Abstract
Son zamanlarda, Drosophila yumurtlama tercihi basit karar verme süreçlerine nöral temelini incelemek için bir genetik uysal bir model olarak ortaya çıkmıştır. yumurtalarını yatırmak siteleri seçerken, erkek sineklerin kendi seçenekleri göreceli çekiciliği sıralama ve seçme yeteneğine sahiptir "daha büyük iki mal." bir de toplum tabanlı ve kurmak için zahmetli olduğu gibi, bu basit karar verme sürecini altında yatan devre bazında aramak için sistematik bir genetik tarama yaklaşım almak istiyorsa Ancak, çoğu yumurtlama tercih deneyleri pratik değildir. Tek kadın yumurtlama tercihlerini okuyan verimini arttırmak için, biz en fazla otuz bireyin her can aynı anda tahlil yumurtlama tercihleri her kadın yüksek yumurtlama oranına sahip sağlayan bir protokol yanı sıra uçar özel odalarını geliştirdi (yani onların tercihi kolayca ayırt edilebilir ve daha inandırıcı olduğunu). Yaklaşımımız yürütmek kolaydırve çok tutarlı sonuçlar üretir. Ayrıca, bu odalar, video yumurtlama hayvanların kayıt ve optogenetics çalışmaları için ışık sunmak için izin farklı ekleri ile donatılmış olabilir. Bu makalede, bu odalar içinde denenecek olan sinekler hazırlanması için, bu odalar ve prosedür imal edilmesi için planları içerir.
Protocol
Sinekler hazırlanması 1. tahlil edilecek
- Kültür standart pekmez uçar / 25 ° C ve% 65 nemde belirlenen inkübatör de Mısır unu medya. Şişeleri doldurmadık özen gösterin. Örneğin, dar bir gıda şişenin içine 8 kadın ve 6 erkek koydu.
Not: Burada kullanılan "ince gıda şişenin" 2.3 cm'lik bir iç çapa sahiptir. Biz genellikle her şişenin içine sinek gıda yaklaşık 10 ml dağıtılmıştır. Kullandığımız sinek yemek tarifi burada açıklanmıştır: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - Şekil 1E gösterildiği gibi 3 gün kadın eclosion sonra, taze maya hamurlu şişeleri hazırlamak. % 0.5 propionik asit 10 ml aktif maya 6 g karıştırılarak yaş maya hamur yapın. Gıda şişeleri yanağında üzerine maya macun uygulamak için bir spatula kullanın. şişeleri içine 25 erkek - 20 35 eclosed kadın birlikte - 30 toplayın.
- Genel olarak, dişiler toplanır aynı flakonlarından erkekleri toplamak(Böylece zaman ve çaba kaydetmek için). Erkeklerin doğurganlık konusunda endişe var, ancak bunun yerine WT erkek kullanın. Ayrıca, maya macunu her gün taze hazırlayın nedenle yumurta üretimini stimüle etmek için önemlidir.
- Sinekler ısıya duyarlı olmadıkça, 25 ° C'de,% 65 nemde toplanan kadın / erkek koruyun.
- ~ 4 Sonra - 5 gün, kadın yumurtlama deneyler için hazır olup olmadığını görmek için şişeleri kontrol edin. Gıda ortamının yüzeyi aktif gıda burrowing larva ıslak olduğunda hazır olduklarında (- F Şekil 1E bakınız).
Not: Gıda yüzeyi ıslak ve larvaları ile tarama hale geldiğinde Dişiler genellikle döşeme yumurta kesinti. Bu adım dişiler istenilen doku ile alt tabakaları karşılaştıklarında çok yumurtalarını bırakmak için hazır olacağını garanti (örn., ~% 1 agaroz).
2. Odası İnşaat, Montaj, Tahlil Kur
- (Bir atölye akrilik yumurtlama odaları inşa Fi varşekil 1A - D). Farklı parçaların mühendislik çizimi Ek Şekil 1'de gösterilmiştir -. 3 Yüksek çözünürlüklü resimler de burada bulunabilir (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Şekil 1C'de gösterildiği gibi, bölmenin yükleme (üst) parça halinde plastik levhalar yerleştirin. Yükleme bireysel yumurtlama arenalarda içine uçarken Bu alt yüzeyi olarak hizmet vermektedir.
- CO 2 pad üzerinde kadın uyutmak ve her yumurtlama arenaya bunları tek tek yükleyin. Sinekler CO 2 kurtarmak ve yeni ortama acclimated hale için ~ 30 dakika bekleyin.
- agaroz substratlar hazırlayın.
- kolaylık sağlamak için, 55 ° C su banyosunda eritilir% 1 agaroz bir premade şişe tutmak.
- 50 ml konik bir tüp içine hazır sükroz solüsyonu (2 M) istenilen miktarda ilave edin ve agaroz uygun miktarda ile karıştırılması. Örneğin, 150 mM sükroz alt-tabaka, pla hazırlamakce 750 tüp içine 2 M sukroz çözeltisi ul ve ardından 10 mi işaretine kadar agaroz ile tüp doldurun.
- aynı şekilde, düz alt-tabakanın hazırlanması yerine sükroz solüsyonu damıtılmış su ilave edilir.
Not: Bu protokol agaroz nihai konsantrasyon az% 1 'den daha azdır. % 1,1 ve iki yüzeylerde aynı agaroz konsantrasyonu olduğu - o ~ 0.9 içinde olacak şekilde kontrol edilir olarak bizim deneyim, agaroz tam konsantrasyonu çok uzun fark etmez.
- Şekil 1D görüldüğü gibi her bir çukur içine odası ve pipet agaroz substrat 1000 ul substrat (alt) parça al.
- agaroz ~ 30 dakika boyunca katılaşmaya izin verin.
- agaroz yüzeyler ve sinekler hazır olduğunda, yumurtlama odasının her üç parçalarını birleştirmek ve ardından plastik levhalar çıkar.
- sinek kuluçka odaları yerleştirin.
Not: yumurtlama deney uzunluğu deneyimlerini bağlı olarak değişebilirzca ihtiyacı var. (- 16 saat 14), tipik olarak deney O / N çalıştırın. Ayrıca, yumurtlama tercihleri sirkadiyen zamanlama önemli etkisi gözlenmemiştir. - Odasına CO2 enjekte kadın anestezisi. , Odasına sökün sinek morguna içine anestezi sinekler atın (yani., Boş kahve, bazı mısır yağı ile dolu olabilir). Kayıt tutulması sonuçların fotoğraflarını çekmek (bakınız Şekil 2).
- elle yumurta sayısını ve analiz için tercih endekslerini hesaplamak. Olarak tercih indeksi hesaplamak (N - N b) / (N + N b) N ve N b sırasıyla sitede vs. sitesi b yumurta sayısını temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yumurtlama odaları birçok parçadan oluşur: bir alt tabaka (alt) parçası, bir bölücü (orta) parçası, bir yükleme (üst) parça ve 2 sürgülü kapı (Şekil 1A - D). Bu parçalar yumurtlama deneyler daha önce bağımsız kurulum sinekler ve yüzeyler için kullanılır. Şekil 1F dişi sineklerin yumurtlama için hazır olduğunda şişeler nasıl görünmelidir gösterir. Sinekler düz alt-tabaka ve bir sükroz içeren alt-tabaka arasında bir seçim verildiğinde, dişi sağlam yumurtlama, Şekil 2'de gösterildiği gibi düz bir alt-tabakanın için tercih edilir.
Şekil 1. Yumurta döşeme Odalar ve Protokolü Yumurta döşeme. (A) Tam odasına -laying yumurta toplandı. (B) Demonte adettir. a: yükleme parçası (üst), b:Bölücü parçası (orta), C: substrat (alt) parçadan oluşur. . Bu parçaların mühendislik çizimleri Ek Şekil 1'de gösterilmiştir - 3 odanın (C) yükleme parçası. a ': kapılar bir "kayma.:. rayları plastik levhalar yerinde yüklenen sinekler tutmak için bir zemin olarak hizmet yükleme parçası yerleştirilir Biz genellikle plastik levhalar (kırmızı ok) kenarına renk bantları koydu. (D) alt tabaka (alt) ve bölücü (orta) odasının adettir. Agaroz yumurtlama yüzeylerde (oklar) olarak hizmet bireysel olukları yatırılır. Dörtlü tek sinek için yumurtlama arenayı özetliyor. (E toplanan kadın / bir mayalı flakon erkeklerin) Gün 0 (F) 4. Gün -.. toplanan kadın / bir mayalı flakon erkeklerin 5 haline gelmiştir larva ve ergin dişiler maya ve gıda yüzeyinin en yedim Not larvaları tarafından işgal. larvaları ile tarama ıslak yüzey gıda flakon daha yumurtalarını bırakması dişileri engeller. (G) şematik yumurtlama davranışı deneyleri kurmak için protokol tasvir. (Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız)
Şekil 2. Temsilcisi Sakkaroz ve Düz Yüzeyler arasında seçme Sinekler için sonuçlar Yumurta döşeme. Vahşi tip yumurtlama sonuçları (A) Yandan görünüm onlar sakaroz (150 mM) ve düz yüzeyler arasında bir seçim verildiğinde uçar. Beyaz kutu, tek bir sinek için bir yumurtlama arenayı özetliyor. (B) yumurtlama sonuçların üstten görünümü. Beyaz kutu, tek bir sinek için bir yumurtlama arenayı özetliyor. (C) Tercih indeksi ( Bir sükroz içeren substrat ve düz bir yüzeye arasında seçim yapmak istendiğinde vahşi tip PI) uçar. - Yumurta / toplam sayısı (düz yüzeylerde yumurta sayısı sakaroz alt tabaka üzerinde yumurta sayısı) aşağıdaki gibidir: Her kadın için PI hesaplanır. Hata bar SEM gösterir. (Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız)
Ek Şekil S1 Bölücüyle ve Odası Yüzey Piece Mühendislik Çizimleri.. (A - A ") odasının alt tabaka parçasının farklı görünümleri. (B - B ') odasının orta bölücü parçasının farklı görünümleri.d / 53716 / Supplemental1.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ "blank> (bu dosyayı indirmek için tıklayınız)
Ek Şekil S2 Odası Yükleme Piece Mühendislik Çizimleri.. (A - A ') odasının yükleme parçasının üst tabakasının farklı görünümleri. . (B - B ') odasının yükleme parçasının alt tabakanın farklı görüşleri (bu dosyayı indirmek için tıklayınız)
Ek Şekil S3.
Ek Şekil S4. Video kaydına kameralarla donatılmış Aksesuar ve Özelleştirme Yumurta döşeme Odaları. (A) Yumurta döşeme odaları yumurtlama deneyler 13 sırasında uçar. Uzantılı 12 Ctrax 14 sinekler ve özel MATLAB kod yörüngeleri çizmek için kullanılır izlemek için kullanılır. (B) Kurulum kırmızı aydınlatabiliriz ile yumurtlama substratlar aydınlatmak için t. LED'ler (1), bir LED sürücü (2) bağlanır. LED yoğunluğu mikro denetleyici tarafından kontrol edilir (3). Anormal ışık koşullarında kamera hakkında daha fazla bilgi ışık iletim sistemi ve izleme hayvanlar için Zhu ve ark bakın. ve Stern ve diğ. Yumurtlama odalarına üstüne ekli (C) Kırmızı LED (ışık kapalı). (D) Kırmızı LED (ışık) yumurtlama odalarına üstüne eklenmiş. CsChrimson 15 nöron etkinleştirmek için kullanıldığında 10 uW / aa - kırmızı LED LED yoğunluğu genellikle yaklaşık 7 olarak ayarlanır. (E) Yumurta döşeme kırmızı ışık (ışık kapalı) ile deneyler sırasında, video kayıt sinekleri kameralar ve LED'ler ile donatılmış odaları. Kırmızı ışık (ışık) ile deneyler sırasında, video kayıt sinekleri kameralar ve LED'ler ile donatılmış (F) Yumurta döşeme odaları. (t: 28px; "target =" "_ blank> Bu dosyayı indirmek için tıklayınız)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
odaları ve burada açıklanan protokoller önceki yumurtlama deneyleri üzerinde çeşitli geliştirmeler var. Birincisi, önemli ölçüde tek hayvan tercihlerini analiz etmek ve verimi arttırmak. Her oda 30 tek kadın tahlil edebilir ve bir saat kurmak için daha az sürer. İkincisi, önceki yöntemlere göre yumurtlama tercihleri tutarlılığını artırmak. arena boyutlarının standardizasyon, yüzeyler arasındaki yumurtlama substratların boyutu ve mesafe daha kolay farklı deneysel gün arasında ve farklı araştırma gruplarının sonuçları karşılaştırmak için yapar. Üçüncü olarak, odaları tek (Ek Şekil 4) takip etmek isteyen ek bir analiz yerleştirmek için ekleri ile takılabilir. Örneğin, davranış analizi için, video kameralar sinekler 7,11-13 kayıt odasının üstüne monte edilebilir. En önemlisi, bu yaklaşım ölçeklenebilir. Bu bölmeler, nispeten inex olanbir makine atölyesi yardımıyla üretmek için dalgın. Ayrıca, tipik olarak 5 odacıklı (150 tek kadın) yumurtlama tahlillerin değerinde kurmak için yetenekli bir işçiye en az 2 saat sürer.
Tek kadın yumurtlama tercihi okuyan en kritik faktörlerden biri, her dişi birçok yumurtalarını bırakmak için hazırlanmış olduğundan emin olmaktır. ( "50 vs 0 yumurta" Bir tercihi çok daha ikna edici "1 vs 0 yumurta" bir tercih daha). Bu protokol, düzgün çalıştırıldığında, düzenli vahşi tip sinekler (Canton S ve w1118) dişi O / N başına / en az 50 yumurtalarını bırakmak için izin vermelidir. Çeşitli faktörler yüksek yumurtlama oranı ile kadın üreten katkıda bulunur. Birincisi, deneye tabi tutulacak kadın kültürlerken şişeler / şişe overpopulate değil dikkat etmelisiniz. Aşırı kalabalık sık sık az yumurtalarını küçük kadın dönüşeceği küçük larvaları, üretir. İkincisi, bir zekâ birbirine karıştırıldığında tahlil edilecek kadın maya hamur bol erişiminiz olduğundan emin olmalısınızGıda şişelerde H erkek. % 0.5 propionik asit yerine su proprionik asit sadece şişeler içinde mantar enfeksiyonu azaltır, aynı zamanda yumurta bırakan arttırır fakat maya macunu hazırlamak için kullanılması önerilmektedir. Üçüncü olarak, bir şişeler Şekil 1F gösterilen resimdeki gibi görünüyor gıda larva / gıda yüzeyine kadar kadın tahlil olmamalıdır; değil yeterince yumurtlama yoksun eğer odalarında tahlil edildiğinde, dişiler gibi birçok yumurtalarını olmaz. Ayrıca, burada kullanılan gıda şişeler "dar şişeler" olduğunu unutmayın. - 5 gün daha büyük bir çapa sahip şişe kullanıyorsa, tek bir dişi 4 tahlil için hazır olur, böylece şişe içinde yerleştirilmesini kadın / erkek sayısının artırılması gerekmektedir.
Özellikle burada açıklanan protokol dişilerin incelenmesi üzerinde odaklanırken diğer şartlarda tercih 'sakaroz ve düz yüzeyler arasındaki tercihlerini, dişilerin incelemek için adapte edilebilir'. Örneğin, bu odalar Assa için kullanılabilirY sineklerin tercih sert ve yumuşak agaroz arasında seçim (örn., 1 ve% 1.5% agaroz), hem de diğer kimyasal duyu dizilerinden farklıdır alt-tabakalar olarak (örn.,% 3 asetik asit). Biri veya her ikisi yüzeyler aydınlatmak için LED içeren kapak ile donatılmış ise, oda da optogenetic çalışmaları (Ek Şekil 4) yürütmek için verimli bir platform sağlayabilir.
Son olarak, bu ayar Drosophila yumurtlama tercihlerini analiz etmek için daha yüksek verim izin vermesine rağmen, bazı önemli sınırlamaları vardır dikkati çekiyor. İlk olarak, odaların sabit boyut davranışsal testinin esnekliği kısıtlar. Örneğin, bir parametre (örneğin., Yüzeyler arasındaki mesafe) sineklerin yumurtlama tercihlerini nasıl etkileyebileceğini diğer test etmek için yeni odalarını yapmak gerekir. Buna ek olarak, bu sistem vahşi karmaşık ortam Drosophila karşılaşma yakalamak değil. Doğada yumurtlama için saf düz yüzeye vs saf sakaroz substrat arasında karar vermek zorunda olacak uçar çok nadirdir. Bizim tahlil basit bir karar görevin nöral temeli eğitim etkilidir Böylece iken, belirli bir "kararlar" kadın ethologically alakalı olmayabilir bizim odalarında yapmak farkında olması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Water bath | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Egg-laying chambers | Custom Built | ||
| Camera holders | Custom Built | ||
| LED holders | Custom Built | ||
| Fly vials (narrow) | Genesee | 32-116BC |
References
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436 (2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910 (2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335 (2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432 (2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
