uit de opname kamer te voorkomen. Dental lijm (en in mindere mate het silicium lijm) wordt plakkerig en vervolgens beginnen zodra de combinatie van beide bestanddelen drogen. Daarom is het cruciaal om de lijm vlot toepassen op zwakke binding en klontering van de lijm te voorkomen. In sommige gevallen hebben we opgemerkt dat alternatieve soorten plakband en lijm, bij contact met de Ringer-oplossing, kunnen verontreinigingen in de Ringer-oplossing die de vlieg en de reactie kan beïnvloeden vrijgeven, met name voor experimenten gewijd aan tHij studie van olfactorische systeem, met behulp van verschillende geuren. Dus wees voorzichtig hier als het vervangen van materialen (zie materialen voor specifieke soorten die we gebruiken).
Verschillende vormen van coelenterazine zijn om zijn activiteit te optimaliseren ontwikkeld, zoals de snelheid van lichtemissie, Ca 2+ Affiniteit (gevoeligheid) of de intensiteit van lichtemissie 12. Bijvoorbeeld, de natieve coelenterazine is stabieler, waardoor geschikter lange termijn beeldvorming als enkele uren, terwijl de benzyl-coelenterazine (ook genoemd h-coelenterazine) resulteert in een snellere en hogere lichtemissie met een kortere halfwaardetijd. Voor meer informatie over de verschillende vormen van coelenterazine, zie het webadres in de Materials List.
Imaging
Bioluminescentie signalen kunnen worden gevolgd met een elektronenvermenigvuldiger CCD camera (EM-CCD, afgekoeld tot -80 ° C) aangebracht op een microscoop. Deze opstelling moet be gehuisvest in een strakke donkere doos om eventuele ongewenste (omgevings) licht te voorkomen. De in dit manuscript beschreven opstelling maakt gebruik van een 20X-immersie objectieflens waardoor een gezichtsveld van 400 x 400 urn (512 x 512 pixels). Om signaal-ruisverhouding te verbeteren, werden de gegevens verkregen met een 0,100 sec integratie tijd (10 Hz), en 2 x 2 binning werd gebruikt (1 pixel = 1,2 x 1,2 micrometer). Om gegevens te verwerven en op te slaan, werd elke gedetecteerde foton toegewezen x, y-coördinaten en een tijdstip. Tussen 500 en 600 nm, de EM-CCD-camera (zie nauwkeurige beschrijving in Materials List) heeft een quantum rendement van 96%.
Een van de meest belangrijke parameters voor de in vivo functionele beeldvorming is de temporele resolutie. Tot nu toe de meeste fluorescentie gebaseerde Ca2 + -Imaging techniek zoals GCaMP en kameleon geeft een tijdsresolutie van ongeveer 4 Hz (250 msec / kader). Onlangs, met bioluminescentie gebaseerd GFP-aequorine we hebben kunnen Rais geweeste de overname tijd tot 100 msec / frame met de EMCCD camera en zelfs tot 120 beelden / sec (8,3 msec / kader) met de elektronenvermenigvuldiger ICDD camera 10. Op dit tijdsresolutie benadert van de elektrofysiologische technieken (in het traject van ongeveer 1 msec). Terwijl de hoge temporele resolutie is zowel informatief als cruciaal voor de studies gewijd aan synaptische transmissie en stimulus geïnduceerde activiteit, uitgebreid langzamer maar essentieel Ca 2+ -kinetics komt ook binnen neuronen, bijvoorbeeld de Ca 2+ vrijlating uit de intracellulaire Ca 2+ -stores (voor een overzicht: Berridge et al, 2003 13.). Voor dit laatste type, een langzamere tijdsresolutie nog acceptabel, terwijl omgekeerd, ze vereisen in het algemeen een betere Ca2 + Affiniteit van de sensor te detecteren. Deze eis is bereikt met GFP-aequorine de afgifte van de intracellulaire Ca 2 + -stores detecteren de axon terminal van de olfactorische receptors neuronen 7,8. Alternatief, afhankelijk van de gewenste experimentele omstandigheden langzamer opnametijd kan worden gebruikt. Bijvoorbeeld, lange O / N opnames, we hebben een 2 sec integratietijden gebruikt vanwege het grote aantal gegevenspunten verzameld (Minocci et al., 2013). Kortom, een praktische functie met de bioluminescentie is dat de temporele resolutie eenvoudig kunnen worden aangepast aan de gewenste experimentele omstandigheden.
Alternatief kamers (setup vlieg) zijn ontwikkeld om de doelstellingen van het experiment te vergemakkelijken. Bijvoorbeeld, de studies op basis van natuurlijke geur stimulus, de antenne moet worden vrijgehouden derhalve een benadering zoals die ontwikkeld door A. Fiala 14 het best (we een soortgelijke aanpak Murmu et al. 2010 gebruikt). In het kort, in deze benadering, de vlieg is vastgemaakt (gelijmd) op minutien pin aan de hals, die is gelijmd op een kunststof dekglas met een klein gaatje. Een afdichting wordt gecreëerdrond de top van de kop van de vlieg. Daarna wordt een druppel ringer afgezet op de kop en de kop capsule wordt ontleed. Op een dergelijke wijze, worden de antennes vrijgehouden en zijn geuren waarnemen. Ook voor de lange termijn opname, zoals O / N of zelfs enkele dagen 10 moet de vlieg als vrij van dwang mogelijk gehouden en in sommige gevallen toegevoerd (bijvoorbeeld met een capillaire gedrenkt in een glucose 5% oplossing). In deze omstandigheden Fiala's aanpak is ook beter geschikt dan de aanpak in de blauwe pipet tip (snorkelen methode).
Alle drugs applicaties kunnen worden gecontroleerd met behulp van een extern 6 manier multi-kleppen zwaartekracht perfusie-systeem. De stroom kan met volumetrische perfusie regulatoren gekalibreerd voorafgaand aan elke opnamesessie een stroomsnelheid van 2 ml / min. Drainage-inrichting onttrekt vloeistof met een snelheid van 2 ml / min van de opname kamer via peristaltische pomp waardoor een continue stroom.
Insommige omstandigheden als gevolg van dure kosten van het geneesmiddel en / of de hoeveelheid geneesmiddel te gebruiken, zou men willen slechts kleine hoeveelheden van verbindingen toepassen. Derhalve is het noodzakelijk om direct toe te passen in het bad in plaats van via perfusie systeem. In dit geval moet de sluiter worden gesloten tijdens dit proces het licht te voorkomen.
Analysemethoden
Tellingen per sec of tellingen per seconde per coördinaat zijn beide gebruikt door onze groep voor analyse. Tellingen per seconde is misschien geschikt voor heldere responsen geheel structuren dat tellingen per seconde en per coördinaten (die een normalisering van de antwoorden op de grootte van het ROI representeert) is geschikt en nauwkeurig voor kleine populaties van cellen. Beiden kunnen gemakkelijk worden geselecteerd bij de analysesoftware.
Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van bioluminescentie benadering zoals die zijn verkregen en opgeslagen gegevens (x, y, t parameters vanelke uitgezonden fotonen). Inderdaad, terwijl andere beeldvormende technieken standaardmodus als verworven volledige afbeelding (meestal in een TIFF-formaat), met dit systeem verkrijgt we alleen de relevante en significante signaal slaan alleen de pixel coördinaten die door het licht geactiveerd tijdens een vooraf bepaalde tijdsduur (dat overeenkomt met de verwervingstijd of temporele resolutie). Derhalve is de opslag van de data werkelijk "light" in vergelijking met de opslag volledig beeld, en bijgevolg maakt het gemakkelijker om de data te analyseren. Voor data-analyse gebruiken we een bijbehorende software (foton viewer), welke instelling van de accumulatietijd toelaat zoals gewenst. Dan is de weergave van een beeld van de signalen kan worden aangepast zoals gewenst in een doel om de gegevens overtuigend presenteren. Parallel de resultaten worden gekwantificeerd in dezelfde resolutie tijd dan hun acquisitie tijd.
Betekenis en biologische toepassingen van bioluminescentie beeldvorming
Zoals hierboven bioluminescente calcium imaging genoemd heeft drie belangrijke voordelen fluorescente calcium beeldvormingstechnieken: (1) een diepere gebieden van de hersenen kan worden afgebeeld, (2) beeldvorming kan continu plaatsvinden voor langere looptijden zo enkele uren O / N en zelfs in sommige gevallen tot twee dagen, en (3) recenter, met een hogere temporele resolutie, tot 120 frame / sec (8,3 msec). De belangrijkste beperking van de bioluminescent aanpak is te wijten aan de onverenigbaarheid met confocale verlichting, die doet dus niet ons toelaten om de precieze diepte (z-Plan) van de geactiveerde structuren of neuronen te bepalen.
Het eerste voordeel van bioluminescentie beeldvorming, beeldvorming van diep hersengebieden, is eerder in 2007 aangetoond door de beeldvorming van een hoog kalium geïnduceerde calcium- reactie binnen de ellipsoïde lichaam (eb) een dieptestructuur in het midden van de hersenen, zonder voorafgaande elektrofysiologische of functionele rapporten 6 Ca2 + -activity in de eb na toepassing van picrotoxine (blokker van GABA A-receptoren), waaruit blijkt dat het GABAergische ring-neuronen van de eb inderdaad remmende neuronen (beschreven :. Diaper et al, artikel ingediend).
Het tweede voordeel, langere en continue tijd opnemen, is in verschillende studies uit ons lab benut. Geur stimulatie is gebruikt om de activiteit van de hersenen neuronen onderzocht in eerdere studies 11,15,16. Met behulp van de langere termijn beeldvorming echter ons lab is in staat om eerder gemelde veranderingen in de kinetiek tonen binnen de olfactorische receptor neuronen om geuren geweest. De eerste studie van Murmu et al. (2010) toonden aan dat terwijl de korte geur stimuli (1-3 sec) vertoonden vergelijkbare kinetica en een matige verschillen in amplitude, duur geur stimulus (5 sec) veroorzaakte een veel grotere amplitude en een verandering in de kinetiek / structuurure van de respons die werd toegeschreven aan intracellulaire calcium stapelplaatsen. Een latere studie toonde aan dat de 5 opeenvolgende toepassingen van 1 sec geur pulsen met 5 minuten intervallen hun calciumrespons niet veranderde, waardoor de lengte van de stimulus tot 5 sec tot progressieve verzwakking van de respons, wat suggereert een aanpassingsproces. Verder is deze aanpassing fenomeen leek te worden geïnitieerd door GABAergic regulering van de eerder geïdentificeerde calcium winkels 8. Belangrijk deze gegevens blijkt dat in deze experimentele conditie, kan het GFP-aequorine Ca 2+ -sensor detecteren en volgen calcium vrij uit de intracellulaire Ca2 + -stores. Een extra unieke studie van ons lab gebruikt bioluminescentie beeldvorming O / N om basale (spontane) activiteit in de hele neuronale en gliacellen in de hersenen als activiteit op te nemen in de paddestoel lichamen 10. Deze opnames bleek verrassend spontane activiteit in antEnnal mechanosensorische en motorische centrum (AMMC) en antennal kwab. Bovendien onverwachte cel autonome activiteit in de glia optredende gedurende de nacht. Binnen de paddestoel het lichaam van de studie die zowel punctata activiteit en twee opvallende pieken, een korte en een lange waarvan incidentie veranderd met de leeftijd van 10.
In het meest recente onderzoek in ons laboratorium, gebruikten we bioluminescente beeldvorming om de effecten van de manipulatie van secundaire signalering moleculen betrokken bij geheugen onderzoeken en wat doen calciumreactie in de mushroom bodies 9. Ofschoon dunce en koolraap werden meer dan 30 jaar geleden geïdentificeerd en zijn bekend om het niveau van cAMP te reguleren, de in vivo effecten op cellulaire en fysiologische mechanismen en met name op de Ca2 + -respons nog altijd grotendeels onbekend. Met het GFP-aequorine aanpak, zijn we in staat om tegelijkertijd op te nemen zowel de kelk (de dendritische structur geweestes) en de mobiele lichamen, alsook de axonale uitsteeksels op het niveau van de lobben en zodat wij het niveau en de kinetische van de reactie in de verschillende compartimenten van deze uiterst complexe structuur correleren.
De meest recente toepassing ontwikkelen we bootst een natuurlijke reactie via een kunstmatige activeren neuronale populaties presynaptische de structuur van belang. Hiervoor drukken we de P2X 2 receptor, een ligand-gated kation kanalen die reageert op ATP in het presynaptische neuron en express GFP-aequorine in het postsynaptische neuronale populatie. De scheiding van deze twee elementen in verschillende neuronale populaties vereist twee aparte expressiesystemen. Daartoe een LexA construeren met GFP-aequorine is gemaakt. In onze voorlopige experimenten met dit systeem hebben wij P2X 2 expressie in een subset van de PN met het Gal4-GH146 UAS-P2X 2 en GFP-aequorine in het lichaam mushroommet behulp van de LexA MB247 lijn gecombineerd met LexA-13X-GFP-aequorine. We hebben met succes calcium reacties die in de champignon lichaam stimulaties van 1 mM ATP de P2X receptor 2 in de PN (figuur 6).
Concluderend is de bioluminescentie GFP-aequorine benadering nuttig gebleken bij het opnemen van de stimulus geïnduceerde Ca2 + -activity, analoog aan andere Ca2 + -indicators zijn. Maar nog belangrijker, het maakt ook de detectie van spontane Ca2 + -activity in de hersenen. Deze aanpak opent toekomstige mogelijkheden voor de lange termijn experimenten en hele beeldvorming van de hersenen dat de diepte van ons begrip van de fysiologische verschijnselen en de activiteit patronen in de hersenen te verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
