Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att inducera okulär hypertension i det murina ögat som resulterar i förlust av retinala ganglionceller såsom observerats i glaukom. Magnetiska mikropärlor injiceras i den främre kammaren och attraheras av iridokorneal vinkel med en magnet för att blockera utflödet av kammarvatten.
Abstract
Användningen av gnagarmodeller av glaukom har varit viktigt att förstå de molekylära mekanismer som ligger bakom patofysiologin av denna multifaktoriell neurodegenerativ sjukdom. Med tillkomsten av ett stort antal transgena mus linjer, det finns ett ökande intresse för inducerbara musmodeller av okulär hypertension. Här presenterar vi en ocklusion modell glaukom bygger på injektion av magnetiska mikrokulor i den främre ögonkammaren med hjälp av en modifierad mikronål med en facetterad avfasning. De magnetiska mikropärlor lockas till iridokorneal vinkel med en handhållen magnet för att blockera dräneringen av kammarvatten från den främre kammaren. Denna störning i vattenhaltiga dynamikresulterar i en stadig höjning av intraokulärt tryck, som därefter leder till förlust av retinala ganglionceller, såsom observerats i glaukompatienter humana. Modellen mikrokorn ocklusion som presenteras i detta manuskript är enkel jämfört med andra inducerbara modeller av glaukom och också mycketeffektiv och reproducerbar. Viktigt är de ändringar som presenteras här minimera vanliga problem som ofta uppstår i ocklusion modeller. För det första, användningen av en avfasad glas mikronål förhindrar återflöde av mikropärlor och säkerställer att minimal skada uppstår på hornhinnan under insprutningen, vilket minskar skaderelaterade effekter. För det andra, användningen av magnetiska mikropärlor säkerställer förmågan att attrahera de flesta pärlor till iridokorneal vinkel, vilket effektivt minskar antalet kulor flyter i den främre kammaren att undvika kontakt med andra strukturer (t ex., Iris, lins). Slutligen har användningen av en handhållen magnet medger flexibilitet vid hantering av den lilla musen ögat för att effektivt rikta de magnetiska mikropärlor och se till att det finns lite återflöde av mikropärlorna från ögat när mikronålen dras tillbaka. Sammanfattningsvis mikrokornet ocklusion musmodell som presenteras här är ett kraftfullt undersökande verktyg för att studera neurodegenerativa förändringar som sker under uppkomsten och utvecklingen av Glaukoma.
Introduction
Glaukom är en progressiv och irreversibel blindhet tillstånd som påverkar uppskattningsvis 80 miljoner människor över hela världen av 2020 en. I glaukompatienter är synbortfall orsakas av selektiv död av retinala ganglieceller (RGC), utgångs nervceller som sänder visuell information från näthinnan till hjärnan. Glaukom är en åldersrelaterad neurodegenerativa sjukdomar med många riskfaktorer som den vanligaste är förhöjt intraokulärt tryck (IOP). I själva verket är IOP den enda modifierbara riskfaktorn vid glaukom och nuvarande behandlingar fokuserar enbart på att hantera ögontryck. Men flera genetiska, cellulära, och miljömässiga faktorer påverkar uppkomsten och utvecklingen av denna sjukdom. Därför att förstå de olika mekanismer som i slutändan bidrar till neuronal död är viktigt att utveckla effektiva behandlingar för glaukom.
Djurmodeller av glaukom är viktigt att studera sjukdoms patofysiologi samt att identifiera och testalovande läkemedel. Den ökande tillgången av transgena mus linjer inklusive villkorad knockout stammar och möss som bär genetiskt kodade fluorescerande spårämnen har drivit på behovet av inducerbara murina glaukom modeller. Flera gnagarmodeller av glaukom har utvecklats under årens lopp (översikt i 2,3). I många av dessa modeller är glaukom induceras genom att bryta vatten humor dynamik, vilket resulterar i förhöjning av IOP. Ocklusion modeller, där mikrokulor eller andra ämnen injiceras i den främre ögonkammaren för att blockera vatten dränering, har vunnit popularitet under de senaste åren delvis på grund av deras relativa lätthet att öka IOP 4-14.
Mikrokornet ocklusion modell av glaukom, först genomförs i primater 12, kaniner 8, och råttor 4,9,11, har nyligen anpassats för användning i möss 5,6,10. I dessa studier var den intrakameral injektion av polystyren mikrokulor, ensam eller ikombination med ett viskoelastiskt material, resulterade i IOP höjd leder till efterföljande RGC död 6,10. Men återflöde när nålen dras tillbaka från ögat och lossnar av mikrokulor från iridokorneal vinkel är vanliga problem som uppstår under förfarandet. För att minimera dessa nackdelar, har magneter använts för att locka de magnetiska mikrokulor till iridokorneal vinkel i ögat 4,9.
Protokollet som beskrivs här är ett modifierat förfarande baserat på tidigare studier 9,10 som använder magnetiska mikropärlor och en handhållen magnet anpassad till musen ögat (Figur 1). Flera viktiga ändringar har införts i våra protokoll för att säkerställa en effektiv och reproducerbar IOP ökning av möss. Först injektion av mikropärlor görs med hjälp av en genomtänkt glas mikronål med en facetterad avfasning. De resulterande släta ytorna av mikronålen samt dess vassa spetsen säkerställer att minimal skada ärtillfogat som punkterar hornhinnan. Användningen av detta glas mikronål resulterar också i ökad kontroll när microneedle spetsen kommer in i främre kammaren, vilket minskar risken för skador på närliggande strukturer såsom iris och linsen. Dessutom underlättar den lilla injektions skada hornhinnan självläkande och minskar oönskade skaderelaterade effekter.
För det andra, insprutningen av magnetiska mikropärlor och användningen av en handhållen magnet ger exakt kontroll för att attrahera kulorna till iridokorneal vinkel i den lilla musen ögat. Magnetiska mikrokulor som är 4,5 mikrometer i diameter användes eftersom denna mikrokorn storlek inte täppa till beredd mikronål öppning och viktigare, en gång injiceras dessa mikrokulor effektivt blockerade dränering av kammarvatten. Detta tillvägagångssätt minskar inte bara återflöde av de injicerade mikropärlor, men också ser till att ett maximalt antal mikropärlor ackumuleras i målområdet för att effektivt blockera kammarvatten dränering. furthermore, denna strategi minskar också antalet kulor flyter i den främre kammaren att undvika kontakt med andra strukturer, såsom iris och linsen, och förhindrar passage till den bakre kammaren. Sammantaget visar dessa modifieringar säkerställa att mikrokornet injektion kirurgi utförs med relativ lätthet och på ett lämpligt sätt som resulterar i ett mycket reproducerbart, effektivt, och ihållande induktion av okulär hypertension i möss.
Protocol
Följande procedur genomfördes i enlighet med riktlinjerna i den kanadensiska rådet om Djurvård för användningen av försöksdjur och uttalandet för användning av djur i ögon och Visual Forskning från Föreningen för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO).
1. Beredning av Micro för Anterior intrakameral Injection
- Med en avdragare, generera en mikronål från en borosilikatglas kapillär
- Under ett mikroskop, använd en vass kniv för att noggrant skapa en öppning vid spetsen av mikron. Den resulterande öppningen bör ha en elliptisk form med en större och mindre axel diameter av ca 190 | j, m och 70 | j, m, respektive. Mät ytan av det beredda mikronål öppningen genom första hämta bilder med en linjal placerad under mikroskop följt av kvantifiering med användning av bildanalysmjukvara.
- I mikropipett fasning systemet, placera mikronål på en 20 Degree vinkel i förhållande till avfasningen plattan, så att mikronålen öppningen ligger an mot plattan. Avfasning under ca 10 min tills kanterna är plan och jämn. Tillsätt några droppar destillerat vatten för att underlätta processen.
- Vrid mikronål att fasa de två kanterna som omger öppningen tills spetsen är skarp.
- Avlägsna all smuts och vatten från mikronålen ändöppningen användning av en aerosol duster.
- Noggrant undersöka färdiga mikronål under ett mikroskop. Kassera mikronålar med frakturer för att minimera risken för att mikronål brytning under operation.
- Sterilisera mikronål genom sköljning först med etanol, sedan med steril balanserad saltlösning (BSS).
2. Beredning av magnetiska mikrokorn Lösning
Notera: De magnetiska mikropärlor som används i denna studie är överdragna med epoxigrupper. För att förhindra eventuella negativa effekter, såsom ihopklumpning av pärlorna och oönskade molekylära interaktioner, dessa epoxigrupper måsteförst tas bort från mikropärlorna innan du fortsätter med injektions kirurgi.
- Avlägsnande av epoxigrupperna från magnetiska pärlor
- Bered en lösning av 0,02 M natriumhydroxid (NaOH, MW 39,997 g / mol) i 10 x Tris-buffert (MW 121,14 g / mol).
- Vortexa försiktigt lager av magnetiska mikropärlor lösning (4,5 um diameter, 4 x 10 8 pärlor / ml) tills kulorna är jämnt suspenderade i lösningen.
- Snabbt pipettera 1 ml av magnetisk pärla lösningen i 50 ml 0,02 M NaOH i 10 x Tris-buffert.
- Rotera under 24 h vid RT för att avlägsna epoxigrupperna från pärlorna.
- Samla pärlorna genom att säkra en magnet till botten av röret. Orientera röret horisontellt för att se till att alla pärlorna attraheras till magneten. Rotera under ytterligare 4 h vid RT.
- Med en mikropipett, försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten av pärlor.
- Vortexa försiktigt pelleten i 50 ml 10x Tris buffert tills pärlorna väl avbrytas.
- Upprepa steg 2.1.4 till 2.1.6.
- Koncentration och resuspension av magnetiska mikropärlor i sterila Balanced Salt Solution
Obs: Det är nödvändigt att koncentrera beståndet av magnetiska pärlor lösning i steril balanserad saltlösning (BSS) för att nå en slutlig koncentration av 1,6 x 10 6 pärlor / l, så att 2,4 x 10 6 pärlor kan injiceras i den främre kammaren i ett slutvolym av 1,5 | il, som är lämplig för den lilla musen ögat.
- Tvätta pärlor i 5 ml ultrarent laboratoriekvalitet vatten genom att försiktigt vortexa i 2 min.
- Samla pärlorna genom att attrahera dem till botten av röret med en magnet.
- Med en mikropipett, försiktigt bort vattnet utan att störa pelleten av pärlor.
- Upprepa steg 2.2.1 till 2.2.3 tre gånger.
- I ett laminärt flöde huva, tvätta pärlorna med 500 pl BSS efter pipetting upp och ner. Utför de återstående stegen i detta avsnitt under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva.
- Samla pärlorna genom att attrahera dem till botten av röret med en magnet.
- Med en mikropipett, försiktigt bort BSS utan att störa pelleten av pärlor.
- Upprepa steg 2.2.5 till 2.2.7 tre gånger.
- Resuspendera genom att pipettera pärlorna upp och ned i 250 pl av BSS.
- Se till att pärlan lösning är väl homogeniseras. Sedan, snabbt alikvot 25 | il av suspensionen i sterila 0,5 ml rör. Den slutliga koncentrationen av beståndet vulsten lösning är 1,6 x 10 6 pärlor / il.
- Lagra vid 4 ° C.
3. Induktion av okulär hypertension
Anm: Avsnitt 3 är en två personer drift. I händelse av att en viss åtgärd skall utföras av en viss person, är rätt person identifieras. I allmänhet, Person 1 hanterar musen under mikroskop medan Person 2 responsible för hantering av mikropumpen. Den totala varaktigheten av det kirurgiska ingreppet bör vara mindre än 10 minuter (steg från 3,9 till 3,17).
- Utför procedurerna i vuxna C57BL / 6 möss. Hus möss i en standardmiljö med tillgång till föda och vatten ad libitum. I detta dokument använder kvinnliga C57BL / 6 möss mellan 3 och 4,5 månaders ålder. Emellertid kan detta protokoll anpassas till hanar och möss av olika åldrar, liksom andra musstammar, inklusive transgena och knockoutmöss.
- Mät baslinjen IOP i vaken möss före anestesi och mikrokorn injektion med en kalibrerad rebound tonometer. Applicera en droppe proparakain hydroklorid på hornhinnan.
- hålla försiktigt musen genom att hålla huden mellan öronen. Placera musen på bänken så att djuret är bekväm och ögonen är tillgängliga. Håll tonometern vinkelrätt mot hornhinnans yta och ta åtminstone tre uppsättningar av tio avläsningar i följd per öga för att erhålla enIOP genomsnitt. Mätningen av IOP i vaken möss är att föredra att kringgå narkos relaterade effekter på IOP. Alternativt kan IOP mätas i sövda möss efter steg 3,4.
- Bered en stam mus cocktail anestesi blandning bestående av 20 mg / ml ketamin, 2 mg / ml xylazin, och 0,4 mg / ml acepromazin.
- Inducera anestesi hos mus genom intraperitoneal administrering av cocktail-blandning (1 | il / g kroppsvikt). Användningen av en injicerbar bedövningsmedel cocktail föredras framför gas anestetika (t.ex., isofluran) eftersom den tillåter flexibilitet vid hantering av mus huvud när djuret inte är ansluten till en inandningsmask. Dessutom, desto längre återhämtningsperiod som krävs med ett injicerbart bedövningsmedel säkerställer att mikropärlor avsätts i iridokorneal vinkel utan att rubba tillbaka in i den främre kammaren.
- Administrera 0,05 mg per kg kroppsvikt av buprenorfin subkutant.
- Behandla ögat med en tropikamid eye sjunka till inducera elev utvidgning. På grund av den begränsade storleken på den murina främre kammaren, måste eleven vara dilaterade att enkelt visualisera placeringen och utvecklingen av mikronålen under injektion.
- Applicera topikal salva på den kontralate ögat (icke-opererad) för att undvika uttorkning av hornhinnan under förfarandet.
- Fäst en ren mikronål till injektions montering av mikropumpen. Byt mikronålen efter varje operation för att undvika kontaminering kors djur.
- Person 1: Överför anestesi musen till operativplattform. Under mikroskop, se till att eleven är helt utvidgad och att de okulära musklerna är avslappnade så att det inte finns någon ögonrörelser. Frånvaron av ögonrörelser ger stabilitet under injektionen. Torka försiktigt av tropikamid ögondroppar från ögat med hjälp av absorberande kompresser.
- Person 2: Blanda den magnetiska mikrokornet lösning genom att pipettera upp och ned.
- Med hjälp av mikropumpen omedelbart ladda MICRoneedle (framställd i avsnitt 1) med 1,5 pl av den homogeniserade magnetiska mikrokornet lösning (2,4 x 10 6 pärlor). Se till att luftbubblor är frånvarande vid spetsen av mikron. Efter mikronålen är laddad, utföra stegen 3,12-3,13 så snabbt som möjligt, så att den magnetiska mikrokornet lösningen förblir i en homogen suspension.
- Placera den laddade mikronål i 45 ° vinkel, placeras anteriort i förhållande till limbus. Person 1: stödja ögat med plast pincett. Säkerställa att vinkeln mellan mikronålen och plast pincett är ungefär 90 °.
- Person 2: Med den laddade mikronål försiktigt punktera hornhinnan så att spetsen på mikronålen in i främre kammaren. Se till att den laddade mikronålen ligger kvar på en 45 ° vinkel i förhållande till den limbus under punktering. Undvik kontakt med linsen eller iris. Säkerställa att mikronålen inte kommer in i bakre kammaren. Person 1: att fortsätta att stödja ögatanvända plast pincett.
- Person 1: Utan att flytta musen huvudet, placera magneten bredvid ögat, motsatt den mikronål spets, för att attrahera de magnetiska pärlorna i den främre kammaren och minimera kontakt av pärlorna med den inre ytan av hornhinnan. Person 2: Använda mikropumpen, injicera 1,5 pl av magnetiska pärlor lösningen i den främre kammaren. Mikrokornet lösningen injiceras under en period av 15 till 30 sek. Person 1: Fortsätt att hålla magneten motsatt mikronålen spetsen under hela den tid injektionen.
- Person 2: När den fulla volymen av pärlorna har injicerats, långsamt dra tillbaka mikronålen från ögat. Person 1: För att undvika återflöde av mikropärlorna, fortsätta att attrahera de magnetiska kulor mot den främre kammaren genom att hålla magneten intill ögat för ytterligare 30 till 60 sekunder.
- Person 1: Använda magneten, locka pärlorna till iridokorneal vinkel. Se till att pärlorna bildar en jämnt fördelad ringrunt omkretsen av den främre kammaren. Under detta steg, undvika att locka pärlor till hornhinnan, eftersom de har en tendens att fastna vid den inre ytan av hornhinnan vid kontakt.
- Behandla det opererade ögat med ett antibiotikum ögondroppar för att minimera risken för infektion.
- Låt musen för att återhämta sig på en värmedyna tills den är helt vaken (~ 3-4 timmar). Placera musen så att det opererade ögat är vänd uppåt. Denna positionering kommer att förhindra ackumulering av de injicerade pärlorna till den inre ytan av hornhinnan genom gravitationskraft. Dessutom kommer denna position att minska potentialen för infektion som det opererade ögat inte kommer att vara i kontakt med någon sängkläder och / eller andra material som kan finnas närvarande i buren. I händelse av att ett djur visar några tecken på obehag, administrera ytterligare doser av buprenorfin efter behov.
- Låt möss att återhämta sig från förfarandet för minst 2 dagar innan IOP mätningar. Mät IOP som beskrivs i 3.2. moniTor IOP åtminstone en gång i veckan eller oftare vid behov, och på samma tid på dagen för att minimera dygnsrytm relaterade fluktuationer.
- För IOP mätningar använder kontra ögat från den opererade musen som en intern kontroll. Alternativt använder mätningar från intakta, icke-manövrerade eller skenopererade möss som naiva kontroller.
4. Bedömning av näthinneganglieceller Soma och Axon Survival
- BEGJUTA möss som utsatts för okulär hypertension genom intrakadriell injektion av 0,1 M fosfatbuffertlösning (PBS) omedelbart följt av iskall 4% paraformaldehyd (PFA).
- BEGJUTA intakta, icke-drivs möss som beskrivs i 4.1 och använda dem som oskadade kontroller. Användningen av kontralaterala ögon från drivs möss rekommenderas inte att bedöma RGC överlevnad eftersom förändringar i kontralaterala ögon efter skada har rapporterats 15,16 och kan förbrylla tolkning av data. Alternativt kan du använda skenopererade ögon injicerades med en.5 Il BSS som kontroller.
- Använda microscissors, skär försiktigt bindväv runt ögat för att isolera den från ögonhålan. Separera synnerven från ögat genom att skära den i nivå med papillen.
- Med användning av en 30 G-nål, göra ett hål i hornhinnan för att medge penetrering av fixeringslösning in i ögat. Placera ögat i 4% PFA och inkubera i 1 timme vid 4 ° C för ytterligare fixering.
- Placera synnerven i en lösning innehållande 2% PFA och 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylat (MW: 214 g / mol) och inkubera O / N vid 4 ° C för ytterligare fixering.
5. Kvantifiering av RGC Soma Density på Platt-monterade näthinnor
Obs: Följande procedur är anpassad från ett protokoll från Nadal-Nicolas et al 17 och beskriver kvantifiering av RGC användning av en antikropp mot hjärnan specifika homeobox / POU-domänen protein 3A (Brn3a) på näthinnan platt-fästen.. alternativa methODS för att märka RGC: er kan också användas inklusive immunohistokemi med en antikropp mot RNA-bindande protein med flera splitsning (RBPMS) eller retrograd märkning med fluor eller DII.
- Under ett dissektionsmikroskop, ta bort den främre delen av ögat genom att göra ett snitt längs hela limbus tills hornhinnan lossnar lätt. Ta bort hornhinnan och linsen. Försiktigt loss näthinnan från ögat genom att göra nedskärningar längs ora serrata och synnerven.
- Förbered en retinal platt-mount genom att göra fyra små ekvidistanta snitt från periferin av näthinnan mot synnerven att tydligt avgränsa de fyra retinala kvadranter. Med hjälp av en liten borste, försiktigt bort eventuellt kvarvarande glaskroppen från näthinnan. Avlägsnandet av så mycket glaskroppen som möjligt är avgörande för att få en ren och stark immunhistokemisk signal.
- Försiktigt överföra näthinnan till en 48-brunnars flatbottnad odlingsplatta innehållande 0,5% Triton X-100 i PBS, så att näthinnan ärfritt flytande. Se till att ganglion cellager är vänd uppåt.
- Placera odlingsplatta vid -70 ° C under 15 min. Efter upptining näthinnor, ytterligare permeabilisering genom tvättning två gånger i färsk 2% Triton X-100 i PBS.
- Späd Brn3a antikropp till 0,3-0,5 | ig / ml med PBS innehållande 2% Triton X-100 och 2% normalt donkey serum. Inkubera näthinnan i Brn3a primära antikroppslösningen genom att försiktigt skaka O / N vid 4 ° C. Näthinnor bör vara helt nedsänkta i 150 till 200 | il av lösning vid alla tidpunkter.
- Späd åsne-anti-get-IgG sekundär antikropp till 2 ^ g / ml med PBS innehållande 2% Triton X-100 och inkubera näthinnan i denna lösning under 2 h vid RT under försiktig skakning. Näthinnan bör vara helt nedsänkt i antikroppslösningen vid alla tidpunkter. Täck odlingsplatta med aluminiumfolie för de återstående stegen för att förhindra fotoblekning.
- Med hjälp av en pensel, töm näthinnan till en bild så att vävnaden ligger så platt som posligt. Lufttorka i 10 min. Montera med hjälp av anti-fade monteringsmedium.
- Undersök retinala platt-fästen under ett fluorescerande mikroskop. Kvantifiera antalet Brn3a positiva RGC i tre icke-överlappande områden per retinal kvadrant som beskrivits. 18
6. Kvantifiering av RGC Axoner på synnerven Tvärsnitt
- Samla synnerven från steg 4,5 och inkubera i 2% osmiumtetroxid (OSO4, MW 254,23 g / mol) under 2 h.
Varning: På grund av dess höga toxicitet, osmiumtetroxid ska hanteras i ett dragskåp med lämpligt laboratorium klädsel. - Dehydratisera synnerven genom nedsänkning i ökande koncentrationer av etanol (50%, 70%, 90%, 95% och 100%) under 15 min vardera.
- Förbereda epoxihartset med användning av följande recept: 15,72 ml Integrera-812, 6,45 ml dodecenyl-bärnstenssyraanhydrid, 7,83 ml Nadic Methyl-anhydrid, 0,45 ml DMP-30.
- Sekventiellt inkubera synnerven i lösningar som bestårav följande förhållanden av epoxiharts till propylenoxid (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25, och en: 0. Synnerven inkuberas i varje lösning vid RT i en O / N period.
- Inkubera synnerver inbäddade i 100% epoxiharts (sista steget från 6,4) vid 60 ° C under ytterligare 48 timmar.
- Generera halvtunna synnerven tvärsnitt (0,75 um) med hjälp av en mikrotom.
- Stain synnerven tvärsnitt med 1% toluidinblått.
- Kvantifiera RGC axoner i fem icke-överlappande områden i varje synnerven sektion som beskrivs 19.
Representative Results
Injektionen av magnetiska mikrokulor i den främre kammaren av vuxna möss som beskrivs i detta protokoll resulterade i en robust och reproducerbar förhöjning av IOP. En vecka efter ingreppet, ökade det intraokulära trycket från 10 ± 0,6 mm Hg (medelvärde ± SEM), den genomsnittliga utgångs IOP i kontralaterala ögon, till 19 ± 0,5 mm Hg hos hypertoni ögon (Students t-test; *** p <0,001, n = 12, tabell 1, figur 2). IOP stabiliserades därefter och förblev förhöjda i genomsnitt 20 mm Hg under minst 6 veckor, den längsta tidspunkt undersöktes i denna studie. Den genomsnittliga topp IOP i mikrokorn-injicerade ögonen på 2, 3, och 6 veckor efter operationen var 25 mm Hg. Den stora majoriteten av behandlade möss utvecklade ihållande hög IOP, därför detta protokoll inte kräver en andra injektion av mikropärlor.
För att bedöma tidsförloppet för RGC förlust i denna modell, var RGC somaförst kvantifieras genom immunfärgning med Brn3a, en RGC-specifik markör 17. Antalet Brn3a-positiva celler kvantifierades på plana monterade näthinnor vid 1, 2, 3 och 6 veckor efter induktion av okulär hypertension. Även om en signifikant lOP höjd upptäcktes så tidigt som en vecka efter mikrokorn injektion var ingen signifikant förlust av RGC soma observerats inom de första 2 veckorna av förfarandet (Figur 3). Väsentlig RGC död (22%), var emellertid uppenbar vid 3 veckor (2,430 ± 67 RGC / mm 2, medelvärde ± SEM, n = 12) och 6 veckor (2,350 ± 74 RGC / mm 2, n = 10) post induktion av okulär hypertension, jämfört med intakta kontrollögon från un styrda möss (3.141 ± 49 RGC / mm 2, n = 23) (ANOVA, p <0,001).
Dysfunktion och degeneration av RGC axoner är en kardinal inslag av glaukom. Därför var axonal förlust undersöktes vid 3 och 6 veckor efter mikrokorn injektion avkvantifiering av RGC axoner i synnerven tvärsnitt färgade med toluidinblått (Figur 4). En väsentlig förlust av RGC axoner (25%) observerades vid 3 veckor (28,401 ± 702 axoner / nerv, medelvärde ± SEM, n = 5) och 6 veckor (29,426 ± 948 axoner / nerv, n = 6) efter injektion av mikropärlor jämfört med intakta synnerverna från un styrda ögon (39.467 ± 137 axoner / nerv, n = 4) (ANOVA, p <0,001). Sammantaget visar dessa data att injektion av magnetiska mikrokulor i musen främre kammaren leder till reproducerbara och ihållande IOP höjd som resulterar i RGC soma och axon degeneration.
| Tid efter OHT kirurgi | N | Det intraokulära trycket (mm Hg) ± SEM | Peak lOP (mmHg) | ||||
| kontralateralt | Glaukom | difference | kontralateralt | Glaukom | |||
| 1 vecka | 12 | 10 ± 0,4 | 19 ± 0,5 | 9 ± 0,6 | 12 ± 0,4 | 22 ± 0,6 | |
| 2 veckor | 13 | 11 ± 0,5 | 20 ± 0,8 | 9 ± 0,5 | 12 ± 0,9 | 25 ± 0,7 | |
| 3 veckor | 10 | 11 ± 0,8 | 20 ± 0,7 | 10 ± 0,9 | 13 ± 0,2 | 25 ± 0,9 | |
| 6 veckor | 12 | 12 ± 0,5 | 20 ± 0,6 | 9 ± 0,7 | 13 ± 0,5 | 24 ± 0,6 | |
Tabell 1. Höjd av det intraokulära trycket i Murin Magnetic mikrokorn Occlusipå modell. I vaken kvinnliga C57 BL / 6 möss, IOP mättes med en kalibrerad rebound tonometer. Drivs ögon visade en ökning av lOP detekteras vid en vecka efter operationen som förblev förhöjda under minst sex veckor efter ingreppet.
Figur 1. Arbetsflöde av stegen i Murin Magnetic mikrokorn Ocklusion Modell av glaukom. Steg-för-steg beskrivning av alla förfaranden som utförs före, under och efter operationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Ökning av det intraokulära trycket hos den murina Magnetic mikrokorn ocklusion Model. I vakenkvinnliga C57 BL / 6 möss, var IOP mäts med en kalibrerad rebound tonometer. De lOP av mikrokorn-injicerade ögon markant förhöjt vid en vecka efter operationen (ANOVA, p <0,001). De lOP förblev signifikant förhöjd i förhållande till den kontralaterala öga hos injicerade möss under minst 6 veckor (ANOVA, p <0,001). (Intakt: n = 12; 1 vecka: n = 12, 2 veckor: n = 13, 3 veckor: n = 10, 6 veckor: n = 12). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. näthinneganglieceller Död i Murina Magnetiska mikrokorn Ocklusion modell. RGC visualiserades genom immunfärgning av platta monterade näthinnor använder Brn3a i intakta kontroll näthinnor (A) och glaukomatösa näthinnor på 3 och 6 veckor efter mikrokorn injektion för att motverkaokulär hypertension (OHT) (B, C). Skalstrecken: 20 ^ M. (D) Kvantitativ analys bekräftade att mikrokorn injektion resulterade i signifikant RGC soma förlust vid 3 och 6 veckor efter ingreppet i jämförelse med kontrollögon. Densiteten av RGC soma i intakt, icke-glaukom C57 / BL6 möss visas som referens (vita staplar, 100% överlevnad). Värden uttrycks som medelvärde ± SEM (Intakt: n = 23; 1 vecka: n = 6, 2 veckor: n = 6, 3 veckor: n = 12, 6 veckor: n = 10, ANOVA, *** p < 0,001). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. axonal degeneration i Murina Magnetic mikrokorn Ocklusion Model. RGC axoner visualiserades genom färgning av synnerven tvärsnitt med toluidinblått iintakt kontroll (A) och glaukomatösa näthinnor vid 3 och 6 veckor efter mikrokorn injektionen för att inducera okulär hypertension (OHT) (B, C). Skalstrecken: 10 ^ M. (D) Kvantitativ analys bekräftade att mikrokorn injektion resulterade i signifikant RGC axon förlust vid 3 och 6 veckor efter ingreppet i jämförelse med kontrollögon. Densiteten av RGC axoner i intakt, icke-glaukom C57 / BL6 möss visas som referens (vita staplar, 100% överlevnad). Värden uttrycks som medelvärde ± SEM (Intakt: n = 4; 3 veckor: n = 5, 6 veckor: n = 6, ANOVA, *** p <0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Discussion
Tekniken video presenteras här ger detaljerade steg-för-steg-instruktioner om hur du utför intrakameral injektion av magnetiska mikropärlor för att effektivt och reproducerbart framkalla IOP höjd i möss. Denna procedur resulterar i ihållande IOP ökning som inte kräver ytterligare injektioner och främjar detekterbar RGC soma och axon förlust under de första 3 veckorna av okulär hypertension induction.Elevated IOP är en stor riskfaktor för att utveckla glaukom hos människa. Därför är detta en värdefull mus okulär hypertension beroende glaukom modell som har potential för ett brett spektrum av applikationer.
En gemensam nackdel förknippad med injektion av mikrokulor i den främre kammaren hänför till vulst återflöde genom injektionsstället när nålen dras tillbaka, vilket ofta resulterar i endast partiell obstruktion av vattenhaltig utflöde och ökad variabilitet. För att lösa detta problem, har flera viktiga ändringar genomförs. granar t, det noggranna förberedelser av en ren, skarp glas mikronål med en facetterad avfasning är avgörande för en framgångsrik injektion av mikropärlor. En väl förberedd mikronål möjliggör kontrollerad och jämn penetrering av hornhinnan med minimal påläggning av tryck till den känsliga ögonytan. Den lilla hornhinnan punktering förhindrar återflöde av mikropärlor. Dessutom minskar den fina mikronål risken för skada närliggande strukturer såsom iris och linsen, vilket kan leda till icke-sjukdomsrelaterade inflammation. För det andra är tillämpningen av en handhållen magnet för strategiska okulära områden under och efter injektionen en annan viktig aspekt av denna teknik. Under insprutningen är magneten används för att dra de magnetiska mikropärlor till den främre kammaren förhindrar återflöde av de mikropärlor när mikronålen dras tillbaka. Efter injektionen är magneten sedan för att styra mikropärlorna till iridokorneal vinkel för att blockera kammarvattenutflöde.
tält "> Ett annat problem som ofta uppstår i mikrokorn ocklusion modeller är att upprepade pärla injektioner är ofta nödvändigt att uppnå en varaktig IOP höjd 10,11. Detta kan vara ett resultat av mikropärlor lossnar från iridokorneal vinkel med tiden. Kombinationen av en handhållen magnet, såsom beskrivits ovan, och positioneringen av mus-postoperativt kraftigt förbättrar resultatet. användningen av injicerbara narkosmedel, som tillåter flexibilitet för att förflytta huvudet under förfarandet och kräver en längre postoperativ återhämtningsperiod, gynnas. Placering av mus med det opererade ögat uppåt i ett par timmar efter operationen bidrar till reglering av mikrokulor på iridokorneal vinkel och minskar risken för lossnar tillbaka in i den främre kammaren.Att se till att antalet injicerade pärlor är relativt konsekvent är en annan viktig steg för att minimera inter-djurvariationer. Eftersom mikropärlorna lösa på bottom av röret, är det nödvändigt att fullständigt homogenisera mikrokornet lösningen och dra den lämpliga volymen i mikronålen i tid. Injektion av färre pärlor i den främre kammaren kan resultera i ofullständig blockering av vattenstrukturer humor dränering, vilket sannolikt kommer att leda till dålig eller variabel IOP höjd. Notera även det yttersta syftet med mikrokornet injektion är att lyfta IOP, försiktighet bör iakttas vid IOP mätningar från vaken möss är högre än de toppvärden som rapporteras i denna studie (~ 25 mmHg). Extremt höga lOP ökar risken för ischemisk skada och kan även orsaka smärta för djuret. Höjden av IOP bör betraktas som en av många faktorer att bedöma framgången av operationen. Som sådan bör resultatet av förfarandet mätas baseras på flera parametrar inklusive IOP höjd, RGC soma död, och Axon förlust.
Även det protokoll som beskrivs här resulterar i de flesta mikropärlor framgångsrikaly lösa på vinkeln, är en potentiell begränsning av denna modell att dessa pärlor som förblir flytande i den främre kammaren kan störa levande retinal imaging genom hornhinnan, liksom elektro eller beteendemässiga analyser som kräver en effektiv passage av ljus. En annan viktig aspekt att beakta när man använder denna mikrokornet ocklusion modell är att omfattningen av IOP höjd och efterföljande RGC degeneration varierar med ålder och genetisk bakgrund av den opererade mus [4]. Därför kommer omfattningen av IOP höjd och tidslinje RGC degeneration måste fastställas för varje specifik transgen mus linje och / eller åldersgrupp.
Ett inslag i denna modell är att förhöjda lOP resulterar i den gradvisa förlusten av RGC död under de första tre veckorna efter mikrokorn injektion och betydande RGC död detekteras vid 3 veckor efter ingreppet. Hence, möjliggör en undersökning av tidiga och / eller subtila förändringar som sker i detta d denna modellisease före öppen RGC soma och axon förlust. En betydande ökning av RGC död observerades inte mellan 3 och 6 veckor efter induktion av okulär hypertension. I själva verket förblev RGC soma och axon förlust stabil vid ~ 22-25% mellan 3 och 6 veckor trots framgångsrik och ihållande IOP höjd vid dessa tidpunkter. En längre duration av ihållande IOP kan behövas för ytterligare RGC förlust inträffa i C57BL / 6 möss, som verkar vara mer motståndskraftiga mot RGC skada jämfört med andra musstammar. 5 Ytterligare modifieringar till protokollet presenteras här, inklusive justering av pärla storlek och ytterligare injektioner, kan krävas för att studera RGC förlust vid senare tidpunkter. Därför är våra protokoll idealisk för studier fokuserade på tidiga patofysiologiska förändringar som korrelerar med blygsamma RGC neurodegeneration som är relevanta för insättande och tidigt progression i mänsklig glaukom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 ml serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 ml PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P.
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).
