Abstract
В последнее время откладки яиц предпочтение дрозофилы стала генетически послушный модель для изучения нейронной основы простых процессов принятия решений. При выборе места для нанесения яйца, женщины-мухи способны ранжирования относительную привлекательность их вариантов и выбор "больше из двух товаров." Тем не менее, большинство яйцекладущие предпочтений анализы не практично, если кто-то хочет принять системный подход генетический скрининг для поиска схемы основе, лежащей в основе этого простого процесса принятия решений, так как они являются популяционном и трудоемкий в настройке. Чтобы увеличить пропускную способность изучения яйцекладущим предпочтений отдельных женщин, мы разработали специальные камеры, которые каждый из них может одновременно анализа яйцекладущие предпочтения до тридцати личности мух, а также протокол, который обеспечивает каждая самка имеет высокую скорость откладки яиц (так, что их предпочтения легко различимы и более убедительно). Наш подход прост для выполненияи производит очень стабильные результаты. Кроме того, эти камеры могут быть оснащены различными насадками, чтобы позволить видеозапись яйцекладки животных и поставить свет для исследований оптогенетика. В этой статье представлены чертежи для изготовления этих камер и порядок подготовки мух для анализа в этих камерах.
Protocol
1. Подготовка Мухи к быть проанализирован
- Культура летит на стандартных мелассы / кукурузной муки медиа в инкубатор при 25 ° C и 65% влажности. Будьте осторожны, чтобы не загромождать чаш. Например, положить 8 женщин и 6 мужчин в узкий флакон пищи.
Примечание: "узкий флакон пищи", используемый здесь, имеет внутренний диаметр 2,3 см. Как правило, мы распределяли около 10 мл зольной пищи в каждый флакон. Рецепт муха пища, которую мы использовали описано здесь: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 дня после того, как самки Eclosion, готовят флаконы с добавлением свежего дрожжевого теста , как показано на рисунке 1E. Сделать свежие дрожжи, пасты путем смешивания 6 г активных дрожжей с 10 мл 0,5% -ного пропионовой кислоты. С помощью шпателя, чтобы применить дрожжевой пасты на боковине пищевых флаконов. Соберите 30 - 35 eclosed самки вместе с 20 - 25 мужчин в ампулах.
- В общем, собирать мужчин из тех же флаконах, где собираются самки(Так, чтобы сэкономить время и усилия). Тем не менее, если есть опасения по поводу фертильности мужчин, использование WT самцов вместо этого. Кроме того, дрожжи паста имеет важное значение для стимулирования производства яиц, поэтому готовить его свежий ежедневно.
- Поддерживать собранные самок / самцов, при 25 ° C, 65% влажности, если мухи не чувствительны к температуре.
- После ~ 4 - 5 дней, проверьте чаш, чтобы увидеть, если самки готовы к яйцекладущим экспериментов. Они готовы , когда поверхность пищевого среды мокрая от личинок активно роющему в пище (см рис 1E - F).
Примечание: Женщины обычно удерживать откладывают яйца, как только еда поверхность становится влажной и кишит личинками. Этот шаг гарантирует , что женщины будут готовы выложить много яиц , когда они сталкиваются субстратов с желаемой текстуры (например., ~ 1% агарозы).
2. Камера Строительство, монтаж, настройка Анализ
- Есть машина магазин построить акриловые яйцекладка камеры (Fiфигура 1А - D). Инженерный чертеж различных частей были показаны в дополнительном рисунке 1. - 3 фотографии высокого разрешения можно найти здесь (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Вставьте пластиковые листы в погрузочной (сверху) части камеры , как показано на рисунке 1C. Это служит нижней поверхности во время загрузки летит в отдельных яйцекладущим аренах.
- Обезболить самок на CO 2 площадки и загружать их по отдельности в каждом яйцекладки арене. Разрешить ~ 30 мин для мух , чтобы оправиться от CO 2 и стать приспособились к новой среде.
- Подготовка агарозном субстратов.
- Для удобства держать Premade бутылку растопленного 1% агарозы в C водяной бане при 55 °.
- Добавьте необходимое количество раствора сахарозы запас (2 М) в 50 мл коническую пробирку, и смешивают его с соответствующим количеством агарозы. Например, для получения 150 мМ субстрата сахарозу, PLACE 750 мкл 2 М раствора сахарозы в пробирку, а затем заполнить трубку с агарозой до отметки 10 мл.
- Подготовьте обычную подложку таким же образом, но добавляют дистиллированную воду вместо раствора сахарозы.
Примечание: Конечная концентрация агарозы в этом протоколе немного меньше, чем на 1%. По нашему опыту, точная концентрация агарозы не имеет значения, до тех пор пока она находится под контролем, чтобы быть в пределах ~ 0,9 - 1,1%, и что две подложки имеют одинаковую агарозном концентрации.
- Возьмем субстрат (нижняя) часть камеры и пипеткой 1000 мкл агарозном субстрата в каждую желобом , как показано на рисунке 1D.
- Разрешить агарозном затвердевать в течение ~ 30 мин.
- После агарозном субстраты и мухи будут готовы, собрать все три части камеры откладки яиц, а затем вынуть пластмассовые листы.
- Поместите камеры в золе инкубаторах.
Примечание: Длина яйцекладущим экспериментов может варьироваться в зависимости от EXPErimental потребности. Как правило, мы запустить эксперимент O / N (14 - 16 ч). Кроме того, не наблюдалось значительного влияния циркадного времени на яйцекладущим предпочтений. - Обезболить женщин путем введения CO 2 в камеру. Разберите камеру, удалите анестезированных мух в морге мух (то есть., Пустой кофе может заполнены с некоторыми кукурузного масла). Сфотографируйте результатов для ведения записей (см рисунок 2).
- Подсчитайте количество яиц вручную и вычислить привилегированные показатели для анализа. Вычислить индекс предпочтения как (N A - N б) / (N A + N б) где N а и N B представляют количество яиц на участке площадью по сравнению с сайта B, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Яйцекладки камеры состоят из нескольких частей: подложку (нижний) кусок, разделитель (средний) часть, погрузочную (сверху) часть и 2 раздвижные двери (рис 1A - D). Эти части используются для установки независимо друг от друга мух и основы перед яйцекладущим экспериментов. Рисунок 1F показывает , как пузырьки должны выглядеть , когда женские мухи готовы к яйцекладки. Когда мухи дают выбор между простой подложкой и содержащей сахарозу субстрат, самки энергично отдает предпочтение простой субстрат для откладки яиц , как показано на рисунке 2.
Рисунок 1. яйцекладка Камеры и откладки яиц протокол. (A) Полностью собранный яйцо -laying камеру. (B) Разобранный штук. а: погрузка часть (верхняя часть), B:разделитель частей (средний), с: подложка (нижняя) часть. Инженерные чертежи этих частей, показаны на рисунке 1 Дополнительной -. 3 (С) Загрузочная часть камеры. а ': раздвижные двери, символ ":.. рельсам пластиковые листы вставляются в загрузочную часть, чтобы служить в качестве пола, чтобы сохранить загруженные мух на месте Мы обычно поместить цветные ленты на край пластиковых листов (красная стрелка). (D) Основание (дно) и делитель (средний) частей камеры. Агарозном осаждается на отдельные желобов , чтобы служить в качестве яйцекладущим субстратов (стрелки). Четырехугольник контуры откладки яиц арену для одного лету. (E ) День 0 собранных женщин / мужчин в дрожжевого флакона () День F 4 -.. 5 из собранных самок / самцов в дрожжевого ампулу Обратите внимание , что личинки и взрослые самки съели большинство дрожжей и поверхность пищевого продукта , стала занятая личинок, Влажная поверхность еды кишит личинками предотвращает самок от прокладки больше яиц во флаконе. (G) Схема , изображающая протокол для создания яйцекладка экспериментов поведения. (Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры)
Рисунок 2. Представитель яйцекладка Результаты по Мух Выбор между сахарозой и Plain подложках. (A) Вид сбоку яйцекладущим результатов дикого типа мух , когда они получили возможность выбора между сахарозой (150 мм) и плоских подложек. Белая коробка описывает одну откладки яиц арену для одной мухи. (B) Вид сверху яйцекладущим результатов. Белая коробка описывает одну откладки яиц арену для одной мухи. (C) индекс предпочтений ( ПИ) дикого типа мух, когда их просят выбрать между содержащей сахарозу подложкой и простой подложкой. PI для каждой самки рассчитывается следующим образом: (количество яиц на субстрат сахарозы - количество яиц на равнине субстратов) / общее количество яиц. Бар ошибки указывает на SEM. (Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры)
Дополнительный рисунок S1 инженерные чертежи для разделительной перегородки и подложки Кусок палаты.. (А - А ") разные взгляды подложки части камеры. (B - B ') Различные виды среднего делителя части камеры.d / 53716 / Supplemental1.jpg "стиль =" размер шрифта: 14px; высота линии: 28px; "мишень =" _blank "> (Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл)
Дополнительный рисунок S2 инженерные чертежи для загрузки Кусок палаты.. (А - А ') различные представления верхнего слоя загрузки части камеры. . (B - B ') Различные виды нижнего слоя загрузочной части камеры (Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл)
Дополнительный рисунок S3.
Дополнительное Рисунок S4. Аксессуары и настройка яйцекладка камер. (A) яйцекладка камеры , оснащенные камерами для записи видео во время летит яйцекладущим экспериментов 13. Ctrax 14 с расширением 12 используется для отслеживания мух и пользовательский код MATLAB используется для построения траектории. (B) Установка для освещения яйцекладка субстратов с красным светодиодные т. Светодиоды (1) соединены с водителем СИД (2). LED интенсивность управляется микроконтроллером (3). Для получения дополнительной информации о камере, световой системы доставки и отслеживания животных в аномальных условиях освещения, см Чжу и др. и Стерн и др. (C) Красные светодиоды (розжига) , прикрепленные к верхней части яйцекладущим камер. (D) Красные светодиоды (свет на) , прикрепленных к верхней части яйцекладущим камер. Индикатор интенсивности красных светодиодов обычно устанавливается , чтобы быть около 7 - 10 мкВт / мм при CsChrimson 15 используется для активации нейронов. (E) яйцекладка камеры , оснащенные камерами и светодиодами для видео запись мух в ходе экспериментов с красным светом (свет выключен). (F) яйцекладка камеры , оснащенные камерами и светодиодами для видео запись мух в ходе экспериментов с красным светом (светом). (т: 28px; "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Камеры и протоколы, описанные здесь, имеют ряд усовершенствований по сравнению с предыдущими яйцекладущим анализов. Во-первых, они повышают пропускную способность опробование предпочтения одиночных животных значительно. Каждая камера может пробирной 30 одиночных самок, и это занимает меньше часа, чтобы установить. Во-вторых, они повышают согласованность яйцекладущим предпочтений по сравнению с предыдущими методами. Стандартизация размеров арены, размер яйцекладущим подложек, а также расстояние между подложками облегчает сравнение результатов между различными экспериментальными дней и от разных исследовательских групп. В- третьих, камеры могут быть установлены с приложениями для размещения дополнительного анализа один хочет продолжить (Дополнительный рисунок 4). Например, для анализа поведения, видеокамеры могут быть прикреплены к верхней части камеры для записи мух 7,11-13. Самое главное, что этот подход является масштабируемым. Эти камеры являются относительно Инексзадумчивый производить с помощью механического цеха. Кроме того, он обычно принимает квалифицированный рабочий менее 2 ч, чтобы установить 5 камер (150 одиноких женщин) на сумму яйцекладущим анализов.
Одним из наиболее важных факторов при изучении откладки яиц предпочтение отдельных самок, чтобы гарантировать, что каждая самка грунтуется заложить много яиц. (А предпочтение "50 против 0 яйца» гораздо более убедительны, чем предпочтения "1 против 0 яйца"). Этот протокол, при правильном выполнении, должны позволить регулярные мух дикого типа (Canton S и w1118) прокладывать по меньшей мере, 50 яиц / в женском O / N. Несколько факторов способствуют производству самок с высокой скоростью откладки яиц. Во-первых, следует позаботиться, чтобы не перенаселять Флаконы / бутылки при культивировании самки, которые будут проанализированы. Скученность часто приводит к меньшим личинок, которые будут расти на более мелкие самки, которые откладывают меньше яиц. Во-вторых, необходимо убедиться, что женщины должны быть исследованные имеют доступ к большим количеством дрожжей пасты при смешивании вместе остроумиеч самцы в пищевой флаконах. Рекомендуется 0,5% пропионовой кислоты вместо воды можно использовать для получения дрожжевой пасты из-пропионовой кислоты, не только увеличивает откладки яиц, но и уменьшает грибковой инфекции во флаконах. В- третьих, не должна проверять самок до тех пор , личинки / пищевой поверхности пищевого продукта Флаконы выглядят как картина , показанная на рисунке 1F; если не в достаточной степени яйцекладки лишались, самки не лежал, как много яиц, при испытании в камерах. Кроме того, обратите внимание, что пищевые Флаконы, используемые здесь, являются "узкие ампул". Если использовать ампул с большим диаметром, необходимо увеличить число женщин / мужчин, которые будут помещены в пробирку так, что самки будут готовы для анализа в 4 - 5 дней.
В то время как протокол, описанный здесь, в частности, фокусируется на изучении самок предпочтения между сахарозой и простые субстраты, она может быть приспособлена для изучения самок предпочтение в других условиях. Например, эти камеры могут быть использованы для Ассапредпочтение Y мух при выборе между более твердой и мягкой агарозы (например., 1% против 1,5% агарозы), а также субстраты , которые отличаются в других хемосенсорных репликами (например., 3% уксусной кислоты). Если оснащен крышкой , которая содержит LED для освещения одного или обоих субстратов, камера может также обеспечивать эффективную платформу для проведения оптогенетика исследований (Дополнительный рисунок 4).
Наконец, стоит отметить , что , хотя эта установка позволяет более высокую пропускную способность для анализа яйцекладка предпочтения дрозофилы, у него есть некоторые важные ограничения. Во-первых, фиксированный размер камер ограничивает гибкость поведенческого анализа. Например, один нужно будет сделать новые камеры для того , чтобы проверить , как другие параметры (например., Расстояние между подложками) может повлиять на яйцекладка предпочтения мух. Кроме того, эта система не отражает сложной среде Drosophila встречи в дикой природе, Очень редко, летающая придется выбирать между чистой сахарозы субстрата по сравнению с чистой простой субстрат для откладки яиц в природе. Таким образом, в то время как наш анализ является эффективным при изучении нейронной основы простого решения задачи, необходимо иметь в виду, что конкретные "решения" женщины делают в наших камерах не могут быть ethologically актуальны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
