In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin
Summary
Her præsenterer vi en ny Ca2 + -imaging tilgang ved hjælp af en bioluminiscerende reporter. Denne fremgangsmåde anvender en kondenseret konstruktion GFP-aequorin, som binder til Ca2 + og udsender lys, hvilket eliminerer behovet for lys excitation. Markant denne metode tillader lange kontinuerlig billeddannelse, adgang til dybe hjernens strukturer og høj tidsmæssig opløsning.
Abstract
Funktionel in vivo-billeddannelse er blevet et stærkt værktøj til at studere funktionen og fysiologi hjerneceller og strukturer af interesse. For nylig blev en ny metode til Ca 2+ -imaging hjælp af bioluminescerende reporter GFP-aequorin (GA) er blevet udviklet. Denne nye teknik beror på fusion af GFP og aequorin gener, der producerer et molekyle stand til at binde calcium og – med tilføjelse af dets cofaktor coelenterazin – udsender lys, der kan overvåges ved hjælp af en foton samler. Transgene linier bærer GFP-aequorin gen er blevet genereret for både mus og Drosophila. I Drosophila har GFP-aequorin gen blevet anbragt under kontrol af GAL4 / UAS binære udtryk, der giver mulighed for målrettet udtryk og billedbehandling i hjernen. Denne metode er senere blevet vist at være i stand til at detektere både indad Ca2 + -transients og Ca2 + -released fra indre lagre. Vigtigst det giver mulighed for en større varighed i kontinuerlig optagelse, billedbehandling på større dybder i hjernen, og optagelse ved høje tidsmæssige opløsninger (op til 8,3 ms). Her præsenterer vi den grundlæggende metode til at bruge selvlysende billeddannelse til at registrere og analysere Ca 2+ -activity indenfor champignon organer, en struktur centralt for indlæring og hukommelse i fluen hjernen.
Introduction
Den grundlæggende mønster og funktion af aktivitet inden for sine diskrete strukturer i hjernen og har længe været et område med intense studier inden for neurovidenskab. Måske nogle af de tidligste vellykkede tilgange, der anvendes til at løse dette problem var direkte fysiologiske målinger af ændringen i elektrisk aktivitet – men alternative metoder, der tillader levende billeddannelse af ændringer i spænding, pH eller calcium koncentrationer (som proxy for aktivitet) har bragt yderligere kapaciteter til studiet af neuronal aktivitet 1. Billeddannelsesteknikker bære en bred vifte af fordele såsom reduceret invasionsevne og evnen til at overvåge aktiviteten inden hele hjernen strukturer. Desuden i dyr med medgørlige genetik, herunder frugt flyve Drosophila, udvikling af genetisk kodede calcium indikatorer, såsom Cameleon, GCaMPs og andre 1 har tilladt forskere til at overvåge enkelte neuroner, neuronale populationer og hele hjernenstrukturer. Mens mere traditionelle fluorescerende calcium billeddiagnostiske metoder ved hjælp GCaMPs (GFP fusioneret til calmodulin) eller FRET (FFP og YFP fusioneret til calmodulin) har vist sig at være brugbare teknikker, der giver god rumlig og tidslig opløsning, den underliggende proces med lys excitation skaber nogle begrænsninger på dens eksperimentelle anvendelser. På grund af lysets natur excitation, autofluorescens, foto-blegning, og fototoksicitet er uundgåeligt produceret, hvilket følgelig begrænser dybden af de strukturer, der kan afbildes, varigheden af optagelser samt tidstro kontinuitet optagelse. Med andre ord skal optagelser ofte udføres intermitterende at undgå disse uønskede bivirkninger.
På grund af disse udfordringer, er der blevet udviklet yderligere alternative metoder til calcium imaging. En af de mest lovende metoder er bioluminescerende billeddannelse, som er baseret på lys, der produceres ved en enzymatisk reaktion efter calcium binding. Bioluminescent imaging kræver ikke lys excitation og derfor ikke oplever de samme vanskeligheder som konventionel calcium billeddannelse. Bioluminescerende reporter Aequorin – isoleret fra Aequorea victoria, det samme Jellyfish hvorfra GFP blev også isoleret-binder calcium via sine tre EF hand strukturer og gennemgår en konformationsændring, hvilket fører til oxidation af dets cofaktor coelenterazin og frigivelsen af blåt lys (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin har en meget lav affinitet for calcium (Kd = 10 uM), hvilket gør den ideel til overvågning calcium transienter fordi den producerer meget lidt baggrundsstøj og ikke interfererer med den intracellulære calcium-puffersystem 4. Selv aequorin tidligere har været anvendt til at overvåge processen med neurale induktion i Xenopus æg 5 lyset produceret er for svagt til at bruge til tidstro billeddannelse af neuronal aktivitet. I et forsøg på at tage denne udfordring, Philippe Br &# 251; lad og kolleger på Pasteur Instituttet skabt en genetisk konstruktion sammensmelte GFP og Aequorin gener, efterligne den indfødte stat i vandmænd 4. Dette fusionsgenproduktet binder calcium igen via de tre EF hand strukturer af aequorin, som gennemgår en konformationsændring, der fører til oxidation af coelenterazin, som overfører energi ikke-radiativt til GFP. Denne energi overførsel resulterer i frigivelse af grønt lys (λ = 509 nm) fra GFP, i stedet for blåt lys fra aequorin. Sammensmeltningen af GFP og aequorin giver også større proteinstabilitet hjælpe fusionsproteinet producere lys 19 til 65 gange lysere end Aequorin alene 4. Ved hjælp af en bioluminescerende tilgang i hjernen udvider den nuværende eksperimentelle anvendelse af calcium imaging både hvad angår varigheden af kontinuerlig optagelse, og antallet af strukturer i hjernen, der kan optages. Stort set i sammenhæng med tidligere arbejde betyder det, at både global og en størrekan overvåges række regionaliseret "aktivitet" i hjernen (gennem proxy af calcium transienter). Endnu vigtigere aktivitet kan overvåges i længere tid, i en realtid og kontinuerlig basis, som let egner sig til udøvelse af en fuldstændig forståelse af basal funktion i hjernen.
I de sidste par år, har vores laboratorium og andre har udviklet transgene fluer, der udtrykker GFP-aequorin under kontrol af det binære ekspressionssystem (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6. Vi har brugt GFP-aequorin bioluminescens at optage aktivitet frembragt af fysiske stimuli, såsom duft 7,8, samt studeret de cellulære bestanddele modulerer Ca2 + -activity i svampen organer følgende acetylcholinreceptor stimulering ved direkte nicotin-program 9. Derudover har vi også brugt GFP-aequorin til at løse en række eksperimentelle spørgsmål, som ikke har været i stand til at blive behandlet tidligere, ligesom langsigtedebilleddannelse af spontane calcium transienter og visualisering af dybere hjernens strukturer 10. På det seneste har vi brugt GAL4 / UAS system til at udtrykke pattedyr ATP-receptoren P2X 2 11 en kation kanal, i projektion neuroner (PNS) og bruges LexA systemet til at udtrykke GFP-aequorin i champignon organer (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (en høflighed af B. Pfeiffer, Janelia Farm, USA). Dette har givet os mulighed for at aktivere PNS ved anvendelse af ATP, som til gengæld aktiverer champignon organer (en nedstrøms target i PNS), efterligner flere naturlige forhold, såsom reaktion på en stimulus lugt. Samlet denne teknik kombinerer P2X 2 og GFP-aequorin udvider de eksperimentelle muligheder. Groft det giver mulighed for bedre at forstå de mønstre af aktivitet i hjernen, indlede nye undersøgelser om, hvordan forskellige stimuli og forstyrrelser kan ændre den basale mønster af aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nyligt udviklede bioluminescerende-baserede GFP-aequorin tilgang præsenteres her tillader in vivo funktionelle registrering af Ca 2+ -activity i forskellige neuroner, samt, hvis det ønskes, i andre slags celler såsom nyre stjerneformede celler som rapporteret i Cabrero et al. 2013 5.
Modifikationer, problemer skydning, yderligere komponenter, og kritiske trin
Drosophila Husb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -. R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -. R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
