Abstract
Nylig har egg-legging preferanse for Drosophila dukket opp som en genetisk medgjørlig modell for å studere nevrale grunnlaget for enkle beslutningsprosesser. Når du velger steder å sette eggene sine, kvinnelige fluer er i stand til vurdering den relative attraktiviteten av sine alternativer og velge de "største av to goder." Men de fleste egg-legging preferanse analysene er ikke praktisk hvis man ønsker å ta en systematisk genetisk screening tilnærming for å søke etter kretsen grunnlaget bak denne enkle beslutningsprosessen, som de er populasjonsbasert og arbeidskrevende å sette opp. For å øke gjennomstrømningen av å studere av egg-leggende preferansene enkelt kvinner, utviklet vi tilpassede kamre som hver kan samtidig analyse egg-leggende preferanser på opp til tretti enkelte fluer, samt en protokoll som sikrer at hver hunn har en høy eggleggingen hastighet (slik at deres preferanser er lett merkbar og mer overbevisende). Vår tilnærming er enkel å utføreog produserer svært konsistente resultater. I tillegg kan disse kamrene være utstyrt med ulike vedlegg for å tillate videoopptak egg-legging dyr og å levere lys for optogenetics studier. Denne artikkelen inneholder skissene for tilvirkning av disse kamre og fremgangsmåten for fremstilling av fluene som skal bli undersøkt i disse kamrene.
Protocol
1. Klar Fluer som skal analyseres
- Kultur flyr på standard melasse / cornmeal media på inkubator satt ved 25 ° C og 65% luftfuktighet. Pass på å ikke overfylle hetteglassene. For eksempel sette 8 kvinner og 6 menn inn i en smal mat hetteglass.
Merk: "smal mat hetteglass" brukes her har en indre diameter på 2,3 cm. Vi vanligvis utlevert ca 10 ml fly mat i hvert hetteglass. Flua mat oppskrift vi brukte er beskrevet her: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 dager etter hunner eklosjonshormon, forberede ampuller med fersk gjær lim som vist i figur 1E. Gjøre fersk gjær pasta ved å blande 6 g av aktiv gjær med 10 ml 0,5% propionsyre. Bruke en spatel for å anvende gjærpasta på sideveggen av mat ampuller. Samle 30 - 35 eclosed hunner sammen med 20 - 25 menn i hetteglassene.
- Generelt samle menn fra samme hetteglass der hunnene samles(Slik som å spare tid og krefter). Men hvis det er bekymring for fruktbarheten av menn, bruker WT hanner i stedet. Dessuten er gjær lim viktig for å stimulere eggproduksjon derfor forberede den fersk daglig.
- Opprettholde de innsamlede hunner / hanner ved 25 ° C, 65% fuktighet, med mindre fluene er temperaturfølsomme.
- Etter ~ 4 - 5 dager, sjekk hetteglassene for å se om hunnene er klar for egg-legging eksperimenter. De er klare når overflaten av maten mediet er våt av larvene aktivt gravende i mat (se figur 1E - F).
Merk: Kvinner vanligvis holde legge egg når maten overflaten blir våt og kryr av larver. Dette trinnet sikrer at kvinner ville være klar til å legge mange egg når de støter på underlag med ønsket konsistens (f.eks., ~ 1% agarose).
2. Chamber Bygg, Montasje, Analyseoppsett
- Ha en maskinverksted bygge akryl egg-legging kamre (Figur 1A - D). Prosjektering tegning av forskjellige stykker ble vist i Supplerende Figur 1 -. 3 Høyoppløselige bilder kan også bli funnet her (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Sett plastark inn i laste (øverste) del av kammeret, som vist i figur 1C. Dette fungerer som bunnflaten mens lasting flyr i individuelle egg-legging arenaer.
- Anesthetize hunner på en CO 2 pad og laste dem individuelt i hver egglegging arena. Tillat ~ 30 min for fluer å gjenopprette fra CO 2 og for å bli akklimatisert til det nye miljøet.
- Forbered agarose underlag.
- For enkelthets skyld, holde en forhåndslagde flaske smeltet 1% agarose i et 55 ° C vannbad.
- Legge til den ønskede mengde av lager sukrose-løsning (2 M) inn i et 50 ml konisk rør og blande det med passende mengde av agarose. For eksempel, for å fremstille 150 mM sukrose substrat, place fylle 750 ul 2 M sukrose løsning inn i røret og deretter røret med agarose til 10 ml merket.
- Fremstille vanlig underlaget på samme måte, men destillert vann i stedet for sukrose-løsning.
Merk: Den endelige konsentrasjonen av agarose i denne protokollen er litt mindre enn 1%. I vår erfaring, ikke den nøyaktige konsentrasjonen av agarose ingen rolle så lenge som det styres til å være innenfor ~ 0,9 til 1,1%, og at de to substrater er av samme agarose konsentrasjon.
- Ta substratet (nederst) del av kammeret og pipetten 1000 pl av agarose substratet inn i hvert trau som vist i figur 1D.
- Tillat agarose for å stivne for ~ 30 min.
- Når agarose underlag og fluer er klar, montere alle tre stykker av egg-legging kammer og deretter ta ut plast ark.
- Plasser kamrene i flue inkubatorer.
Merk: Lengde på egg-legging eksperimenter kan variere avhengig av erfarimental behov. Vi typisk kjøre eksperimentet O / N (14-16 timer). Dessuten ble det ikke observert noen signifikant effekt av circadian timing på egg-legging preferanser. - Bedøve hunner ved å injisere CO 2 inn i kammeret. Demonter kammeret, forkaste de bedøvede fluer i fly likhuset (ie., Kan en tom kaffe fylt med litt maisolje). Ta bilder av resultatene for journalføring (se figur 2).
- Tell antall egg manuelt og beregne preferanseindekser for analyse. Beregn preferanse indeks (N a - N b) / (N a + N b) der N en og N b representerer antall egg på stedet en vs. nettstedet b, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Egg-legging kamre er sammensatt av flere deler: et substrat (nederst) brikke, en skillelinje (midten) brikke, en laste (øverst) stykket, og 2 skyvedører (Figur 1A - D). Disse brikkene er vant til selvstendig oppsett fluer og underlag før egg-legging eksperimenter. Figur 1F viser hvordan ampuller bør se når kvinnelige fluer er klar for egglegging. Når fluer er gitt et valg mellom en vanlig substrat og en sukrose-holdig substrat, hunner robust foretrekkes det vanlig substrat for egglegging som vist i figur 2.
Figur 1. Egg-legging Chambers og Eggleggingen protokollen. (A) Ferdig montert egg -laying kammeret. (B) demonteres stykker. a: lasting stykke (øverst), b: dendivider stykke (i midten), c: underlaget (nederst) stykke. Tegninger av disse bitene er vist i Tilleggs Figur 1 -. 3 (C) for lasting del av kammeret. en ': skyvedører, en ":.. skinner De plast ark satt inn i laste stykke å tjene som et gulv for å holde lastet fluer på plass Vi vanligvis sette fargebånd på kanten av plast ark (rød pil). (D) et substrat (nederst) og deleren (i midten) stykker av kammeret. Agarose er deponert i de enkelte trau for å tjene som egg-leggende substrater (piler). Quadrilateral skisserer eggleggingen arena for et enkelt fly. (E ) dag 0 innsamlede hunner / hanner i en yeasted ampulle (F) dag 4 -.. 5 innsamlede hunner / hanner i en yeasted ampulle Legg merke til at larver og voksne kvinner har spist mesteparten av gjær og overflaten av maten har blitt okkupert av larver. Den våte underlag mat kryr av larver hindrer kvinner fra å legge flere egg i hetteglasset. (G) Skjematisk viser protokollen for å sette opp egg-legging atferdseksperimenter. (Klikk her for å se en større versjon av denne figuren)
Figur 2. Representant Eggleggingen Resultater for Fluer Velge mellom Sukrose og Plain Underlag. (A) fra siden av egg-legging resultatene av villtype flyr når de fikk valget mellom sukrose (150 mm) og vanlig underlag. Hvite boksen skisserer en egg-legging arena for en enkelt fly. (B) ovenfra egg-legging resultater. Hvite boksen skisserer en egg-legging arena for en enkelt fly. (C) Preference indeks ( PI) av villtype flyr da bedt om å velge mellom en sukrose-inneholdende substrat og et vanlig substrat. PI for hver kvinne er beregnet som følger: (antall egg på sukrose underlaget - antall egg på vanlig underlag) / totalt antall egg. Feil bar indikerer SEM. (Klikk her for å se en større versjon av denne figuren)
Supplerende Figur S1 Tekniske tegninger for Divider og underlaget Piece av handelskammeret.. (A - A ") Forskjellige visninger av underlaget stykke kammeret. (B - B ') Ulike utsikt over midten skillelinjen stykke kammeret.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (Klikk her for å laste ned denne filen)
Supplerende Figur S2 Tekniske tegninger for Loading Piece av handelskammeret.. (A - A ') Forskjellige visninger av det øvre laget av laste stykke kammeret. . (B - B ') Ulike utsikt over bunnlaget av laste stykke kammeret (Klikk her for å laste ned denne filen)
Supplerende Figur S3.
Supplerende Figur S4. Tilbehør og tilpasning av Egg-legging Chambers. (A) Eggleggingen kamre utstyrt med kamera til video-opptak flyr under egg-legging eksperimenter 13. Ctrax 14 med forlengelse 12 brukes til å spore fluer og tilpassede MATLAB koden brukes til å plotte baner. (B) Oppsett for å belyse egg-legging substrater med rød ligh t. Lysdioder (1) er forbundet med en LED-driver (2). Lampeintensiteten er kontrollert av mikrokontroller (3). For mer informasjon om kameraet, lysutleveringssystem og sporing dyr i unormale lysforhold, se Zhu et al. og Stern et al. (C) Rød LED (lys av) festet til toppen av egg-legging kamre. (D) Røde LED (lys på) som er festet til toppen av egg-legging kamre. LED intensitet røde lysdioder er vanligvis satt til å være rundt 7-10 μW / mm når CsChrimson 15 brukes til å aktivere nervecellene. (E) Eggleggingen kamre utstyrt med kamera og LED til video rekord fluer under forsøkene med rødt lys (lys av). (F) Eggleggingen kamre utstyrt med kamera og LED til video rekord fluer under forsøkene med rødt lys (lys på). (t: 28px; "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned denne filen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kamrene og protokoller som er beskrevet her har flere forbedringer fra forrige egg-legging analyser. For det første øker de gjennomstrømningen for å analysere preferanser av enkelt dyr betydelig. Hvert kammer kan analysere 30 enslige kvinner, og det tar mindre enn en time å sette opp. For det andre øker de konsistensen av egg-legging preferanser over tidligere metoder. Standardisering av dimensjonene på arenaen, størrelsen på egg-legging underlag, og avstanden mellom underlag gjør det lettere å sammenligne resultatene mellom ulike eksperimentelle dager, og fra ulike forskningsmiljøer. For det tredje kan kamrene være utstyrt med vedlegg for å imøtekomme ytterligere analyse man ønsker å forfølge (Supplementary figur 4). For eksempel, for atferdsanalyse, videokameraer kan festes til toppen av kammeret for å registrere fluene 7,11-13. Viktigst er denne tilnærmingen skalerbar. Disse kamrene er relativt inextankefull til å produsere ved hjelp av et maskinverksted. Også vanligvis tar det en faglært mindre enn 2 timer å sette opp 5 kamre (150 enslige kvinner) verdt av egg-legging analyser.
En av de mest kritiske faktorene når studerer eggleggingen preferanse for enkelt kvinner er å sikre at hver kvinne er primet å legge mange egg. (En preferanse for "50 vs. 0 egg" er mye mer overbevisende enn en preferanse for "1 vs 0 egg"). Denne protokollen, når riktig utført, bør tillate vanlige villtype fluer (Canton S og w1118) til å legge minst 50 egg / per kvinne O / N. Flere faktorer bidrar til å produsere kvinner med høy eggleggingen rate. Først bør man passe på å ikke overpopulate hetteglassene / flasker når dyrking hunnene som skal analyseres. Overbefolkning gir ofte mindre larver, noe som ville vokse inn i mindre hunner som legger færre egg. For det andre bør man sørge for at kvinner skal bli undersøkt har tilgang til rikelig med gjær lim når de blandes sammen viddh menn i maten hetteglass. Det anbefales at 0,5% propionsyre i stedet for vann anvendes for å fremstille gjærpasta fordi propionsyre øker ikke bare eggleggingen men også reduserer soppinfeksjon i ampuller. Tredje, bør man ikke analysen hunnene før larvene / mat overflaten av maten ampuller ser ut som bildet vist i figur 1F; hvis ikke tilstrekkelig egg-legging fratatt, ville kvinner ikke legge så mange egg når analysert i kamrene. Vær også oppmerksom på at mat ampuller som brukes her er "smale hetteglass". Hvis man bruker ampuller med større diameter, må man øke antallet kvinner / menn som skal plasseres i ampullen, slik at kvinner ville være klar til å bli analysert i 4 - 5 dager.
Mens den protokoll som er beskrevet her er spesielt fokuserer på å undersøke hunner preferanser mellom sukrose og vanlig underlag, kan den være innrettet til å studere hunner preferanse i andre forhold. For eksempel kan disse kamrene brukes til å ASSAy fluer 'preferanse når man velger mellom hardere og mykere agarose (f.eks., 1% mot 1,5% agarose), så vel som substrater som er forskjellige i andre chemosensory signaler (f.eks., 3% eddiksyre). Hvis utstyrt med lokk som inneholder LED til å lyse opp en eller begge substrater, kan kammeret også gi en effektiv plattform for å gjennomføre optogenetic studier (Supplementary figur 4).
Til slutt er det verdt å merke seg at selv om dette oppsettet gir høyere gjennomstrømning for å analysere egg-legging preferanser av Drosophila, har det noen viktige begrensninger. Først den faste dimensjonen av kamrene begrenser fleksibiliteten av de atferdsmessige analysen. For eksempel vil man trenger for å lage nye kamre for å teste hvordan andre parametre (f.eks., Avstand mellom substrater) kan påvirke egg-legging preferanser fluer. I tillegg vil dette systemet ikke fange opp det komplekse miljø Drosophila møte i naturen. Det er svært sjelden at fluer blir nødt til å velge mellom en ren sakkarose underlaget kontra en ren vanlig substrat for egglegging i naturen. Dermed mens vår analyse er effektiv i å studere nevrale grunnlaget for en enkel avgjørelse oppgave, må man være klar over at de spesifikke "beslutninger" kvinner gjør i våre kamre kan ikke være ethologically relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
