Abstract
Récemment, la préférence de la drosophile ponte a émergé comme un modèle génétiquement traitable pour étudier les bases neurales des processus de prise de décisions simples. Lors de la sélection des sites pour déposer leurs œufs, les mouches femelles sont capables de classer l'attractivité relative de leurs options et en choisissant les "plus de deux produits." Cependant, la plupart des essais de préférence ponte ne sont pas pratiques si l'on veut adopter une approche de dépistage génétique systématique à la recherche de la base de circuits qui sous-tend ce processus de prise de décision simple, comme ils sont et laborieux à mettre en place basée sur la population. Pour augmenter le débit de l'étude des préférences de ponte des femelles simples, nous avons développé personnalisés chambres que chacun peut les préférences de ponte simultanément dosage allant jusqu'à trente individu vole ainsi qu'un protocole qui assure chaque femelle a un taux de ponte élevé (de sorte que leur préférence est facilement discernable et plus convaincante). Notre approche est simple à exécuteret produit des résultats très cohérents. En outre, ces chambres peuvent être équipées de différents accessoires pour permettre l'enregistrement vidéo des animaux de ponte et de fournir de la lumière pour les études de optogénétique. Cet article fournit les plans pour la fabrication de ces chambres et la procédure pour la préparation des mouches à doser dans ces chambres.
Protocol
1. Préparation de mouches à doser
- Culture vole sur la mélasse standards / media à la semoule de maïs incubateur réglé à 25 ° C et 65% d'humidité. Prenez soin de ne pas surcharger les flacons. Par exemple, mettre 8 femmes et 6 hommes dans un flacon alimentaire étroite.
Note: "flacon alimentaire étroite» utilisée ici a un diamètre intérieur de 2,3 cm. Nous généralement distribué environ 10 ml de nourriture à la mouche dans chaque flacon. La recette de la nourriture à la mouche, nous avons utilisé est décrit ici: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 jours après les femelles eclosion, préparer des flacons avec de la pâte de levure fraîche comme le montre la figure 1E. Faire de la pâte de levure fraîche en mélangeant 6 g de levure active avec 10 ml d'acide propionique 0,5%. Utiliser une spatule pour appliquer la pâte de levure sur la paroi latérale des flacons de produits alimentaires. Collecter 30 - 35 femelles éclos avec 20 - 25 mâles dans les flacons.
- En général, de recueillir les mâles des mêmes flacons où les femelles sont collectées(Afin de gagner du temps et de l'effort). Toutefois, si l'on se préoccupe de la fertilité des mâles, utilisez les mâles WT à la place. En outre, la pâte de levure est important pour stimuler la production d'œufs donc le préparer frais tous les jours.
- Maintenir les hommes / femmes recueillies à 25 ° C, 65% d'humidité, à moins que les mouches sont sensibles à la température.
- Après ~ 4 - 5 jours, vérifiez les flacons pour voir si les femelles sont prêtes pour des expériences de ponte. Ils sont prêts lorsque la surface du milieu alimentaire est humide à partir de larves fouisseuses activement à la nourriture (voir la figure 1E - F).
Remarque: Les femelles retiennent généralement pondre une fois que la surface de l'aliment devient humide et grouillante de larves. Cette étape garantit que les femmes seraient prêtes à pondre d'œufs quand ils rencontrent des substrats avec la texture désirée (par exemple., ~ 1% d' agarose).
2. Chambre de la Construction, Assemblée, Assay Setup
- Avoir un atelier d'usinage de construire des chambres de ponte acryliques (Figurer 1A - D). Le dessin technique de différentes pièces ont été montrés à la figure supplémentaire 1 -. 3 images haute résolution peuvent également être trouvés ici (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Insérez des feuilles de plastique dans le chargement ( en haut) morceau de la chambre comme le montre la figure 1C. Cela sert de surface de fond pendant le chargement vole dans les arènes de ponte individuels.
- Anesthetize femelles sur un bloc de CO 2 et de les charger individuellement dans chaque arène de ponte. Autoriser ~ 30 min pour les mouches pour récupérer du CO 2 et de s'acclimater à ce nouvel environnement.
- Préparer les substrats d'agarose.
- Pour plus de commodité, garder une bouteille de premade fondu 1% d'agarose dans un bain d'eau C 55 °.
- Ajouter la quantité désirée de solution mère de saccharose (2 M) dans un tube conique de 50 ml et en le mélangeant avec une quantité appropriée d'agarose. Par exemple, pour préparer le substrat mM, saccharose 150, plaCE 750 pi de solution 2 M de saccharose dans le tube, puis remplir le tube avec de l'agarose à la marque 10 ml.
- Préparer le substrat brut de la même manière mais en ajoutant de l'eau distillée au lieu de la solution de saccharose.
Remarque: La concentration finale d'agarose dans ce protocole est légèrement inférieur à 1%. Dans notre expérience, la concentration exacte de l'agarose n'a pas d'importance tant qu'il est commandée pour être à l'intérieur de ~ 0,9 à 1,1% et que les deux substrats sont de la même concentration d'agarose.
- Prendre la pièce de la chambre et la pipette de 1000 ul de substrat d' agarose substrat ( en bas) dans chaque creux comme on le voit sur la figure 1D.
- Laisser agarose se solidifier pendant ~ 30 min.
- Une fois que les substrats d'agarose et les mouches sont prêts, assembler les trois morceaux de la chambre de ponte et ensuite prendre les feuilles de plastique.
- Placer les chambres dans les incubateurs de mouches.
Note: Longueur des expériences de ponte peut varier selon expebesoins rimentales. Nous courons généralement l'expérience O / N (14 - 16 h). En outre, on a observé aucun impact significatif de la synchronisation circadienne sur les préférences de ponte. - Anesthetize femelles par injection de CO 2 dans la chambre. Démonter la chambre, jeter les mouches anesthésiés dans la mouche morgue (ie., Un café vide peut rempli avec de l' huile de maïs). Prenez des photos des résultats pour la tenue des dossiers (voir la figure 2).
- Comptez le nombre d'oeufs manuellement et calculer les indices de préférence pour l'analyse. Calculer l' indice de préférence en tant que (N a - N b) / (N a + N b) , où N et N a b représentent le nombre d'oeufs sur le site d' un site par rapport à b, respectivement.
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Representative Results
Les chambres de ponte sont composés de plusieurs pièces: un morceau substrat ( en bas), un diviseur (milieu) pièce, une charge ( en haut) pièce, et 2 portes coulissantes (Figure 1A - D). Ces pièces sont utilisées pour indépendamment les mouches de configuration et des substrats avant des expériences de ponte. Figure 1F montre comment les flacons devraient regarder quand mouches femelles sont prêtes pour la ponte. Quand les mouches ont le choix entre un substrat simple et un substrat contenant du saccharose, les femelles robuste préfère le substrat brut pour la ponte comme le montre la figure 2.
Figure 1. Chambres de ponte et ponte Protocole. (A) egg Entièrement assemblé chambre -laying. (B) des pièces démontées. a: la pièce de chargement (en haut), b: lapièce de diviseur (milieu), c: le substrat (en bas) pièce. Les dessins techniques de ces pièces sont présentées à la figure supplémentaire 1 -. 3 (C) La pièce de la chambre de chargement. a ': les portes, d'un «glissement:.. rails Les feuilles de plastique sont insérés dans la pièce de chargement pour servir de plancher pour garder les mouches chargées en place Nous généralement mis des bandes de couleur sur le bord des feuilles de plastique (flèche rouge). (D) le substrat ( en bas) et le diviseur (milieu) des morceaux de la chambre. Agarose est déposé dans des auges individuelles pour servir de substrats de ponte (flèches). Quadrilatère décrit l'arène de ponte pour une seule mouche. (E ) jour 0 des femmes / des hommes dans un flacon yeasted collectées () jour F 4 -.. 5 des femmes / hommes dans un flacon yeasted recueillies Notez que les larves et les femelles adultes ont mangé plus de la levure et la surface de l'aliment est devenu occupée par les larves. La nourriture de surface humide ramper avec des larves empêche les femelles de pondre plus d'œufs dans le flacon. (G) Schéma illustrant le protocole pour la mise en place des expériences de comportement ponte. (S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure)
Figure 2. Résultats pour Flies Choisir entre sucrose et lisses Substrats Représentant ponte. (A) Vue de côté des résultats de la ponte de type sauvage vole quand ils ont eu le choix entre le saccharose (150 mM) et des substrats lisses. Boîte blanche présente une arène de ponte pour une seule mouche. (B) Vue d'en haut des résultats de la ponte. Boîte blanche présente une arène de ponte pour une seule mouche. (C) Indice de Préférence ( PI) de type sauvage vole quand on lui demande de choisir entre un substrat contenant du saccharose et un substrat brut. PI pour chaque femelle est calculé comme suit: (nombre d'œufs sur un substrat de saccharose - nombre d'oeufs sur les substrats lisses) / nombre total d'œufs. Barre d'erreur indique SEM. (S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure)
Supplémentaire Figure S1 Dessins technique pour la Diviseur et la pièce de substrat de la Chambre.. (A - A ") Différentes vues de la pièce de la chambre de substrat. (B - B ') Différentes vues de la pièce de séparation milieu de la chambre.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier)
Complémentaire Figure S2 Dessins technique pour la pièce de chargement de la Chambre.. (A - A ') Différentes vues de la couche supérieure de la pièce de la chambre de chargement. . (B - B ') Différentes vues de la couche inférieure de la pièce de la chambre de chargement (S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier)
Supplémentaire Figure S3.
Supplémentaire Figure S4. Accessoires et personnalisation de Chambers ponte. (A) chambres de pondeuses équipés de caméras à enregistrement vidéo mouches au cours des expériences de ponte 13. Ctrax 14 avec l' extension 12 est utilisé pour suivre les mouches et code personnalisé MATLAB est utilisé pour tracer les trajectoires. (B) le programme d' installation pour éclairer des substrats de ponte avec ligh rouge t. LED (1) sont reliés à un conducteur de LED (2). intensité des LED est commandée par le microcontrôleur (3). Pour plus d' informations sur la caméra, système de distribution de lumière et les animaux de suivi dans des conditions d'éclairage anormales, voir Zhu et al. et Stern et al. (C) LED rouges (lumière éteinte) attachés au haut de la chambre de ponte. (D) LED rouges (lumière sur) fixés au sommet de chambres de ponte. L'intensité LED de LED rouge est généralement définie pour être autour 7-10 uW / mm lorsque CsChrimson 15 est utilisé pour activer les neurones. (E) La ponte des chambres équipées de caméras et des LED pour enregistrer vidéo mouches au cours d' expériences avec la lumière rouge (lumière éteinte). (F) chambres de pondeuses équipés de caméras et des LED pour enregistrer vidéo mouches au cours d' expériences avec la lumière rouge (lumière). (t: 28px; "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier)
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Discussion
Les chambres et les protocoles décrits ici ont plusieurs améliorations par rapport à des essais de ponte précédents. Tout d'abord, ils augmentent le débit de dosage préférences des animaux isolés de manière significative. Chaque chambre peut doser 30 femmes célibataires et il faut moins d'une heure à mettre en place. D'autre part, ils augmentent la cohérence des préférences de ponte par rapport aux méthodes antérieures. La normalisation des dimensions de l'arène, la taille des substrats de ponte, et la distance entre les substrats, il est plus facile de comparer les résultats entre les différents jours expérimentales et des différents groupes de recherche. Troisièmement, les chambres peuvent être équipées de pièces jointes pour accueillir une analyse supplémentaire on veut poursuivre (Figure complémentaire 4). Par exemple, pour l' analyse comportementale, les caméras vidéo peuvent être attachés à la partie supérieure de la chambre pour enregistrer les mouches 7,11-13. Plus important encore, cette approche est évolutive. Ces chambres sont relativement inexpensive pour produire à l'aide d'un atelier d'usinage. En outre, il faut généralement un travailleur qualifié à moins de 2 heures pour mettre en place 5 chambres (150 femelles simples) vaut d'essais de ponte.
L'un des facteurs les plus critiques lorsque l'on étudie la préférence des femmes célibataires ponte est d'assurer que chaque femelle est amorcée à jeter beaucoup d'œufs. (Une préférence de "50 contre 0 oeuf" est beaucoup plus convaincant que la préférence de «1 contre 0 oeuf"). Ce protocole, lorsqu'il est correctement exécuté, devrait permettre régulièrement des mouches de type sauvage (Canton S et w1118) de fixer au moins 50 œufs / par femelle O / N. Plusieurs facteurs contribuent à la production de femelles avec un taux de ponte élevé. Tout d'abord, il faut prendre soin de ne pas surpeupler les flacons / bouteilles lors de la culture des femelles à doser. Surpeuplement produit souvent plus petites larves, qui croîtrait en plus petites femelles qui pondent moins d'œufs. Deuxièmement, il faut faire en sorte que les femelles à doser ont accès à beaucoup de pâte de levure lorsqu'ils sont mélangés with mâles dans les flacons de produits alimentaires. Il est recommandé que 0,5% d'acide propionique à la place de l'eau sont utilisés pour préparer la pâte de levure parce que l'acide propionique augmente non seulement la ponte mais aussi de réduire l'infection fongique dans des flacons. Troisièmement, il ne faut pas doser les femelles jusqu'à ce que la surface des larves / nourriture de la nourriture flacons ressemblent à l'image montrée sur la figure 1F; si pas suffisamment ponte privé, les femmes ne seraient pas jeter autant d'œufs lors de l'analyse dans les chambres. Notez également que les flacons alimentaires utilisés ici sont les «flacons étroits». Si l'on utilise des flacons de plus grand diamètre, il faut augmenter le nombre de femelles / mâles pour être placé dans le flacon de sorte que les femelles seraient prêts à doser dans 4 - 5 jours.
Alors que le protocole décrit ici est essentiellement axé sur l'examen des femelles de préférences entre le saccharose et les substrats lisses, il peut être adapté pour étudier les femelles de la préférence dans d'autres conditions. Par exemple, ces chambres peuvent être utilisées pour assaLa préférence de y mouches lors du choix entre l' agarose plus dur et plus souple (par ex., 1% par rapport à 1,5% d' agarose), ainsi que des substrats qui diffèrent dans d' autres indices chimiosensoriels (par exemple., 3% d'acide acétique). Si équipé avec couvercle qui contient LED pour éclairer un ou les deux substrats, la chambre peut également fournir une plate - forme efficace pour mener des études optogénétiques (Figure 4) complémentaire.
Enfin, il convient de noter que , bien que cette configuration permet un débit plus élevé pour analyser les préférences de ponte de la drosophile, il a quelques limitations importantes. Tout d'abord, la dimension des chambres fixes limite la flexibilité de l'analyse comportementale. Par exemple, on aura besoin de faire de nouvelles chambres afin de tester la façon dont les autres paramètres (par exemple., La distance entre les substrats) peuvent affecter les préférences de ponte des mouches. En outre, ce système ne tient pas compte de l'environnement complexe Drosophila rencontre à l'état sauvage. Il est très rare que les mouches devront décider entre un substrat saccharose pur par rapport à un substrat brut pur pour la ponte dans la nature. Ainsi, alors que notre test est efficace pour étudier les bases neurales d'une tâche de décision simple, il faut être conscient que les "décisions" femelles spécifiques font dans nos chambres peuvent ne pas être éthologiquement pertinentes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
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