Abstract
Recentemente, la preferenza deposizione delle uova di Drosophila è emersa come un modello geneticamente trattabili per studiare le basi neurali di semplici processi decisionali. Quando si seleziona siti per depositare le loro uova, mosche femmine sono in grado di rango l'attrattiva relativa delle loro opzioni e scegliere il "maggiore tra due beni." Tuttavia, la maggior parte dei test di preferenza deposizione delle uova non sono pratici se si vuole prendere un approccio sistematico screening genetico per la ricerca di base del circuito alla base di questo semplice processo decisionale, in quanto sono basati sulla popolazione e laborioso da configurare. Per aumentare il throughput di studiare delle preferenze ovaiole di singole donne, abbiamo sviluppato le camere personalizzate che ciascuno può allo stesso tempo saggio preferenze deposizione delle uova fino a trenta individuale vola così come un protocollo che garantisce ogni femmina ha un alto tasso di deposizione delle uova (in modo che la loro preferenza è facilmente distinguibile e più convincente). Il nostro approccio è semplice da eseguiree produce risultati molto consistenti. Inoltre, queste camere possono essere equipaggiate con diversi accessori per consentire la registrazione video gli animali deposizione delle uova e per fornire luce per gli studi optogenetics. Questo articolo fornisce i progetti per la realizzazione di queste camere e la procedura per preparare le mosche per essere analizzati in queste camere.
Protocol
1. Preparazione mosche da dosare
- Cultura vola di melasso normali / media farina di mais in incubatore a 25 ° C e 65% di umidità. Fare attenzione a non affollare i flaconi. Per esempio, mettere 8 femmine e 6 maschi in una stretta fiala di cibo.
Nota: Il "flaconcino cibo stretta" qui utilizzato ha un diametro interno di 2,3 cm. Noi di solito dispensati circa 10 ml di cibo volare in ogni fiala. La ricetta cibo mosca che abbiamo usato è descritto qui: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 giorni dopo femmine eclosion, preparare fiale con pasta di lievito fresca come mostrato nella Figura 1E. Rendere pasta di lievito fresca miscelando 6 g di lievito attivo con 10 ml di acido proprionic 0,5%. Utilizzare una spatola per applicare la pasta di lievito sul fianco delle fiale alimentari. Raccogliere 30 - 35 femmine eclosed insieme a 20 - 25 maschi nelle fiale.
- In generale, raccogliere i maschi dalle stesse fiale in cui sono raccolti le femmine(In modo da risparmiare tempo e fatica). Tuttavia, se non vi è preoccupazione per la fertilità dei maschi, utilizzare i maschi WT. Inoltre, pasta di lievito è importante per stimolare la produzione di uova quindi prepararlo fresco ogni giorno.
- Mantenere la raccolta femmine / maschi a 25 ° C, 65% di umidità, a meno che le mosche sono sensibili alla temperatura.
- Dopo ~ 4 - 5 giorni, controllare le fiale per vedere se le femmine sono pronti per esperimenti di deposizione delle uova. Sono pronti quando la superficie del mezzo cibo è bagnato dalla larve scavando attivamente il cibo (vedi Figura 1E - F).
Nota: Le femmine di solito trattengono uova, che una volta che la superficie del cibo diventa bagnata e brulicante di larve. Questo passaggio garantisce che le femmine sarebbero pronti a deporre molte uova quando incontrano substrati con consistenza desiderata (ad es., ~ 1% agarosio).
2. Camera di costruzione, di montaggio, di installazione Assay
- Avere un negozio di macchina costruire camere di deposizione delle uova in acrilico (Fifigura 1A - D). Il disegno di ingegneria di diversi pezzi sono stati mostrati in figura supplementare 1 -. 3 immagini ad alta risoluzione si possono trovare anche qui (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Inserire fogli di plastica in carico (alto) pezzo della camera, come mostrato nella Figura 1C. Questo serve come la superficie inferiore durante il caricamento vola in singole arene deposizione delle uova.
- Anestetizzare le femmine su un rilievo di CO 2 e caricarli singolarmente in ogni arena deposizione delle uova. Consentire ~ 30 min per le mosche di recuperare dal CO 2 e per acclimatarsi al nuovo ambiente.
- Preparare i substrati agarosio.
- Per comodità, tenere una bottiglia premade del fuso 1% agarosio a bagnomaria C 55 °.
- Aggiungere la quantità desiderata di soluzione madre di saccarosio (2 M) in una provetta conica da 50 ml e mescolandolo con quantità appropriata di agarosio. Ad esempio, per preparare il substrato 150 mM saccarosio, place 750 ml di 2 M soluzione di saccarosio nel tubo e quindi riempire il tubo con agarosio al segno 10 ml.
- Preparare il substrato pianura nello stesso modo ma aggiungere acqua distillata al posto della soluzione di saccarosio.
Nota: La concentrazione finale di agarosio in questo protocollo è leggermente inferiore a 1%. Nella nostra esperienza, l'esatta concentrazione di agarosio non importa fintanto che viene controllato per essere all'interno di ~ 0,9 - 1,1% e che i due substrati sono della stessa concentrazione di agarosio.
- Prendere il pezzo della camera e pipetta 1000 ml di substrato agarosio substrato (in basso) in ciascun canale, come mostrato nella Figura 1D.
- Lasciare agarosio solidificare per ~ 30 min.
- Una volta che i substrati di agarosio e mosche sono pronti, assemblare tutti i tre pezzi della camera di deposizione delle uova e poi prendere i fogli di plastica.
- Mettere le camere in incubatrici mosca.
Nota: Lunghezza di esperimenti di deposizione delle uova può variare a seconda espeesigenze rimental. Noi di solito Simula O / N (14 - 16 ore). Inoltre, è stato osservato alcun impatto significativo dei tempi circadiano sulle preferenze di deposizione delle uova. - Anestetizzare le femmine iniettando CO 2 nella camera. Smontare la camera, scartare le mosche anestetizzati in volo all'obitorio (es., Un caffè vuota può riempito con alcuni olio di mais). Prendere le immagini dei risultati per registri (vedi figura 2).
- Contare il numero di uova manualmente e calcolare gli indici di preferenza per l'analisi. Calcolare l'indice preferenza come (N a - N b) / (N + N un b) dove N e N un B rappresentano il numero di uova in loco un sito vs. b, rispettivamente.
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Representative Results
Le camere di deposizione delle uova sono composti da diversi pezzi: un pezzo di substrato (in basso), un pezzo di divisione (al centro), un pezzo di carico (in alto), e 2 porte scorrevoli (Figura 1A - D). Questi pezzi sono utilizzati per indipendentemente mosche di impostazione e substrati prima degli esperimenti di deposizione delle uova. La figura 1F mostra come flaconcini devono guardare quando le mosche di sesso femminile sono pronte per la deposizione delle uova. Quando mosche sono date una scelta tra un substrato piano e un substrato contenente saccarosio, femmine robustamente preferito il substrato normale per la deposizione delle uova come mostrato in Figura 2.
Figura 1. Chambers deposizione delle uova e la deposizione delle uova protocollo. (A) completamente assemblati uovo camera -laying. (B) pezzi smontati. a: il pezzo di carico (in alto), b: lapezzo divisore (al centro), c: il substrato (in basso) pezzo. Disegni tecnici di questi pezzi sono mostrati nella Figura complementare 1 -. 3 (C) Il pezzo caricamento della camera. un ': porte, un "scorrevoli:.. rotaie I fogli di plastica vengono inseriti nel pezzo di carico per servire da pavimento per mantenere le mosche caricati in posizione Tipicamente messo nastri di colore sul bordo dei fogli di plastica (freccia rossa). (D) il substrato (in basso) e il divisore (al centro) pezzi della camera. agarosio viene depositato in singole mangiatoie per servire come substrati di deposizione delle uova (frecce). Quadrilatero delinea l'arena di deposizione delle uova per una mosca. (e ) Giorno 0 di femmine / maschi in una fiala yeasted raccolti (F) 4 ° giorno -.. 5 delle femmine / maschi in una fiala yeasted raccolti notare che larve e adulti femmine hanno mangiato la maggior parte del lievito e la superficie del cibo è diventato occupato da larve. Il cibo superficie bagnata brulicante di larve impedisce femmine di deporre più uova nel flacone. (G) Schema che descrive il protocollo per la creazione di esperimenti comportamentali deposizione delle uova. (Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura)
Figura 2. Risultati per mosche scegliere tra saccarosio e substrati Plain rappresentante la deposizione delle uova. (A) Vista laterale dei risultati ovaiole di tipo selvatico vola quando sono stati dati una scelta tra saccarosio (150 mm) e substrati di pianura. Scatola bianca delinea una scena di deposizione delle uova per una mosca. (B) Vista superiore dei risultati di deposizione delle uova. Scatola bianca delinea una scena di deposizione delle uova per una mosca. (C) Indice Preferenza ( PI) di tipo selvatico vola quando viene chiesto di scegliere tra un substrato di saccarosio contenente e un substrato pianura. PI per ogni femmina è calcolato come segue: (numero di uova su substrato di saccarosio - il numero di uova su substrati di pianura) / numero totale di uova. Bar errore indica SEM. (Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura)
Supplementare Figura S1 ingegneria disegni per il divisore e il pezzo substrato della Camera.. (A - A ") Viste diverse del pezzo substrato della Camera. (B - B ') Diversi punti di vista del pezzo divisorio centro della camera.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (Si prega di cliccare qui per scaricare questo file)
Supplementare Figura S2 Disegni tecnici per il carico pezzo della Camera.. (A - A ') diverse vedute dello strato superiore del pezzo di carico della camera. . (B - B ') Diversi punti di vista lo strato inferiore del pezzo di carico della camera (Clicca qui per scaricare questo file)
Supplementare Figura S3.
Supplementare Figura S4. Accessori e personalizzazione delle sezioni di deposizione delle uova. (A) camere di deposizione delle uova dotati di telecamere per registrare video mosche durante gli esperimenti di deposizione delle uova 13. Ctrax 14 con estensione 12 viene utilizzato per tracciare le mosche e personalizzato codice MATLAB è usato per tracciare le traiettorie. (B) il programma di installazione per illuminare substrati di deposizione delle uova con ligh rosso t. I LED (1) sono collegati ad un driver LED (2). intensità LED è controllato dal microcontrollore (3). Per ulteriori informazioni sulla fotocamera, sistema di erogazione di luce e monitoraggio degli animali in condizioni di luce anomale, vedere Zhu et al. e Stern et al. (C) I LED rossi (luce spenta) allegati alla parte superiore delle camere di deposizione delle uova. (D) I LED rossi (acceso) attaccati alla parte superiore delle camere di deposizione delle uova. L'intensità del LED di LED rossi è in genere impostato per essere intorno a 7-10 W / mm quando CsChrimson 15 viene utilizzato per attivare i neuroni. (E) deposizione delle uova camere dotate di telecamere e LED per le mosche registrare video durante esperimenti con la luce rossa (luce spenta). (F) camere di deposizione delle uova dotati di telecamere e LED per le mosche registrare video durante esperimenti con la luce rossa (luce accesa). (t: 28px; "target =" _ blank "> Clicca qui per scaricare questo file)
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Discussion
Le camere e protocolli descritti qui sono diversi miglioramenti rispetto ai precedenti test di deposizione delle uova. Innanzitutto, aumentano la velocità di saggiare preferenze dei singoli animali significativamente. Ogni camera può saggiare 30 singole femmine e richiede meno di un'ora di set up. In secondo luogo, aumentano la consistenza delle preferenze di deposizione delle uova rispetto ai metodi precedenti. La standardizzazione delle dimensioni dell'arena, le dimensioni dei substrati deposizione delle uova, e la distanza tra i substrati rende più facile per confrontare i risultati tra i diversi giorni sperimentali e da diversi gruppi di ricerca. Terzo, le camere possono essere dotate di attacchi per accogliere ulteriori analisi si vuole perseguire (figura complementare 4). Ad esempio, per l'analisi comportamentale, telecamere possono essere collegati alla sommità della camera di registrare le mosche 7,11-13. Ancora più importante, questo approccio è scalabile. Queste camere sono relativamente inexpensieroso per produrre con l'aiuto di una officina meccanica. Inoltre, si richiede in genere un operaio specializzato a meno di 2 ore per impostare 5 camere (150 singole femmine) vale la pena di saggi di deposizione delle uova.
Uno dei fattori più critici quando si studia la preferenza deposizione delle uova delle singole femmine è quello di garantire che ogni femmina è innescato a deporre molte uova. (Una preferenza di "50 contro 0 uovo" è molto più convincente di una preferenza di "1 vs 0 uovo"). Questo protocollo, se eseguito correttamente, dovrebbe consentire mosche wild-type regolari (Canton S e w1118) determinare almeno 50 uova / per femmina O / N. Diversi fattori contribuiscono alla produzione di femmine con alto tasso di deposizione delle uova. In primo luogo, si dovrebbe fare attenzione a non sovrappopolare le fiale / flaconi quando la coltura delle femmine da dosare. Il sovraffollamento produce spesso larve più piccoli, che crescono in femmine più piccole che depongono meno uova. In secondo luogo, si dovrebbe fare in modo che le femmine di essere analizzati hanno accesso a un sacco di pasta di lievito quando sono mescolati insieme ingegnoh maschi in fiale alimentari. Si raccomanda che l'acido proprionic 0,5% al posto dell'acqua da utilizzare per preparare pasta di lievito perché l'acido proprionic aumenta non solo ovodeposizione ma riduce anche infezione fungina in fiale. In terzo luogo, non si deve saggiare le femmine fino a quando la superficie di larve / cibo del cibo fiale guardare come l'immagine mostrata in figura 1F; se non sufficientemente deposizione delle uova privato, le femmine non avrebbero deporre il maggior numero di uova quando dosati nelle camere. Si noti inoltre che le fiale alimentari usati qui sono i "fiale strette". Se si usa fiale con diametro maggiore, si ha la necessità di aumentare il numero delle femmine / maschi da collocare nel flacone in modo che le femmine sarebbero pronti per essere analizzati in 4 - 5 giorni.
Mentre il protocollo qui descritto specificamente concentra sull'esame femmine preferenze tra saccarosio e substrati strisciamento, può essere adattato per studiare delle femmine preferenza in altre condizioni. Ad esempio, queste camere possono essere usati per assapreferenza y moscerini nella scelta tra agarosio più duro e morbido (es., 1% vs. 1,5% agarosio), così come substrati che differiscono in altri segnali chemosensoriali (ad es., 3% di acido acetico). Se munito di coperchio che contiene LED per illuminare uno o entrambi i substrati, la camera può anche fornire una piattaforma efficace per condurre studi optogenetic (Figura supplementare 4).
Infine, vale la pena notare che, anche se questa configurazione consente un throughput più elevato per analizzare le preferenze deposizione delle uova di Drosophila, ha alcune importanti limitazioni. Innanzitutto, la dimensione fissa delle camere limita la flessibilità del dosaggio comportamentale. Ad esempio, si dovranno fare nuove camere al fine di testare come gli altri parametri (ad es., La distanza tra i supporti) possono influenzare le preferenze di deposizione delle uova di mosche. Inoltre, questo sistema non cattura l'ambiente complesso Drosophila incontro in natura. E 'molto raro che vola dovrà decidere tra un puro substrato di saccarosio rispetto a un substrato di pianura puro per la deposizione delle uova in natura. Così, mentre il nostro test è efficace nello studio le basi neurali di un semplice compito decisione, si ha la necessità di essere a conoscenza che le specifiche "decisioni" femmine fanno nelle nostre camere potrebbe non essere etologicamente rilevante.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
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