Abstract
最近、 ショウジョウバエの産卵選好は、単純な意思決定プロセスの神経基盤を研究するために、遺伝的に扱いやすいモデルとして登場しました。その卵を堆積するサイトを選択する際、女性のハエは、そのオプションの相対的な魅力をランク付けし、選択することが可能である」以上の2品を。」一つは、彼らが集団ベースとセットアップが面倒であるため、この単純な意思決定プロセスの基礎となる回路の基礎を検索するために体系的な遺伝子スクリーニングアプローチを取りたい場合は、ほとんどの産卵選好アッセイは実用的ではありません。単一の雌の産卵選好の勉強のスループットを向上させるために、我々は、最大30個々のハエの各缶を同時にアッセイ産卵選好だけでなく、それぞれの女性が高い産卵率が保証するプロトコルカスタムチャンバーを開発しました（自分の好みが容易に識別可能な、より説得力があるように）。我々のアプローチは、実行するのは簡単ですそして、非常に一貫性のある結果を生成します。さらに、これらのチャンバは、ビデオは、産卵動物を記録し、光遺伝学研究のための光を提供することを可能にするために、異なるアタッチメントを装備することができます。この記事では、これらのチャンバでアッセイするハエを製造するためのこれらのチャンバと手続きを製造するための青写真を提供します。
Protocol
アッセイする1.準備ハエ
- 培養は25℃、湿度65％に設定したインキュベーターで、標準的な糖蜜/コーンミールメディアに飛びます。バイアルを混雑さないように注意してください。例えば、狭い食品バイアルに8人の女性と6人の男性を置きます。
注：ここで使用される「狭い食物バイアルは「2.3センチ内径を有します。我々は、典型的には、各バイアルに、フライ食品の約10mlを分注しました。我々が使用したフライ食品のレシピはここで説明されている：http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html。 - 2 - 図1Eに示すように、3日間の雌の羽化後、新鮮な酵母ペーストでバイアルを準備します。 0.5％プロピオン酸10mlでアクティブな酵母の6グラムを混合することにより、新鮮な酵母ペーストを作ります。食品バイアルの側壁に酵母ペーストを適用するためにへらを使用します。バイアルに25人の男性 - 20と一緒に35 eclosedメス - 30を収集します。
- 一般的に、女性が収集されているのと同じバイアルから男性を集めます（時間と労力を節約するように）。男性の生殖能力が懸念される場合は、代わりにWTの男性を使用しています。また、酵母ペーストは、したがって、毎日新鮮な準備をし、卵の産生を刺激するために重要です。
- ハエは温度に敏感でない限り、25℃、湿度65％で集め、女性/男性を維持します。
- 〜4の後 - 5日、雌は産卵実験の準備ができているかどうかを確認するために、バイアルをご確認ください。食品媒体の表面を積極的に食品中に掘り進む幼虫から濡れているとき、彼らは準備ができている（ - F図1E参照）。
注意：食品の表面が濡れて幼虫をクロールなると女性は、通常、産卵はご遠慮いただいております。このステップでは、女性は、それらが所望のテクスチャを有する基板が発生したときに多くの卵を産む準備ができているだろうことを保証する（ 例えば 、〜1％アガロース）。
2.商工会議所の建設、アセンブリ、アッセイのセットアップ
- （マシンショップではアクリル産卵室を構築Fiを提供していますグレの1A - D）。異なる部分の設計図を補足図1に示された- 。3高解像度の写真もここで見つけることができます（http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf）。
- 図1Cに示すように、チャンバのロード（上）片にプラスチックシートを挿入します。負荷が個々の産卵アリーナに飛ぶながらこれは底面として機能します。
- CO 2パッドの上にメスを麻酔し、各産卵場にそれらを個別にロードします。ハエはCO 2から回復すると、新しい環境に順応になることのために〜30分を許可します。
- アガロース基板を準備します。
- 便宜のために、55℃の水浴中で融解し、1％アガロースの既成のボトルを保持します。
- 50mlコニカルチューブにストックスクロース溶液（2 M）の所望の量を追加し、アガロースの適切な量と混合します。例えば、150mMのスクロース基板、PLAを調製しますチューブにCE 2 Mショ糖溶液の750μLをした後、10ミリリットルマークにアガロースでチューブを埋めます。
- 同じ方法で、プレーン基板を準備する代わりにショ糖溶液に蒸留水を追加します。
注意：このプロトコルにおけるアガロースの最終濃度が1％よりわずかに小さいです。 1.1％と2の基板が同じアガロース濃度であること - 〜0.9の範囲内になるように制御されるように我々の経験では、アガロースの正確な濃度は、限り問題ではありません。
- 図1Dに見られるように、各トラフに基板（下）チャンバーのピースとピペットアガロース基板を1000μLを取ります。
- アガロース〜30分間固化することができます。
- アガロース基質とハエの準備が整ったら、産卵室のすべての3つのピースを組み立て、その後、プラスチックシートを取り出します。
- フライインキュベーターにチャンバーを配置します。
注：産卵実験の長さは、EXPEに応じて変えることができますrimentalニーズ。 （ - 16時間14）私たちは、一般的に実験O / Nを実行します。また、産卵選好上の概日タイミングの有意な影響は認められませんでした。 - チャンバー内にCO 2を注入することによって、女性を麻酔。チャンバーを分解し、フライ遺体安置所（ すなわち 、いくつかのコーン油で満たされた空のコーヒー缶）に麻酔をかけたハエを破棄します。記録管理のための結果の写真を撮る（ 図2を参照）。
- 手動で卵の数を数え、分析のための選好指数を算出します。優先度を算出する（N - N B）/（N + N b）はN aとN bはそれぞれ、サイトに対サイトBの卵の数を表します。
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Representative Results
基板（下）ピース、分周器（中央）ピースロード（上）作品、および2スライドドア（ - D図1A）：産卵室はいくつかの部分で構成されています。これらの作品は、産卵の実験の前に独立して設定ハエや基板に使用されている。 図1Fは、女性のハエが産卵のために準備ができているときバイアルがどのように見えるかを示しています。ハエがプレーン基板およびスクロース含有基材との間の選択を与えられているときは、図2に示すように、雌は堅牢に産卵のために、プレーン基板好ましいです。
図1.産卵チェンと産卵プロトコル。チャンバーを-laying（A）完全に組み立てられた卵。 （B）逆アセンブル作品。 A：ロードピース（上）、B：デバイダピース（中）、C：基板（下）作品。これらのピースの設計図は、 補足図1に示されている- 。3（C）チャンバのローディング片。 '：ドア、A "スライディング：レールをプラスチックシートを所定の位置にロードされたハエを保つために床として機能するように、ローディング片に挿入されている私たちは、通常、プラスチックシート（赤矢印）のエッジにカラーテープを置きます。 （D）基板（下）と分周器（中央）チャンバーの作品は。アガロースは産卵基質（矢印）として機能するように、個々のトラフ内に堆積される。四角形は、単一のハエのための産卵アリーナの概要を示します。（E 。yeastedバイアルで収集メス/オスの）0日目（F）4日目- 。yeastedバイアルで収集メス/オスの5その幼虫と大人の女性が酵母のほとんどを食べていると、食品の表面になっています（注）幼虫によって占有。幼虫をクロール湿潤表面の食品は、バイアルでより多くの卵を産卵からメスを防ぐことができます。 （G）回路図は、産卵行動実験を設定するためのプロトコルを描いた。 （この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください）
図2.代表スクロースと平野の基板の間に選択ハエについての結果を卵を敷設。野生型の産卵結果の（A）側面図は、彼らはショ糖（150mMの）とプレーン基板間の選択肢を与えられたときに飛びます。ホワイトボックスは、単一のハエのための1つの産卵アリーナの概要を説明します。 （B）、産卵の結果の上から見た図。ホワイトボックスは、単一のハエのための1つの産卵アリーナの概要を説明します。 （C）選好指数（ショ糖含有基質とプレーン基板との間に選択するよう求められたときに、野生型のPI）が飛びます。 - 卵/総数（プレーン基板上の卵の数スクロース基板上の卵の数）を以下のように各女性のためのPIを計算します。エラーバーはSEMを示している。 （この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください）
補足図 デバイダのための S1 エンジニアリング図面や商工会議所の基板ピース （A - A "）。。チャンバーの基板片の異なるビュー（B - B '）。チャンバーの中央分周器片の異なるビュー。D / 53716 / Supplemental1.jpg "スタイル="フォントサイズ：14px;行の高さ：28px; "ターゲット=" _ "空白>（このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください）
補足図S2 商工会議所のローディングピースのためのエンジニアリング図面。。（A - A '）、チャンバのローディング片の上位層の異なるビュー。 （B - B '）、チャンバのロードピースの底層の異なるビュー。 （このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください）
補足図S3。
補足図S4。アクセサリーや産卵チェンバースのカスタマイズ。産卵実験13時のビデオ記録のハエにカメラを搭載した（A）産卵室。延長部12とCtrax 14は、ハエを追跡するために使用されるカスタムMATLABコードは、軌跡をプロットするために使用されます。赤いガーゼで産卵基質を照明する（B）のセットアップトン。発光ダイオード（1）は、LEDドライバ（2）に接続されています。 LEDの強度は、マイクロコントローラによって制御される（3）。カメラ、光送達システムと異常な照明条件の動物を追跡する方法の詳細については、Zhu らを参照してください。そして、スターンら 。産卵室の上部に取り付けられた（C）赤色LED（消灯）。 （D）赤色LED（ライトオン）産卵室の上部に取り付けられています。 CsChrimson 15はニューロンを活性化するために使用されたとき10μW/ MM -赤色LEDのLEDの強度は、典型的には約7であることが設定されています。赤色光（ライトオフ）を用いた実験中にビデオ録画ハエにカメラとLEDを装備した（E）産卵室。赤色光（光オン）を用いた実験中にビデオ録画ハエにカメラとLEDを装備（F）産卵室。 （トン：28px; "ターゲット=" _空白 ">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください）
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Discussion
ここで説明するチャンバーとプロトコルは、以前の産卵アッセイにいくつかの改良を持っています。まず、彼らは大幅に単一の動物の嗜好をアッセイのスループットを向上させます。各チャンバは、30単一の雌をアッセイすることができる、それがセットアップに時間未満かかります。第二に、彼らは以前の方法に比べて産卵選好の一貫性を高めます。アリーナの寸法の標準化は、基板間の産卵基質の大きさ、および距離は、それが簡単に異なる実験日の間、別の研究グループからの結果を比較することができます。第三に、室は1つが（ 補足 図4）を追求したい追加的な分析に対応するために、添付ファイルを取り付けることができます。例えば、行動分析のために、ビデオカメラは、ハエ7,11-13を記録するために、チャンバの頂部に取り付けることができます。最も重要なのは、このアプローチはスケーラブルです。これらのチャンバは、比較的INEXあります機械工場の助けを借りて製造するのに物思いにふけます。また、それは、典型的には、5室（150シングルメス）産卵アッセイの価値を設定するために、当業者に未満2時間かかります。
単一の雌の産卵選好を検討し、最も重要な要因の一つは、それぞれの女性は、多くの卵を産むためにプライミングされることを確実にすることです。 （「50対0の卵」の設定は、はるかに説得力のある「1対0の卵 "の好みよりも）。このプロトコルは、正しく実行されたときに、定期的な野生型のハエ（カントンSとw1118）女性のO / N当たり/少なくとも50卵を産むためのを可能にしなければなりません。いくつかの要因が高い産卵率とメスの生産に貢献しています。まず、1をアッセイする雌培養する際にバイアル/ボトル人口過剰にするしないように注意する必要があります。過密状態は、多くの場合、少数の卵を産むより小さなメスに成長する小さい幼虫を、生成されます。第二に、1は、ウィットを一緒に混合したときにアッセイする女性は酵母ペーストをたっぷりへのアクセス権を持っていることを確認してください食品のバイアル中の時間男性。また、プロピオン酸は、産卵を増加させるだけでなく、バイアル中で真菌感染症を低減するだけでなくので、0.5％プロピオン酸の代わりに水を酵母ペーストを調製するために使用することをお勧めします。第三に、1バイアルは、図1Fに示す画像のように見える食品の幼虫/食品表面までメスを分析すべきではありません。十分に産卵奪われていない場合は室内でアッセイした場合、雌は限り多くの卵を産むないだろう。また、ここで使用される食品のバイアルは「狭いバイアル」であることに注意してください。 5日目 - 一方が大径のバイアルを使用する場合、人は女性が4でアッセイする準備となるようにバイアルに配置されるように女性/男性の数を増やす必要があります。
ここでは具体的に記述されたプロトコルは、女性調べることに焦点を当てているが、他の条件の好み」のスクロースとプレーン基板間の好みを、女性研究するために適合させることができる」と。例えば、これらのチャンバは、ASSAに使用することができますyのハエの嗜好ときに硬く、より柔らかいアガロースとの間で選択する（ 例えば 、1％対1.5％アガロース）、ならびに他の化学感覚手がかりが異なる基質（ 例えば 、3％酢酸）。一方または両方の基板を照明するLEDが含まれて蓋を取り付けた場合、チャンバはまた、光遺伝学研究（ 補足 図4）を実施するための効率的なプラットフォームを提供することができます。
最後に、このセットアップは、ショウジョウバエの産卵選好を分析するためのより高いスループットを可能にするが、それはいくつかの重要な制限を持っていることは注目に値します。まず、チャンバーの固定寸法は、行動分析の柔軟性を制限します。例えば、1は、どのように他のパラメータをテストするために、新しいチャンバを行う必要があります（ 例えば 、基板間の距離）をハエの産卵選好に影響を与える可能性があります。また、このシステムは、野生で複雑 な環境ショウジョウバエの出会いをキャプチャしていません。自然の中で卵は、産卵のために純粋なプレーン基板対純粋なショ糖の基板との間に決定する必要があります飛ぶことは非常に稀です。私たちのアッセイは、単純な決定タスクの神経基盤を研究する上で効率的であるこのようにしながら、一つは特定の「決定」、女性は動物行動学適切ではないかもしれません私たちのチャンバ内で行うことを認識する必要があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
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