Summary
Her presenterer vi en protokoll for å indusere okulær hypertensjon hos mus øyet som resulterer i tap av gangliecelle som observert i glaukom. Magnetiske mikroperler som injiseres i fremre kammer og tiltrukket av iridocorneal vinkel ved hjelp av en magnet for å blokkere utløpet av kammervann.
Abstract
Bruken av gnager modeller av glaukom har vært avgjørende for å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn patofysiologien av denne multifaktoriell nevrodegenerativ sykdom. Med bruk av en rekke transgene mus linjer, er det økende interesse for induserbare murine modeller av okulær hypertensjon. Her presenterer vi en okklusjon modell av glaukom, basert på injeksjon av magnetiske mikroperler inn i det fremre kammer av øyet ved hjelp av en modifisert Microneedle med en fasettert skråkant. De magnetiske mikroperler er tiltrukket av iridocorneal vinkel ved hjelp av en håndholdt magnet for å blokkere drenering av kammervann fra fremre kammer. Dette avbrudd i vandige dynamiske resulterer i en jevn økning av intraokulært trykk, som senere fører til tap av gangliecelle, som observert i humane pasienter glaukom. Mikroperlens okklusjon modell presentert i dette manuskriptet er enkle i forhold til andre induserbare modeller av glaukom og også høyteffektiv og reproduserbar. Viktigere, modifikasjonene som presenteres her minimalisere vanlige problemer som ofte oppstår i okklusjon modeller. Først, ved bruk av en skrå glass Microneedle hindrer tilbakestrøm av mikroperler, og sikrer at minimal skade oppstår på hornhinnen i løpet av injeksjonen, og dermed redusere skaderelaterte effekter. For det andre sikrer bruken av magnetiske mikroperler evnen til å tiltrekke seg de fleste perler til den iridocorneal vinkel, effektivt redusere antall perler som flyter i det fremre kammer unngå kontakt med andre strukturer (f.eks., Iris, linse). Endelig tillater bruk av en håndholdt magnet fleksibilitet ved håndtering av små mus øyet til effektivt å lede de magnetiske mikroperlene og sikre at det er lite tilbakeløp av mikroperlene fra øyet når den Microneedle trekkes tilbake. Oppsummert mikroperlens okklusjon musemodell som presenteres her er en kraftig undersøkende verktøy for å studere nevrodegenerative endringer som skjer i løpet av utbruddet og progresjon av Glaukoma.
Introduction
Grønn stær er en progressiv og irreversibel blendende tilstand som vil påvirke anslagsvis 80 millioner mennesker verden over i 2020 en. I glaukom pasienter, er synstap forårsaket av selektiv død gangliecelle (RGCs), utgangs nevroner som sender visuell informasjon fra netthinnen til hjernen. Grønn stær er en aldersrelatert nevrodegenerativ sykdom med mange risikofaktorer som den vanligste er forhøyet intraokulært trykk (IOP). Faktisk er IOP den eneste modifiserbar risikofaktor i glaukom og nåværende behandlinger fokusere utelukkende på styring trykk i øyet. Men flere genetiske, cellulære, og miljøfaktorer påvirker utbruddet og progresjon av denne sykdommen. Derfor forstå de forskjellige mekanismer som til slutt bidrar til neuronal død er viktig å utvikle effektive behandlinger for glaukom.
Dyremodeller av glaukom er viktig å studere sykdom patofysiologi og å identifisere og testelovende behandlingsformer. Den økende tilgjengeligheten av transgene mus linjer inkludert betingede knockout stammer og mus som bærer genetisk kodet fluorescerende tracere har drevet behovet for induserbare murine glaukom modeller. Flere gnager modeller av glaukom har blitt utviklet gjennom årene (anmeldt i 2,3). I mange av disse modellene, er glaukom indusert ved å forstyrre kammervæskedynamikk, noe som resulterer i heving av IOP. Okklusjon modeller, der mikroperler eller andre stoffer injiseres inn i fremre kammer av øyet for å blokkere vandig drenering, har vunnet popularitet de siste årene delvis på grunn av sin relativt enkelt å øke IOP 4-14.
Mikroperlens okklusjon modell av glaukom, først gjennomført i primater 12, kaniner og rotter 8, 4,9,11, ble nylig tilpasset for bruk i mus 5,6,10. I disse studiene var intracameral injeksjon av polystyren-mikroperler, alene eller ikombinasjon med et viskoelastisk materiale, resulterte i IOP høyde som fører til etterfølgende RGC døden 6,10. Imidlertid, tilbakeløps når nålen trekkes ut av øyet og løsner mikroperler fra iridocorneal vinkel er vanlige problemer som oppstår under prosedyren. For å minimalisere disse ulempene, har magneter blitt brukt for å tiltrekke seg de magnetiske mikroperlene til iridocorneal vinkelen på øyet 4,9.
Protokollen er beskrevet her er en modifisert prosedyre basert på tidligere studier 9,10 som bruker magnetiske mikroperler og en håndholdt magnet innrettet til muse øyet (figur 1). Flere viktige modifikasjoner har blitt innført i vår protokoll for å sikre effektiv og reproduserbar IOP økning i mus. Først er injeksjon av mikro gjøres ved hjelp av en nøye utarbeidet glass Microneedle med et fasettert skråkant. De resulterende glatte overflater av Microneedle så vel som dets spisse tuppen sikrer at minimal skade erpåført som det punkterer hornhinnen. Bruken av dette glass Microneedle resulterer også i økt kontroll når Microneedle spissen går inn i fremre kammer, og dermed redusere risikoen for å skade nærliggende strukturer som iris og linsen. I tillegg forenkler den lille injeksjon lesjon hornhinneselv reparasjon og reduserer uønskede skaderelaterte effekter.
Sekund, injeksjon av magnetiske mikroperler og bruk av en håndholdt magnet tillate nøyaktig kontroll for å tiltrekke seg kulene til iridocorneal vinkel i små mus øyet. Magnetiske mikroperler som er 4,5 mikrometer i diameter ble brukt fordi denne mikrostørrelse ikke tilstopper forberedt Microneedle åpning og viktigere, når injisert, disse mikro effektivt blokkert drenering av kammervann. Denne tilnærmingen reduserer ikke bare tilbakeløp av de injiserte mikroperler, men sikrer også at et maksimalt antall av mikroperler samler seg i målområdet for å effektivt blokkere vandig humor drenering. furthermore, denne strategien reduserer også antall perler som fløt i fremre kammer unngå kontakt med andre strukturer, slik som iris og linsen, og hindrer passasjen til bakre kammer. Sammen er disse endringene sørge for at mikroinjeksjons operasjonen er utført med relativ letthet og på en riktig måte som resulterer i en svært reproduserbar, effektiv og varig induksjon av okulær hypertensjon hos mus.
Protocol
Følgende fremgangsmåte ble utført i samsvar med retningslinjene i den kanadiske Council on Animal Care for bruk av forsøksdyr og Statement for bruk av dyr i Ophthalmic og Visual Forskning fra Association for Research in Vision og Ophthalmology (ARVO).
1. Klargjøring av Microneedle for Anterior Intracameral Injection
- Med en avtrekker, generere en Microneedle fra et borsilikatglass kapillær
- Under et mikroskop, bruk en skarp kniv til å nøye lage en åpning på tuppen av Microneedle. Den resulterende Åpningen bør ha en elliptisk form med en hovedakse og mindre diameter på omtrent 190 um og 70 um, respektivt. Mål området av den tilberedte Microneedle åpningen av første anskaffe bilder med en linjal plassert under mikroskopet fulgt av kvantifisering ved hjelp av bildeanalyse programvare.
- I mikropipette bevelling systemet, plasser Microneedle med 20 degree vinkel i forhold til avfasningen platen slik at åpningen Microneedle berører platen. Skråkant i ca. 10 minutter inntil kantene er flat og glatt. Tilsett noen dråper av destillert vann for å hjelpe i prosessen.
- Roter Microneedle å bevel de to kantene rundt åpningen til spissen er skarp.
- Rengjør alt rusk og vann fra Microneedle spissen åpning ved hjelp av en aerosol støvkost.
- undersøke nøye det ferdige Microneedle under et mikroskop. Kast mikronåler med brudd for å minimere risikoen for at Microneedle bryte under operasjonen.
- Steriliser Microneedle ved å skylle først med etanol, deretter med steril balanserte saltoppløsning (BSS).
2. Utarbeidelse av den magnetiske mikro Solution
Merk: De magnetiske mikrokuler som brukes i denne undersøkelsen er belagt med epoxygrupper. For å forhindre eventuelle uønskede bivirkninger, slik som klumping av kulene og uønskede molekylære interaksjoner, disse må epoksygrupperførst fjernes fra mikroperlene før fortsetter med injeksjonen kirurgi.
- Fjerning av epoxygrupper fra magnetiske kuler
- Fremstille en oppløsning av 0,02 M natriumhydroksid (NaOH, MW 39,997 g / mol) i 10 x Tris-buffer (MW 121,14 g / mol).
- Forsiktig vortex lager av magnetiske mikroperler oppløsning (4,5 um diameter, 4 x 10 8 kuler / ml) inntil perlene er jevnt suspendert i løsning.
- Raskt pipettér 1 ml av magnetiske kuler oppløsning i 50 ml 0,02 M NaOH i 10 x Tris-buffer.
- Rotere i 24 timer ved romtemperatur for å fjerne epoksygruppene fra kulene.
- Samle perlene ved å feste en magnet til bunnen av røret. Orienter røret horisontalt for å sikre at alle perlene er tiltrukket av magneten. Rotere i ytterligere 4 timer ved RT.
- Med en mikropipette, forsiktig fjerne supernatanten uten å forstyrre pelleten av perler.
- Forsiktig vortex pelleten i 50 ml 10x Tris buffer inntil perlene er godt suspendert.
- Gjenta trinn 2.1.4 til 2.1.6.
- Konsentrasjon og Resuspensjon av magnetiske mikroperler i sterilt Balanced Salt Solution
Merk: Det er nødvendig å konsentrere den lager av magnetiske kuler oppløsning i steril balanserte saltoppløsning (BSS) for å nå en endelig konsentrasjon på 1,6 x 10 6 perler / mikroliter, slik at 2,4 x 10 6 perler kan bli injisert inn i det fremre kammer i en sluttvolum på 1,5 pl, som er passende for den lille musen øyet.
- Vask kulene i 5 ml ultrarent vann laboratorium grad ved forsiktig virvling i 2 minutter.
- Samle perlene ved å tiltrekke dem til bunnen av røret med en magnet.
- Med en mikropipette, forsiktig fjerne vannet uten å forstyrre pelleten av perler.
- Gjenta trinn 2.2.1 til 2.2.3 tre ganger.
- I en laminær hette, vaske perlene med 500 mL av BSS etter pipetting opp og ned. Utfør resten av trinnene i dette avsnittet under sterile forhold i en laminær hette.
- Samle perlene ved å tiltrekke dem til bunnen av røret med en magnet.
- Med en mikropipette, forsiktig fjerne BSS uten å forstyrre pelleten av perler.
- Gjenta trinn 2.2.5 til 2.2.7 tre ganger.
- Resuspender ved pipettering kulene opp og ned i 250 ul BSS.
- Pass på at perle løsningen er godt homogenisert. Deretter raskt Alikvoter 25 ul av suspensjonen i sterilt 0,5 ml rør. Den endelige konsentrasjonen av bestanden vulsten løsningen er 1,6 x 10 6 perler / ul.
- Oppbevar ved 4 ° C.
3. Induksjon av okulær hypertensjon
Merk: Seksjon 3 er en to-person operasjon. I tilfelle at en bestemt handling skal utføres av en bestemt person, er den riktige personen identifisert. Generelt Person 1 håndterer musen under mikroskopet mens Person 2 er responsible for manipulering av mikrosprøyte pumpen. Den totale varigheten av det kirurgiske inngrepet bør være mindre enn 10 min (trinn 03.09 til 03.17).
- Utfør prosedyrer hos voksne C57BL / 6 mus. Huset mus i en standard miljø med tilgang til mat og vann ad libitum. I denne artikkelen bruker kvinnelige C57BL / 6 mus mellom 3 og 4,5 måneders alder. Imidlertid kan denne protokollen tilpasses menn og mus i ulike aldre, samt andre musestammer, inkludert transgene og knockout mus.
- Mål baseline IOP i våken mus før anestesi og mikroinjeksjons med en kalibrert rebound tonometer. Påfør en dråpe proparacaine hydrochloride på hornhinnen.
- holde musen forsiktig ved å holde huden mellom ørene. Plasser musen på stasjonære maskiner, slik at dyret er behagelig og øynene er tilgjengelig. Hold tonometeret vinkelrett på hornhinnen overflaten og ta minst tre sett av ti påfølgende avlesninger per øye å oppnå enIOP gjennomsnittet. Målingen av IOP i våken mus er foretrukket å omgå anestesirelaterte effekter på IOP. Alternativt kan IOP måles i bedøvet mus etter trinn 3.4.
- Forbered et lager mus cocktail anestesi blanding bestående av 20 mg / ml ketamin, 2 mg / ml xylazin, og 0,4 mg / ml acepromazine.
- Indusere anestesi i mus ved intraperitoneal administrering av cocktail blanding (1 ul / g kroppsvekt). Bruken av et injiserbart bedøvelsesmiddel cocktail er foretrukket fremfor gass anestetika (f.eks isofluran) fordi den gir fleksibilitet ved håndtering av mus hode som at dyret ikke er koblet til en innåndingsmaske. Dessuten, jo lenger restitusjonsperiode er nødvendig med et injiserbart bedøvelsesmiddel sikrer at mikroperler slå seg ned på iridocorneal vinkel uten løsner tilbake inn i det fremre kammer.
- Administrer 0,05 mg per kg kroppsvekt av buprenorfin subkutant.
- Unn øyet med en tropikamid eye slippe å indusere elev dilatasjon. På grunn av den lille størrelsen på de murine fremre kammer, må eleven skal utvides for enkelt å visualisere posisjonering og fremme av Microneedle under injeksjon.
- Gjelder topisk salve på den kontralaterale øye (ikke-operert) for å unngå uttørking av hornhinnen i løpet av prosedyren.
- Fest en ren Microneedle til injeksjon montering av mikrosprøyte pumpen. Bytt Microneedle etter hver operasjon for å unngå kryss-dyr forurensning.
- Person 1: Overfør bedøvet mus til driftsplattform. Under mikroskopet, sørge for at eleven er fullt utvidet og at de okulære muskler er avslappet, slik at det ikke er noen øyebevegelser. Fraværet av øyebevegelser sikrer stabilitet under injeksjonen. Tørk forsiktig rulle tropikamid øyet fra øyet ved hjelp av absorberende kompresser.
- Person 2: Bland den magnetiske mikro oppløsningen ved å pipettere opp og ned.
- Ved hjelp av mikrosprøyte pumpen umiddelbart laste microneedle (utarbeidet i seksjon 1) med 1,5 mL av homogenis magnetiske mikro løsning (2,4 x 10 6 perler). Sørg for at luftbobler er fraværende på tuppen av Microneedle. Etter at Microneedle er lastet, utfører trinn 03.12 til 03.13 så raskt som mulig, slik at den magnetiske mikro løsningen forblir i en homogen suspensjon.
- Plasser lastet Microneedle i en 45 ° vinkel som er lagt anteriorly forhold til limbus. Person 1: støtte øyet ved hjelp av plast tang. Sørg for at vinkelen mellom Microneedle og plast pinsett er ca 90 °.
- Person 2: Med den lastede Microneedle, forsiktig punktere hornhinnen slik at spissen av den Microneedle kommer inn i fremre kammer. Sørg for at lastet Microneedle forblir i 45 ° vinkel i forhold til limbus under punktering. Unngå kontakt med linsen eller iris. Kontroller at Microneedle ikke kommer inn i bakre kammer. Person 1: fortsette å støtte øyetbruke plast pinsett.
- Person 1: Uten å bevege musen hode, plassere magneten ved siden av øyet, på motsatt side til den Microneedle spissen, for å tiltrekke seg de magnetiske kuler i det fremre kammer og minimalisere kontakt av perlene med den indre overflaten av hornhinnen. Person 2: Ved å bruke mikrosprøyte pumpen, injiseres 1,5 mL av den magnetiske kuler oppløsningen inn i det fremre kammer. Mikroperlens Oppløsningen injiseres i løpet av en periode på 15 til 30 sek. Person 1: Fortsett å holde magneten på motsatt side av Microneedle spissen under hele varigheten av injeksjonen.
- Person 2: Etter at hele volumet av perler er blitt injisert, langsomt trekke Microneedle fra øyet. Person 1: For å unngå tilbakeløps av mikroperlene, fortsetter å tiltrekke seg de magnetiske kuler mot den fremre kammer ved å holde magneten ved siden av øyet i ytterligere 30 til 60 sek.
- Person 1: Bruke magnet, tiltrekke perlene til iridocorneal vinkel. Sørg for at perlene danner en jevnt fordelt ringrundt omkretsen av det fremre kammer. I løpet av dette trinnet, unngå å tiltrekke perler til hornhinnen som de har en tendens til å feste til den indre overflate av hornhinnen ved kontakt.
- Behandle det opererte øyet med et antibiotikum øyedråper for å minimalisere risikoen for infeksjon.
- La musen til å gjenopprette på en varmepute før helt våken (~ 3-4 timer). Plasser musen slik at det opererte øyet er vendt oppover. Denne posisjoneringen vil forhindre opphopning av de injiserte perlene til den indre overflate av hornhinnen ved gravitasjonskraft. I tillegg vil denne posisjonen redusere potensialet for infeksjon som det opererte øyet ikke kommer i kontakt med noen sengetøy og / eller andre materialer som kan være tilstede i buret. I tilfelle at et dyr viser noen tegn til ubehag, administrere flere doser av buprenorfin etter behov.
- Tillat mus å komme seg fra prosedyren for minst 2 dager før du tar IOP målinger. Mål IOP som beskrevet i 3.2. Monitor IOP minst en gang i uken eller oftere, etter behov, og på samme tid på dagen for å minimalisere døgnrytmen relaterte svingninger.
- For IOP målinger, bruke den kontralaterale øyet fra opererte mus som en intern kontroll. Alternativt kan du bruke målinger fra intakte, ikke-opererte eller humbug-opererte mus som naive kontroller.
4. Vurdering av gangliecelle Soma og Axon Survival
- Perfuse mus utsatt for okulær hypertensjon ved intracardial injeksjon av 0,1 M fosfatbufferoppløsning (PBS) umiddelbart etterfulgt av iskald 4% paraformaldehyd (PFA).
- Perfuse intakte, ikke-opererte mus som beskrevet i 4.1 og bruke dem som uskadde kontroller. Bruken av kontralaterale øynene fra opererte mus er ikke anbefalt å vurdere RGC overlevelse fordi endringer i kontralaterale øynene etter skade har blitt rapportert 15,16 og kan forvirre data tolkning. Alternativt kan du bruke humbug-opererte øyne injisert med en.5 ML av BSS som kontroller.
- Ved hjelp microscissors, må du kutte bindevevet rundt øynene for å isolere den fra øyehulen. Separer synsnerven fra øyet ved å kutte det på nivået av synsnervehodet.
- Ved å bruke en 30 G nål, lage et hull i hornhinnen for å tillate penetrering av fikserløsningen inn i øyet. Plasserer øyet i 4% PFA og inkuberes i 1 time ved 4 ° C for ytterligere fiksering.
- Plasser synsnerven i en oppløsning inneholdende 2% PFA og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylat (MW: 214 g / mol) og inkuberes O / N ved 4 ° C for ytterligere fiksering.
5. Kvantifisering av RGC Soma tetthet på Flat-monterte netthinne
Merk: Følgende prosedyre er tilpasset fra en protokoll med Nadal-Nicolas et al 17 og skisserer kvantifisering av RGCs ved hjelp av et antistoff mot hjernen spesifikke homeobox / POU domene protein 3A (Brn3a) på netthinnen flat mounts.. alternative methods for merking RGCs kan også brukes, inkludert immunhistokjemi med et antistoff mot RNA-bindende protein med flere spleising (RBPMS) eller retrograd merking med Fluorogold eller Dil.
- Under en dissekere mikroskop, fjerner fremre delen av øyet ved å lage et snitt langs hele limbus inntil hornhinnen løsner lett. Fjern hornhinnen og linsen. løsne forsiktig netthinnen i øyet ved å gjøre kutt langs ora serrata og synsnerven.
- Forbered en retinal flat-mount ved å lage fire små like langt snitt fra periferien av netthinnen mot synsnerven til klart avgrense de fire netthinnens kvadranter. Ved hjelp av en liten børste, forsiktig fjerne eventuelle gjenværende glasslegemet fra netthinnen. Fjerning av så mye som mulig glasslegemet er avgjørende for å oppnå en ren og sterk immunhistokjemisk signal.
- overføre netthinnen forsiktig til en 48-brønners flatbunnet kulturplate inneholdende 0,5% Triton X-100 i PBS, slik at netthinnen erfrittflytende. Kontroller at ganglion celle laget er vendt oppover.
- Plasser kulturplaten ved -70 ° C i 15 min. Etter tining netthinne, ytterligere permeabilize ved vasking to ganger i frisk 2% Triton X-100 i PBS.
- Fortynn antistoffet Brn3a til 0,3 til 0,5 ug / ml med PBS inneholdende 2% Triton X-100 og 2% normalt esel serum. Inkuber netthinnen i Brn3a primær antistoffløsning ved forsiktig risting O / N ved 4 ° C. Netthinne bør være fullstendig nedsenket i 150 til 200 ul av løsningen til enhver tid.
- Fortynn esel anti-geite-IgG sekundært antistoff til 2 ug / ml med PBS inneholdende 2% Triton X-100 og inkuber netthinnen i denne oppløsning i 2 timer ved romtemperatur med forsiktig risting. Netthinnen bør være fullt nedsenket i antistoffløsningen til enhver tid. Dekk kultur plate med aluminiumsfolie for de resterende skritt for å hindre fotobleking.
- Ved hjelp av en pensel, overføre nøye netthinnen til et lysbilde, slik at vevet ligger så flatt som poslig. Lufttørke i 10 min. Monter ved hjelp av anti-fade monteringsmedium.
- Undersøk retinal flat-festene i fluorescerende mikroskop. Kvantifisere antall Brn3a positive RGCs i tre ikke-overlappende områder per retinal kvadrant som beskrevet. 18
6. Kvantifisering av RGC Axoner på synsnerven Tverrprofiler
- Samle synsnerven fra trinn 4.5 og inkuberes i 2% osmiumtetroksid (OsO 4, MW 254,23 g / mol) i 2 timer.
Forsiktig: På grunn av sin høye giftighet, osmiumtetroksyd skal håndteres i et avtrekksskap med egnet laboratorium antrekk. - Dehydratisere den optiske nerven ved å dyppe det i økende konsentrasjoner av etanol (50%, 70%, 90%, 95% og 100%) i 15 minutter hver.
- Fremstille epoksyharpiks ved hjelp av følgende oppskrift: 15,72 ml Bygg-812, 6,45 ml dodecenyl-ravsyreanhydrid, 7,83 ml nadic methyl anhydride, 0,45 ml DMP-30.
- Sekvensielt ruge synsnerven i løsninger sammensattav følgende forhold av epoksyharpiks til propylenoksyd (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25 og 1: 0. Synsnerven inkuberes i hver løsning ved romtemperatur i en O / N periode.
- Inkuber synsnerver innleiret i 100% epoksyharpiks (siste trinn fra 6,4) ved 60 ° C i ytterligere 48 timer.
- Generer semi-tynne synsnerven tverrsnitt (0,75 mikrometer) med en mikrotom.
- Flekk synsnerven tverrsnitt med 1% toluidinblått.
- Kvantifisere RGC axoner i fem ikke-overlappende områder av hver synsnerven seksjon som beskrevet 19.
Representative Results
Injeksjon av magnetiske mikroperler inn i det fremre kammer av voksne mus som er beskrevet i denne protokollen resulterte i en sterk og reproduserbar heving av IOP. En uke etter inngrepet, økt intraokulært trykk fra 10 ± 0,6 mm Hg (gjennomsnitt ± SEM), gjennomsnittlig baseline IOP i kontralaterale øyne, til 19 ± 0,5 mm Hg hos hypertensive øynene (Student t-test; *** p <0,001, n = 12, tabell 1, figur 2). IOP stabilisert etterpå og forble forhøyet på et gjennomsnitt på 20 mm Hg i minst 6 uker, den lengste tids punkt undersøkt i denne studien. Den midlere topp IOP i mikroperle-injisert øyne på 2, 3 og 6 uker etter operasjonen var 25 mm Hg. De aller fleste av behandlede musene vedvarende høy IOP, derfor denne protokollen ikke krever en andre injeksjon av mikroperler.
For å vurdere tids løpet av RGC tap i denne modellen, RGC soma varførst kvantifisert ved farging med Brn3a, en RGC-spesifikk markør 17. Antallet Brn3a-positive celler ble kvantifisert på flatmontert netthinne ved 1, 2, 3 og 6 uker etter induksjon av okulær hypertensjon. Selv om en betydelig IOP høyde ble oppdaget så tidlig som en uke etter mikroinjeksjon, ble ingen signifikant tap av RGC soma observert i løpet av de 2 første ukene av prosedyren (figur 3). Betydelig RGC død (22%), men var tydelig på 3 uker (2,430 ± 67 RGCs / mm 2, middelverdi ± SEM, n = 12) og 6 uker (2350 ± 74 RGCs / mm 2, n = 10) post- induksjon av okulær hypertensjon, sammenlignet med intakte kontroll øynene fra ikke-operert mus (3,141 ± 49 RGCs / mm 2, n = 23) (ANOVA, p <0,001).
Dysfunksjon og degenerasjon av RGC axons er en kardinal funksjon av glaukom. Derfor ble aksonal tap undersøkt ved 3 og 6 uker etter injeksjonen av mikroperlekvantifisering av RGC axoner i synsnerven tverrsnitt farget med toluidinblått (figur 4). En betydelig tap av RGC axoner (25%) ble observert ved 3 uker (28,401 ± 702 aksoner / nerve, gjennomsnitt ± SEM, n = 5) og 6 uker (29,426 ± 948 aksoner / nerve, n = 6) etter injeksjon av mikroperler sammenlignet med intakte synsnerver fra un-opererte øyne (39467 ± 137 aksoner / nerve, n = 4) (ANOVA, p <0,001). Sammen er disse data viser at injeksjon av magnetiske mikroperler inn i det fremre kammer mus fører til reproduserbar og vedvarende IOP høyde som resulterer i RGC soma og axon degenerasjon.
| Tid etter OHT kirurgi | N | IOP (mmHg) ± SEM | Peak IOP (mmHg) | ||||
| Kontralateralt | glaukom | difference | Kontralateralt | glaukom | |||
| 1 uke | 12 | 10 ± 0,4 | 19 ± 0,5 | 9 ± 0,6 | 12 ± 0,4 | 22 ± 0,6 | |
| 2 uker | 1. 3 | 11 ± 0,5 | 20 ± 0,8 | 9 ± 0,5 | 12 ± 0,9 | 25 ± 0,7 | |
| 3 uker | 10 | 11 ± 0,8 | 20 ± 0,7 | 10 ± 0,9 | 13 ± 0,2 | 25 ± 0,9 | |
| 6 uker | 12 | 12 ± 0,5 | 20 ± 0,6 | 9 ± 0,7 | 13 ± 0,5 | 24 ± 0,6 | |
Tabell 1. Heving av intraokulært trykk i Murine Magnetic mikro Occlusipå Model. I våken kvinnelige C57 BL / 6 mus, IOP ble målt ved hjelp av en kalibrert rebound tonometer. Opererte øynene vises en økning i IOP oppdaget på en uke etter operasjonen som forble forhøyet i minst seks uker etter inngrepet.
Figur 1. Arbeidsflyt av trinnene involvert i Murine Magnetic mikro Okklusjon modell av Grønn stær. Steg-for-steg beskrivelse av alle prosedyrer utført før, under og etter operasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Økning i intraokulært trykk i Murine Magnetic mikro Okklusjon Model. I våkenkvinnelige C57 BL / 6-mus, IOP ble målt ved anvendelse av en kalibrert rebound tonometer. IOPS av mikro-injisert øyne var signifikant forhøyet i en uke etter operasjonen (ANOVA, p <0,001). De IOP ble betydelig forhøyet i forhold til den kontralaterale øyet av injiserte mus i minst 6 uker (ANOVA, p <0,001). (Intakt: n = 12, 1 uke: n = 12, 2 uker: n = 13, 3 uker: n = 10, 6 uker: n = 12). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. gangliecelle Døden i Murine Magnetiske mikro Okklusjon modell. RGCs ble visualisert ved farging av flatmontert netthinne ved hjelp Brn3a i intakte kontroll netthinne (A) og glaukomatøse netthinne ved 3 og 6 uker etter mikro injeksjon for å utløseokulær hypertensjon (OHT) (B, C). Skala barer: 20 mikrometer. (D) Kvantitativ analyse bekreftet at mikroperle injeksjon resulterte i signifikant RGC soma tap på 3 og 6 uker etter inngrepet sammenlignet med kontroll-øynene. Tettheten av RGC soma i intakt, ikke-glaucomatous C57 / BL6 mus er vist som referanse (hvite striper, 100% overlevelse). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (Intakt: n = 23; 1 uke: n = 6, 2 uker: n = 6, 3 uker: n = 12, 6 uker: n = 10, ANOVA, *** p < 0,001). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. aksonal degenerasjon i Murine Magnetic mikroperlens Okklusjon Model. RGC axons ble visualisert ved farging av synsnerve tverrsnitt med toluidinblått iintakt kontroll (A) og glaukomatøse netthinne 3 og 6 uker etter injeksjon for å utløse mikroperle okulær hypertensjon (OHT) (B, C). Skala barer: 10 mikrometer. (D) Kvantitativ analyse bekreftet at mikroperle injeksjon resulterte i signifikant RGC akson tap på 3 og 6 uker etter inngrepet sammenlignet med kontroll-øynene. Tettheten av RGC aksoner i intakt, ikke-glaucomatous C57 / BL6-mus er vist som referanse (hvite streker, 100% overlevelse). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (Intakt: n = 4, 3 uker: n = 5, 6 uker: n = 6, ANOVA, *** p <0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Discussion
Videoen teknikken som presenteres her gir detaljerte steg-for-steg instruksjoner om hvordan du utfører intracameral injeksjon av magnetiske mikro å effektivt og reproduserbart indusere IOP heving i mus. Denne prosedyren resulterer i vedvarende IOP økning som ikke krever ytterligere injeksjoner og fremmer påvisbare RGC soma og axon tap i løpet av de første 3 ukene av okulær hypertensjon induction.Elevated IOP er en viktig risikofaktor for utvikling av glaukom hos mennesker. Derfor er dette et verdifullt murin okulær hypertensjon avhengig glaukom modell som har potensial for et bredt spekter av applikasjoner.
En vanlig ulempe i forbindelse med injeksjon av mikroperler inn i det fremre kammer er knyttet til å perle tilbakeløp gjennom injeksjonsstedet når nålen er trukket tilbake, noe som ofte resulterer i bare delvis obstruksjon av vandig strøm, og økt variasjon. For å løse dette problemet, ble flere viktige endringer implementert. Firs t, forsiktig fremstilling av en ren, skarp glass Microneedle med et fasettert skråkant er en forutsetning for en vellykket injeksjon av mikroperlene. Et riktig fremstilt Microneedle muliggjør kontrollert og jevn penetrering av hornhinnen med minimal anvendelse av trykk til den skjøre okulære overflaten. Den lille hornhinnen punktering forhindrer tilbakestrømning av mikroperler. I tillegg reduserer den fine Microneedle risiko for skader på nærliggende strukturer som iris og linsen, noe som kan resultere i ikke-sykdom relatert betennelse. For det andre, anvendelse av en håndholdt magnet til strategiske okulære områder under og etter injeksjonen er et annet viktig aspekt ved denne teknikken. I løpet av injeksjonen, blir magneten brukes til å trekke de magnetiske mikroperlene til den fremre kammer hindre tilbakeløp av mikroperlene når Microneedle trekkes tilbake. Etter injeksjonen blir magneten så brukt til å dirigere mikroperlene til iridocorneal vinkel for å blokkere vandig humor utstrømning.
telt "> Et annet problem som ofte oppstår i mikro okklusjon modeller er at gjentatte kule injeksjoner er ofte nødvendig for å oppnå varig IOP høyde 10,11. Dette kan være et resultat av mikroperler løsner fra iridocorneal vinkel med tiden. Kombinasjonen av en håndholdt magnet, som beskrevet ovenfor, og posisjoneringen av mus postoperativt i stor grad forbedrer resultatet. bruken av injiserbare bedøvelsesmidler, som tillater fleksibilitet til å bevege hodet i løpet av prosedyren og krever en lengre postoperativ restitusjonsperiode, er foretrukket. plassering av mus med det opererte øyet vendt oppover for et par timer etter operasjonen bidrar til oppgjør av mikroperler på iridocorneal vinkel og reduserer risikoen for omplassering tilbake i fremre kammer.Sikre at antall injiserte perler er relativt konsekvent er et annet viktig skritt for å minimere interdyre variasjoner. Siden mikro bosette på bottom av røret, er det nødvendig å fullt homogen mikroperlens løsning og ta ut riktig volum inn i Microneedle på en riktig måte. Injeksjon av færre perler inn i fremre kammer kan resultere i ufullstendig blokkering av de vandige humor drenering strukturer, noe som sannsynligvis vil resultere i dårlig eller variabel IOP høyde. Av notatet, selv om det endelige formålet med mikroinjeksjons er å heve IOP, forsiktighet bør tas når IOP målinger fra våken mus er høyere enn toppverdiene rapportert i denne studien (~ 25 mmHg). Ekstremt høye IOP øke risikoen for iskemisk skade og kan også forårsake smerte for dyret. Høyden av IOP bør vurderes som en av mange faktorer å vurdere hvor vellykket operasjonen. Som sådan bør resultatet av fremgangsmåten måles basert på flere parametere inkludert IOP høyde, RGC soma død, og axon tap.
Selv protokollen som er beskrevet her resulterer i de fleste mikroperler vellykkedely settling på vinkelen, en potensiell begrensning av denne modellen er at disse perler som forblir flytende i fremre kammer kan forstyrre med levende retinal bildebehandling gjennom hornhinnen, samt elektrofysiologiske eller atferdsmessige analyser som krever effektiv passasje av lys. Et annet viktig aspekt å vurdere når utnytte denne mikro okklusjon modellen er at omfanget av IOP heving og påfølgende RGC degenerasjon varierer med alder og genetisk bakgrunn av det opererte mus [4]. Derfor vil omfanget av IOP høyde og tids av RGC degenerasjon må bestemmes for hver enkelt transgen muselinje og / eller aldersgruppe.
Et trekk ved denne modellen er at forhøyet IOP fører til gradvis tap av RGC død i løpet av de tre første ukene etter mikroinjeksjon, og betydelig RGC død blir oppdaget på 3 uker etter inngrepet. Derfor gjør denne modellen undersøkelse av tidlige og / eller subtile endringer som oppstår i denne disease, før utilslørt RGC soma og axon tap. ble det ikke observert en betydelig økning i RGC død mellom 3 og 6 uker etter induksjon av okulær hypertensjon. Faktisk, forble RGC soma og axon tapet stabilt på ~ 22-25% mellom 3 og 6 uker til tross for vellykket og vedvarende IOP høyde på følgende tidspunkter. En lengre varighet av vedvarende IOP kan være nødvendig for ytterligere RGC tap å skje i C57BL / 6 mus, som synes å være mer motstandsdyktig mot RGC skade enn andre musestammer. 5 Ytterligere modifikasjoner til protokollen som presenteres her, herunder tilpasning av perle størrelse og ytterligere injeksjoner kan være nødvendig å studere RGC tap på senere tidspunkter. Derfor er vår protokoll ideell for studier fokusert på tidlig patofysiologiske endringer som korrelerer med beskjedne RGC nevrodegenerasjon som er relevante for utbruddet og tidlig progresjon i menneskelig glaukom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 ml serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 ml PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P.
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).
