Abstract
Recientemente, la preferencia de la puesta de huevos de Drosophila se ha convertido en un modelo manejable de forma genética para estudiar la base neural de los procesos de toma de decisiones simples. Cuando la selección de sitios para depositar sus huevos, las moscas hembras son capaces de clasificar el atractivo relativo de sus opciones y elegir el "mayor de dos bienes." Sin embargo, la mayoría de los ensayos de preferencia que ponen huevos no son prácticos si se quiere adoptar un enfoque sistemático para la detección genética buscar la base de circuito que subyace a este sencillo proceso de toma de decisiones, ya que son laboriosos y configurar basado en la población. Para aumentar el rendimiento de estudiar las preferencias puesta de huevos de las hembras individuales, desarrollamos cámaras personalizadas que cada uno puede al mismo tiempo de ensayo preferencias de la puesta de huevos de hasta treinta individuo moscas, así como un protocolo que asegura cada mujer tiene una alta tasa de puesta de huevos (de modo que su preferencia es fácilmente discernible y más convincente). Nuestro enfoque es sencillo de ejecutary produce resultados muy coherentes. Además, estas cámaras pueden equiparse con diferentes accesorios para permitir la grabación de vídeo a los animales ovíparos y para suministrar luz para los estudios de la optogenética. Este artículo proporciona los planos para la fabricación de estas cámaras y el procedimiento para la preparación de las moscas para ser ensayadas en estas cámaras.
Protocol
1. Preparación de moscas a ensayar
- Cultura vuela de melaza estándar / media de harina de maíz en incubadora a 25 ° C y 65% de humedad. Tenga cuidado de no saturar los viales. Por ejemplo, poner 8 mujeres y 6 hombres en un vial de alimentos estrecho.
Nota: El "estrecho vial comida" usado aquí tiene un diámetro interior de 2,3 cm. Nosotros generalmente pueden obtenerse unos 10 ml de alimentos mosca en cada vial. La receta de comida mosca hemos utilizado se describe aquí: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 días después de la eclosión hembras, preparar viales con pasta de levadura fresca como se muestra en la Figura 1E. Hacer pasta de levadura fresca mediante la mezcla de 6 g de levadura activa con 10 ml de ácido propiónico 0,5%. Utilice una espátula para aplicar la pasta de levadura sobre la pared lateral de los viales de alimentos. Recoger 30 - 35 hembras eclosed junto con 20 - 25 machos en los viales.
- En general, recoger los machos de las mismas viales donde se recogen las hembras(Con el fin de ahorrar tiempo y esfuerzo). Sin embargo, si hay preocupación acerca de la fertilidad de los machos, machos WT utilizar en su lugar. Además, la pasta de levadura es importante para estimular la producción de huevos, por lo tanto prepararlo fresco todos los días.
- Mantener las hembras / machos recolectados a 25 ° C, 65% de humedad, a menos que las moscas son sensibles a la temperatura.
- Después de ~ 4 - 5 días, consulte los viales para ver si las hembras están listas para experimentos que ponen huevos. Están listos cuando la superficie del medio de comida es mojado de larvas madriguera activamente en la comida (véase la Figura 1E - F).
Nota: Las hembras normalmente retienen poner huevos una vez que la superficie del alimento se humedece y se arrastra con larvas. Este paso asegura que las mujeres estarían dispuestas a poner muchos huevos cuando se encuentran con sustratos con textura deseada (por ejemplo., ~ 1% de agarosa).
2. Cámara de la Construcción, montaje, instalación de Ensayo
- Tener un taller mecánico construir cámaras de la puesta de huevos de acrílico (Fifigura 1A - D). El dibujo de ingeniería de diferentes piezas se muestra en la Figura 1 complementario -. 3 imágenes de alta resolución también se pueden encontrar aquí (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Inserte láminas de plástico en la carga (arriba) pieza de la cámara como se muestra en la Figura 1C. Esto sirve como la superficie inferior de carga, mientras que vuela en los ámbitos individuales que ponen huevos.
- Anestesiar a las hembras en un cojín de CO 2 y cargarlos individualmente en cada campo de la puesta de huevos. Permitir ~ 30 minutos para que las moscas se recuperan de las emisiones de CO 2 y se aclimate al nuevo entorno.
- Preparar los sustratos de agarosa.
- Para mayor comodidad, tenga una botella de prefabricados de fundido de agarosa al 1% en un baño de agua a 55 ° C.
- Añadir la cantidad deseada de solución de sacarosa (2 M) en un tubo cónico de 50 ml y se mezcla con la cantidad apropiada de agarosa. Por ejemplo, para preparar el 150 mM sustrato sacarosa, place 750 l de solución 2 M de sacarosa en el tubo y luego llenar el tubo con agarosa para la marca de 10 ml.
- Preparar el sustrato liso de la misma manera pero añadir agua destilada en lugar de solución de sacarosa.
Nota: La concentración final de agarosa en este protocolo es ligeramente menor que 1%. En nuestra experiencia, la concentración exacta de agarosa no importa con tal de que se controla para estar dentro de ~ 0,9 a 1,1% y que los dos sustratos son de la misma concentración de agarosa.
- Tomar la pieza de sustrato (parte inferior) de la cámara y la pipeta 1.000 l de sustrato de agarosa en cada cubeta como se ve en la Figura 1D.
- Permitir agarosa para solidificar durante ~ 30 min.
- Una vez que los sustratos de agarosa y las moscas están listos, el montaje de las tres piezas de la cámara de la puesta de huevos y luego sacar las láminas de plástico.
- Colocar las cámaras en las incubadoras de moscas.
Nota: La longitud de los experimentos que ponen huevos puede variar dependiendo de experimentales necesidades. normalmente se corre el experimento S / N (14 - 16 h). Además, no se observó efecto significativo de tiempo circadiano de las preferencias de la puesta de huevos. - Anestesiar a las hembras mediante la inyección de CO 2 en la cámara. Desmonte la cámara, desechar las moscas anestesiadas en la morgue mosca (es decir., Una lata vacía de café llena con un poco de aceite de maíz). Tome fotografías de los resultados de gestión de registros (véase la Figura 2).
- Contar el número de huevos de forma manual y calcular los índices de preferencia para su análisis. Calcular el índice de preferencia como (N a - N b) / (N + un N b) donde N A y N b representan el número de huevos en el sitio de un sitio vs. b, respectivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las cámaras de la puesta de huevos se componen de varias piezas: una pieza de sustrato (parte inferior), una pieza divisora (centro), una pieza de carga (parte superior), y 2 puertas correderas (Figura 1 A - D). Estas piezas se utilizan para moscas de forma independiente de configuración y los sustratos antes de los experimentos que ponen huevos. Figura 1F muestra cómo viales deben buscar cuando las moscas hembras están listas para la puesta de huevos. Cuando moscas se les da una elección entre un sustrato liso y un substrato que contiene sacarosa, hembras robustamente prefieren el sustrato plano para la puesta de huevos, como se muestra en la Figura 2.
Figura 1. Cámaras ponedoras y la puesta de huevos. Protocolo (A) de huevo totalmente montado -laying cámara. (B) piezas desmontadas. A: la pieza de carga (parte superior), b: ladivisor de pieza (medio), c: el sustrato (parte inferior) pieza. Dibujos de ingeniería de estas piezas se muestran en la Figura 1 complementario -. 3 (C) La pieza de carga de la cámara. a ': puertas, un "deslizamiento:.. rieles Las láminas de plástico se insertan en la pieza de carga para servir como un piso para mantener las moscas cargadas en su lugar nos suelen poner cintas de colores en el borde de las hojas de plástico (flecha roja). (D) el sustrato (abajo) y el divisor (medio) piezas de la cámara. la agarosa se deposita en los comederos individuales para servir como sustratos de la puesta de huevos (flechas). cuadrilátero esboza la arena puesta de huevos para una sola mosca. (e ) Día 0 de hembras / machos en un vial yeasted recogidos () Día F 4 -.. 5 de hembras / machos en un vial yeasted recogidas en cuenta que larvas y adultos hembras han comido la mayor parte de la levadura y la superficie de los alimentos se ha convertido ocupada por larvas. La comida superficie mojada que se arrastra con larvas evita que las hembras de poner más huevos en el vial. (G) Esquema que representa el protocolo para la creación de experimentos de comportamiento que ponen huevos. (Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra)
Figura 2. Resultados para Moscas El elegir entre sacarosa, casquillos de Sustratos Representante puesta de huevos. (A) Vista lateral de los resultados de la puesta de huevos de tipo salvaje vuela cuando se les dio a elegir entre la sacarosa (150 mM) y sustratos lisos. caja blanca esboza un escenario de puesta de huevos para una sola mosca. (B) Vista superior de los resultados de la puesta de huevos. caja blanca esboza un escenario de puesta de huevos para una sola mosca. (C) El índice de preferencia ( PI) de tipo salvaje vuela cuando le preguntó a elegir entre un sustrato que contiene sacarosa y un sustrato plano. PI para cada hembra se calcula como sigue: (número de huevos en el sustrato sacarosa - número de huevos en los sustratos lisos) / número total de huevos. Barra de error indica SEM. (Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra)
Diferentes vistas de la pieza divisora medio de la cámara - (B 'B) - Figura complementario S1 dibujos de ingeniería para el divisor y la pieza de sustrato de la Cámara.. (A A ") Distintas vistas de la pieza de sustrato de la cámara..d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> (Haga clic aquí para descargar este archivo)
Figura suplementaria S2 dibujos de ingeniería para la carga Pedazo de la Cámara.. (A - A ') Diferentes vistas de la capa superior de la pieza de carga de la cámara. . (B - B ') Diferentes vistas de la capa inferior de la pieza de carga de la cámara (Haga clic aquí para descargar este archivo)
Figura complementario S3.
Figura suplementaria S4. Accesorios y personalización de las Cámaras de puesta de huevos. Ponedoras cámaras (A) equipados con cámaras para grabar vídeo moscas durante los experimentos que ponen huevos 13. Ctrax 14 con prolongación 12 se utiliza para realizar un seguimiento de las moscas y la costumbre de código MATLAB se utiliza para trazar las trayectorias. (B) Configuración para iluminar los sustratos que ponen huevos con ligh rojo t. LEDs (1) están conectados a un controlador de LED (2). intensidad del LED es controlado por el microcontrolador (3). Para obtener más información acerca de la cámara, sistema de suministro de luz y rastreo de animales en condiciones de iluminación anormal, véase Zhu et al. y Stern et al. (C) Los LEDs rojos (luz apagada) unidos a la parte superior de las cámaras de la puesta de huevos. (D) LEDs rojos (luz encendida) unidos a la parte superior de las cámaras de la puesta de huevos. La intensidad del LED de LED rojos se establece normalmente en alrededor de 7 - 10 de mW / mm cuando CsChrimson 15 se utiliza para activar las neuronas. (E) La puesta de huevos cámaras equipadas con cámaras y LEDs a las moscas de grabación de video durante los experimentos con luz roja (luz apagada). (F) cámaras ponedoras equipados con cámaras y LEDs a las moscas de grabación de video durante los experimentos con luz roja (luz encendida). (t: 28px; "target =" _ blank "> Haga clic aquí para descargar este archivo)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las cámaras y los protocolos descritos aquí tienen varias mejoras con respecto a los ensayos de la puesta de huevos anteriores. En primer lugar, que aumentan el rendimiento del ensayo de las preferencias de los animales individuales de manera significativa. Cada cámara puede ensayar 30 hembras individuales y se tarda menos de una hora de configurar. En segundo lugar, aumentan la consistencia de las preferencias de la puesta de huevos respecto a los métodos anteriores. La estandarización de las dimensiones de la arena, el tamaño de los sustratos de la puesta de huevos, y la distancia entre sustratos hace que sea más fácil comparar los resultados entre los diferentes días experimentales y de diferentes grupos de investigación. En tercer lugar, las cámaras pueden ser equipados con accesorios para dar cabida a un análisis adicional que se quiere perseguir (Figura 4). Por ejemplo, para el análisis del comportamiento, las cámaras de vídeo se puede conectar a la parte superior de la cámara para grabar las moscas 7,11-13. Lo más importante, este enfoque es escalable. Estas cámaras son relativamente Inexpensativo para producir con la ayuda de un taller mecánico. Además, por lo general toma un trabajador calificado menos de 2 horas para configurar 5 cámaras (150 hembras individuales) el valor de los ensayos de la puesta de huevos.
Uno de los factores más críticos en los que estudian la preferencia de puesta de huevos de las hembras individuales es asegurar que cada mujer se prepara para poner muchos huevos. (Una preferencia de "50 frente a 0 huevo" es mucho más convincente que una preferencia de "1 vs 0 huevo"). Este protocolo, cuando se ejecuta correctamente, debe permitir que las moscas de tipo salvaje regulares (Canton S y w1118) para poner al menos 50 huevos / por hembra O / N. Varios factores contribuyen a la producción de hembras con alta tasa de puesta de huevos. En primer lugar, se debe tener cuidado de no sobrepoblar los frascos / botellas cuando el cultivo de las hembras a ensayar. El hacinamiento a menudo produce larvas más pequeñas, que se convertiría en hembras más pequeñas que ponen menos huevos. En segundo lugar, uno debe asegurarse de que las hembras para ser ensayadas tienen acceso a un montón de pasta de levadura cuando se mezclan ingenioh machos en los viales de alimentos. Se recomienda que el ácido propiónico 0,5% en lugar de agua pueden usar para preparar la pasta de levadura ya que el ácido propiónico no sólo aumenta la puesta de huevos sino que también reduce la infección por hongos en viales. En tercer lugar, no hay que ensayar las hembras hasta que la superficie larvas / alimentos de la comida viales se parecen a la imagen que se muestra en la Figura 1F; si no está suficientemente puesta de huevos privado, las hembras no poner tantos huevos cuando se ensaya en las cámaras. Además, tenga en cuenta que los viales alimentarios utilizados aquí son los "viales estrechos". Si se utiliza viales con diámetro más grande, hay que aumentar el número de hembras / machos para ser colocado en el vial de forma que las hembras estarían dispuestos a ensayar en 4 - 5 días.
Si bien el protocolo descrito aquí específicamente se centra en el examen de hembras preferencias entre sacarosa y sustratos de fricción, se puede adaptar para estudiar hembras preferencia en otras condiciones. Por ejemplo, estas cámaras se pueden utilizar para ASSAY preferencia moscas al elegir entre agarosa más duro y más blando (por ejemplo., 1% vs. 1,5% de agarosa), así como sustratos que difieren en otras señales quimiosensoriales (por ejemplo., 3% de ácido acético). Si está equipado con tapa que contiene LED para iluminar uno o ambos sustratos, la cámara también puede proporcionar una plataforma eficiente para llevar a cabo estudios de optogenética (Figura 4).
Por último, vale la pena señalar que si bien esta configuración permite un mayor rendimiento para analizar las preferencias de la puesta de huevos de Drosophila, tiene algunas limitaciones importantes. En primer lugar, la dimensión fija de las cámaras limita la flexibilidad del ensayo de comportamiento. Por ejemplo, uno tendrá que hacer nuevas cámaras con el fin de probar cómo otros parámetros (por ejemplo., Distancia entre sustratos) pueden afectar las preferencias de la puesta de huevos de moscas. Además, este sistema no captura la complejidad del entorno Drosophila encuentro en la naturaleza. Es muy raro que las moscas tendrá que decidir entre un sustrato de sacarosa pura frente a un sustrato liso puro para la puesta de huevos en la naturaleza. Así, mientras que nuestro ensayo es eficiente en el estudio de las bases neuronales de una tarea simple decisión, hay que tener en cuenta que las "decisiones" hembras específicas hacen en nuestras cámaras puede no ser relevante etológico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
