Abstract
Vor kurzem Eiablage bevorzugt von Drosophila als genetisch manipulierbaren Modell entstand die neuronale Grundlage einfacher Entscheidungsprozesse zu studieren. Bei der Auswahl von Standorten um ihre Eier abzulegen, sind weibliche Fliegen der Lage, die relative Attraktivität ihrer Optionen Ranking und die Auswahl von "größeren von zwei Waren." Allerdings sind die meisten Eiablage bevorzugt Assays sind nicht praktisch, wenn man will, eine systematische genetische Screening-Ansatz zu übernehmen für die Schaltung Basis zu suchen, diese einfache Entscheidungsprozess zugrunde liegen, wie sie sind populationsbasierte und arbeitsaufwendig einzurichten. Um den Durchsatz des Studiums der Eiablage Präferenzen der einzelnen Frauen zu erhöhen, entwickelten wir individuelle Kammern, die jeweils gleichzeitig Assay Eiablage Vorlieben von bis zu dreißig Einzel sowie ein Protokoll fliegt, die jedes Weibchen sorgt für eine hohe Eiablagerate (so dass ihre Präferenz ist leicht erkennbar und überzeugender). Unser Ansatz ist einfach auszuführenund produziert sehr konsistente Ergebnisse. Darüber hinaus können diese Kammern mit verschiedenen Aufsätzen ausgestattet werden, um Video die Eiablage Tiere Aufnahme zu ermöglichen und Licht für die Optogenetik Studien zu liefern. Dieser Artikel enthält die Baupläne für diese Kammern Herstellung und das Verfahren zur Herstellung der Fliegen in diesen Kammern untersucht werden.
Protocol
1. Flies Vorbereitung zu test
- Kultur fliegt auf Standard-Melasse / cornmeal Medien bei Inkubator bei 25 ° C und 65% Luftfeuchtigkeit. Achten Sie darauf, nicht die Fläschchen überfüllen. Zum Beispiel setzen 8 Frauen und 6 Männer in einen schmalen Essen Fläschchen.
Hinweis: Die "narrow Essen Fläschchen" verwendet hier einen Innendurchmesser von 2,3 cm. Wir typischerweise etwa 10 ml fly Nahrung in jedem Fläschchen abgefüllt. Die Fliege Essen Rezept wir verwendet wird hier beschrieben: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 Tage nach dem Schlüpfen Weibchen, bereiten Fläschchen mit frischer Hefe - Paste in 1E , wie dargestellt. Machen Frischhefe Paste durch 6 g aktiver Hefe-Mischung mit 10 ml von 0,5% Propionsäure. Verwenden Sie einen Spachtel, um den Hefe-Paste auf die Seitenwand der Lebensmittel Fläschchen anzuwenden. Sammeln Sie 30 - 35 geschlüpften Weibchen zusammen mit 20 bis 25 Männer in die Fläschchen.
- Im Allgemeinen sammeln die Männchen von den gleichen Fläschchen, wo die Weibchen gesammelt werden(So wie die Zeit und Mühe zu sparen). Wenn es jedoch Besorgnis über die Fruchtbarkeit von Männern ist, verwenden WT männlichen statt. Auch Hefe-Paste ist wichtig für die Stimulierung der Eierproduktion ist es daher bereiten täglich frisch.
- Aufrechterhaltung der gesammelten Weibchen / Männchen bei 25 ° C, 65% Luftfeuchtigkeit, es sei denn, die Fliegen Temperatur empfindlich sind.
- Nach ca. 4 - 5 Tagen überprüfen Sie die Fläschchen zu sehen, ob Frauen bereit für Eiablage Experimente sind. Sie sind bereit , wenn die Oberfläche des Nahrungsmittel Medium nass von Larven ist aktiv in der Lebensmittel gräbt (siehe Abbildung 1 E - F).
Hinweis: Frauen vorenthalten Regel Eier zu legen, wenn die Nahrungsmitteloberfläche nass wird und kriecht mit Larven. Dieser Schritt stellt sicher , dass Frauen bereit sein würde , viele Eier zu legen , wenn sie Substrate mit der gewünschten Textur auftreten (z. B. ~ 1% Agarose).
2. Kammer Konstruktion, Montage, Test-Setup
- Haben Sie einen Maschinenhalle bauen Acryl Eiablage Kammern (FiAbbildung 1A - D). Die technische Zeichnung der verschiedenen Stücke wurden in Ergänzungs gezeigt . 1 - 3 Bilder mit hoher Auflösung können auch hier bestellt werden (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Kunststoffplatten in die Lade (oben) Stück der Kammer ein , wie in 1C gezeigt. Dies dient als Bodenfläche während des Ladens in einzelne Eiablage Arenen fliegt.
- Anesthetize Weibchen auf einem CO 2 Pad und laden Sie sie einzeln in jedem Eiablage Arena. Lassen Sie ~ 30 min für Fliegen aus dem CO 2 zu erholen und an die neue Umgebung gewöhnt zu werden.
- Bereiten Sie die Agarose-Substrate.
- Der Einfachheit halber halten eine premade Flasche geschmolzen 1% Agarose in einem 55 C-Wasserbad °.
- Fügen Sie die gewünschte Menge an Lager Saccharose-Lösung (2 M) in eine 50 ml konischen Röhrchen und mit Hilfe einer entsprechenden Menge an Agarose gemischt werden. Um zum Beispiel die 150 mM Saccharose Substrat, pla vorzubereitence 750 ul 2 M Saccharose-Lösung in das Röhrchen und füllen Sie dann das Rohr mit Agarose zur 10 ml-Markierung.
- Bereiten Sie die Ebene Substrat auf die gleiche Weise, aber mit destilliertem Wasser anstelle von Saccharose-Lösung.
Anmerkung: Die Endkonzentration an Agarose in diesem Protokoll als 1% etwas weniger ist. Nach unserer Erfahrung ist die genaue Konzentration der Agarose nicht so lange egal, wie es innerhalb von ~ 0,9 geregelt wird - 1,1%, und dass die beiden Substrate sind von der gleichen Agarose-Konzentration.
- Nehmen Sie das Substrat (Boden) Stück der Kammer und Pipetten 1000 ul Agarose Substrat in jeder Wanne , wie in Figur 1D zu sehen.
- Lassen Sie Agarose für ~ 30 min zu verfestigen.
- Nachdem die Agarose-Substrate und Fliegen bereit sind, montieren alle drei Teile des Eiablagekammer und dann die Kunststoffplatten herausnehmen.
- Legen Sie die Kammern in der Fliege Inkubatoren.
Anmerkung: Die Länge des Eiablage Experimenten variieren kann auf expe jerimental Bedürfnisse. Wir laufen in der Regel das Experiment O / N (14 bis 16 h). Auch keine wesentlichen Auswirkungen der zirkadianen Timing auf Eiablage Präferenzen beobachtet. - Anästhesieren Weibchen von CO 2 in die Kammer eingespritzt wird . Zerlegen Sie die Kammer, werfen Sie die betäubten Fliegen in Fliegen Leichenschauhaus (dh., Ein leerer Kaffee kann mit etwas Maisöl gefüllt). Machen Sie Fotos von den Ergebnissen für Recordkeeping (siehe Abbildung 2).
- Zähle die Anzahl der Eier manuell und berechnen Vorzugs Indizes für die Analyse. Berechnen Präferenz Index wie (N a - N b) / (N + a N b) , wobei N a und N b repräsentieren Anzahl der Eier vor Ort gegen Seite b verbunden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Eiablage Kammern bestehen aus mehreren Teilen zusammengesetzt: ein Substrat (unten) Stück, einen Teiler (Mitte) Stück, eine Lade (oben) Stück, und 2 Schiebetüren (1A - D). Diese Stücke werden verwendet , um unabhängig Setup Fliegen und Substraten vor Eiablage Experimenten. 1F zeigt , wie Fläschchen aussehen sollte , wenn weibliche Fliegen bereit für Eiablage sind. Wenn Fliegen eine Wahl zwischen einem einfachen und einem Substrat Saccharose-haltige Substrat gegeben sind, bevorzugt Frauen robust die Ebene Substrat für Eiablage , wie in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 1. Eiablage Chambers und Eiablage - Protokoll. (A) Voll Eikammer GLEIS montiert. (B) Zerlegt Stücke. a: das Ladestück (oben), b:Teiler Stück (Mitte), c: das Substrat (unten) Stück. Technische Zeichnungen dieser Stücke sind in Ergänzungs 1 gezeigt -. 3 (C) Das Ladestück der Kammer. a ': Schiebetüren, ein ":.. Schienen Die Kunststoffplatten in den Ladestück eingesetzt werden als Boden dienen die geladenen Fliegen in Position zu halten Wir typischerweise Farbbänder auf den Rand der Kunststoffplatten setzen (roter Pfeil). (D) das Substrat (Boden) und der Trennwand (Mitte) Stücke der Kammer. Agarose in einzelne Mulden abgelagert als Eiablage Substrate (Pfeile) zu dienen. Quadrilateral umreißt die Eiablage Arena für eine einzelne Fliege. (E ) Tag 0 gesammelter Weibchen / Männchen in einem yeasted Phiole (F) Tag 4 -.. 5 gesammelter Weibchen / Männchen in einem yeasted Phiole zu beachten , dass Larven und erwachsene Frauen die meisten der Hefe und der Oberfläche der Lebensmittel gegessen haben geworden von Larven besetzt. Die nasse Oberfläche Nahrung mit Larven kriechen verhindert Weibchen mehr Eier in das Fläschchen zu legen. (G) Schematische Darstellung des Protokolls für Eiablageverhalten Experimente einrichten. (Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen)
Abbildung 2. Repräsentative Eiablage Ergebnisse für Flies Die Wahl zwischen Sucrose und Plain Substrate. (A) Seitenansicht der Eiablage Ergebnisse von Wildtyp fliegt , wenn sie die Wahl zwischen Saccharose (150 mM) und Plain Substrate gegeben wurden. White-Box skizziert ein Eiablage Arena für eine einzelne Fliege. (B) Draufsicht der Eiablage Ergebnisse. White-Box skizziert ein Eiablage Arena für eine einzelne Fliege. (C) Preference Index ( PI) von Wildtyp fliegt, wenn zwischen einem Saccharose-haltige Substrat und einem einfachen Substrat zu wählen gefragt. PI für jeden weiblichen wird wie folgt berechnet: (Anzahl der Eier auf Saccharose Substrat - Anzahl der Eier auf der Ebene Substrate) / Gesamtzahl der Eier. Fehlerbalken zeigt SEM. (Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen)
Ergänzende Abbildung S1 Technische Zeichnungen für den Teiler und dem Substratstück der Kammer.. (A - A ") Verschiedene Ansichten des Substrats Stück der Kammer. (B - B ') Verschiedene Ansichten des Mittelteiler Stück der Kammer.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (Bitte klicken Sie hier, um diese Datei zum Herunterladen)
Ergänzende Abbildung S2 Technische Zeichnungen für das Ladestück der Kammer.. (A - A ') Verschiedene Ansichten der oberen Schicht des Ladestück der Kammer. . (B - B ') Verschiedene Ansichten der unteren Schicht des Ladestück der Kammer (Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen)
Ergänzende Abbildung S3.
Ergänzende Abbildung S4. Zubehör und Anpassung der Eiablage Chambers. (A) Eiablage mit Kameras Videoaufzeichnung ausgestattet Kammern fliegt während Eiablage Experimente 13. Ctrax 14 mit Verlängerung 12 wird verwendet , wird verwendet , um die Fliegen und benutzerdefinierte MATLAB - Code zu verfolgen die Flugbahnen zu zeichnen. (B) Setup - Eiablage Substrate mit rotem ligh zu beleuchten t. LEDs (1) an einen LED-Treiber (2) verbunden ist. LED-Intensität wird durch den Mikrocontroller (3) gesteuert wird. Weitere Informationen über die Kamera, Licht - Abgabesystem und Tracking - Tiere in abnormal Lichtverhältnissen finden Zhu et al. und Stern et al. (C) Rote LEDs (Licht aus) , die an Anfang der Eiablage Kammern. (D) Rote LEDs (Licht) , die an Anfang der Eiablage Kammern. Die LED - Intensität der roten LEDs wird typischerweise bei etwa 7 bis - 10 & mgr; W / mm bei CsChrimson 15 verwendet wird , um die Neuronen zu aktivieren. (E) Eiablage Kammern ausgestattet mit Kameras und LEDs zur Videoaufzeichnung Fliegen während der Experimente mit rotem Licht (Licht aus). (F) Eiablage Kammern ausgestattet mit Kameras und LEDs zur Videoaufzeichnung Fliegen während der Experimente mit rotem Licht (Licht). (t: 28px; "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier um diese Datei herunterzuladen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Kammern und Protokolle hier beschrieben haben mehrere Verbesserungen gegenüber früheren Eiablage Assays. Erstens erhöhen sie den Durchsatz erheblich Präferenzen der einzelnen Tiere Untersuchung. Jede Kammer kann 30 einzelne Frauen-Assay und es dauert weniger als eine Stunde einzurichten. Zweitens erhöhen sie die Konsistenz der Eiablage Präferenzen gegenüber früheren Methoden. Die Standardisierung der Abmessungen der Arena, Größe der Eiablage Substrate und Abstand zwischen den Substraten macht es leichter, die Ergebnisse zwischen verschiedenen experimentellen Tagen zu vergleichen und aus verschiedenen Forschungsgruppen. Drittens können die Kammern mit Anhängen versehen werden , um eine zusätzliche Analyse aufnehmen will (Supplementary Abbildung 4) zu verfolgen. Zum Beispiel für Verhaltensanalyse, Videokameras können an der Oberseite der Kammer angebracht werden , um die Fliegen zu erfassen 7,11-13. Am wichtigsten ist, ist dieser Ansatz skalierbar. Diese Kammern sind relativ inexNachdenklich mit Hilfe einer Maschinenhalle zu erzeugen. Auch dauert es in der Regel ein Facharbeiter weniger als 2 Stunden zur Einrichtung 5 Kammern (150 einzelne Frauen) im Wert von Eiablage Assays.
Einer der wichtigsten Faktoren bei der Eiablage bevorzugt von alleinstehenden Frauen zu studieren ist, um sicherzustellen, dass jedes Weibchen viele Eier zu legen ist grundiert. (Eine Bevorzugung von "50 vs. 0 Ei" ist viel überzeugender als ein Vorzug von "1 vs. 0 Ei"). Dieses Protokoll, wenn sie richtig ausgeführt wird, sollten regelmäßige Wildtyp-Fliegen (Kanton S und w1118) erlauben mindestens 50 Eier / pro Weibchen O / N zu legen. Mehrere Faktoren tragen Frauen mit hohem Eiablagerate zu erzeugen. Zuerst sollte man darauf achten, nicht die Fläschchen / Flaschen übervölkern, wenn die Weibchen Kultivierung untersucht werden. Die Überfüllung erzeugt oft kleinere Larven, die in kleinere Weibchen wachsen würde, die weniger Eier legen. Zweitens sollte man sicherstellen, dass Frauen Zugang getestet werden müssen, um viel Hefe Paste, wenn Witz zusammen gemischth Männchen in der Lebensmittel-Fläschchen. Es wird empfohlen, 0,5% Propionsäure anstelle von Wasser verwendet werden, Hefe Paste herzustellen, weil Propionsäure erhöht nicht nur die Eiablage aber auch Pilzinfektion in Phiolen reduziert. Drittens sollte man nicht untersuchen die Weibchen , bis die Larven / Lebensmittel Oberfläche des Lebensmittelfläschchen , wie das Bild in 1F gezeigt aussehen; wenn nicht ausreichend Eiablage beraubt, würden Frauen nicht so viele Eier legen, wenn sie in den Kammern untersucht. Beachten Sie auch, dass die Lebensmittelfläschchen verwendet hier sind die "engen Fläschchen". Wenn man Vials mit grßerem Durchmesser verwendet, muss man die Anzahl der Weibchen / Männchen zu erhöhen in der Phiole angeordnet werden, so daß die Weibchen bereit sein würde, in 4 untersucht werden - 5 Tage.
Während das hier beschriebene Protokoll Frauen Prüfung konzentriert sich speziell auf unter anderen Bedingungen Präferenz Präferenzen zwischen Saccharose und ebene Substrate, kann es Frauen zu studieren angepasst werden. " So kann beispielsweise diese Kammern zu ASSA verwendet werdeny Fliegen bevorzugt , wenn zwischen den härteren und weicheren Agarose - Auswahl (z. B. 1% vs. 1,5% Agarose), sowie Substrate , die in anderen chemosensory cues unterscheiden (z. B. 3% Essigsäure). Wenn mit Deckel ausgestattet, der LED enthält einen oder beide Substrate zu beleuchten, kann die Kammer auch eine effiziente Plattform zur optogenetische Studien (Supplementary Abbildung 4) durchzuführen.
Schließlich ist es erwähnenswert, dass , obwohl diese Einrichtung für die Analyse von Eiablage Präferenzen von Drosophila höheren Durchsatz erlaubt es , einige wichtige Einschränkungen. Zuerst wird die feste Dimension der Kammern begrenzt die Flexibilität des Verhaltensassay. Zum Beispiel müssen eine neue Kammern zu machen , um zu testen , wie andere Parameter (z. B. Abstand zwischen den Substraten) , um die Eiablage Präferenzen von Fliegen beeinflussen können. Darüber hinaus hat dieses System nicht die komplexen Umgebung Drosophila Begegnung in der freien Natur zu erfassen. Es ist sehr selten, dass zwischen einem reinen Saccharose Substrat im Vergleich zu einem reinen Ebene Substrat für Eiablage in der Natur zu entscheiden, müssen fliegt. Während also unser Test bei der Untersuchung der neuronalen Grundlage eines einfachen Entscheidungsaufgabe effizient ist, muss man sich bewusst sein, dass die spezifischen "Entscheidungen" Frauen in unserer Kammern machen nicht ethologisch relevant sein können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
