Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).
“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.
وحددت "القسيم" الكلاسيكي كما مناطق إعادة التركيب الانتصافي قمعت في مجال علم الوراثة واعترف فيما بعد انقباض الأساسي من الكروموسومات الإنقسامية، والتي تلعب دورا أساسيا في فصل كروموسوم دقيقة أثناء الانقسام. وصفت "Kinetochores" مثل الهياكل متعددة الطبقات التي ترتبط الأنابيب الدقيقة على سطح القسيم، كما يتضح من المجهر الإلكتروني. تم تعريف "kinetochores" فيما بعد باسم معقد جزيء أن يموضع في السنترومير من الكروموسومات الإنقسامية. وعلى الرغم من الاختلاف الكبير في تسلسل الحمض النووي القسيم المركزي بين الفقاريات، هيكل الحيز الحركي والتكوين يتم حفظها للغاية. مطلوب التفاعل الديناميكي بين ميكروتثبول المغزل والحيز الحركي للفصل المؤمنين من الصبغيات أثناء الانقسام، والعيوب في السنترومير-الحيز الحركي وظيفة يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات وبالتالي السرطان.
السنترومير في معظم حقيقيات النوىلا يوجد لديه تسلسل الحمض النووي محددة، ولكن يتكون من صفائف كبيرة (0،3-5 ميجا بايت) من الحمض النووي alphoid المتكررة التي تتكون من 171-BP الحمض النووي α قنوات فضائية. إلا في مهدها الخميرة، ويتحقق هوية السنترومير وليس عن طريق تسلسل الحمض النووي ولكن من خلال وجود جسيم نووي الخاصة التي تحتوي على هيستون H3 البديل CenH3 (السنترومير البروتين A [CENP-A] في البشر). 5 CENP-A جسيم نووي توطين ل لوحة الداخلية kinetochores الثدييات 7 و ربط على الحمض النووي α-الأقمار الصناعية 171-BP. تتطلب القسيم النشطة CENP المحتوية على وجسيم نووي لتوجيه توظيف شبكة التأسيسية المرتبطة السنترومير (CCAN) والبروتينات الحيز الحركي، التي تنظم معا المرفق من الكروموسومات إلى المغزل الإنقسامية وتقدم دورة لاحقة عبر حاجز المغزل.
في ضوء الأدلة أعلاه، فقد اقترح CENP-A ليكون علامة جينية من السنترومير 8؛ ومع ذلك، فإن العملية التي يتم تضمينها CENP-A طn لالحمض النووي القسيم المركزي والعوامل المسؤولة عن هذا التأسيس حتى الآن لم يتم توصيفه جيدا. ونطاق استهداف السنترومير قصيرة (CATD) يقيم في هيستون أضعاف منطقة CENP-A، واستبدال المنطقة المقابلة من H3 مع CATD كافية لH3 المباشر إلى السنترومير، واقترحت 9 دراسات عدة أدوار وظيفية لمرحلة ما بعد متعدية تعديل (PTM) من CENP-A 12-16. ومع ذلك، لم يتم بعد إجمال الآليات الجزيئية لهذه PTMs من CENP-A في التوظيف لالقسيم. ذكرنا سابقا أن CUL4A-RBX1-COPS8 E3 النشاط يغاز مطلوب للCENP-A K124 ubiquitylation وتوطين CENP-A إلى القسيم 17
وقد أدى اكتشاف وتوصيف البروتينات الحيز الحركي إلى رؤية جديدة بشأن العزل الصبغي. وقد تم تحديد 18 أكثر من 100 من عناصر الحيز الحركي في خلايا الفقاريات التي كتبها نهج مختلف. 19،20 وكيلمكانة كيفية تجميع kinetochores وظيفة تأتي أيضا من توصيف الوظائف الخلوية من كل شبكة البروتينات الحيز الحركي-السنترومير والبروتين البروتين داخل الخلايا. 19 التصور المباشر والتصوير المتقدمة الأساليب في مضان المجهري توفر قرار ملحوظا من مكونات السنترومير الحيز الحركي وتسمح الملاحظة المباشرة من مكونات جزيئية معينة من القسيم وkinetochores. وبالإضافة إلى ذلك، أساليب مناعي غير مباشر (معهد التمويل الدولي) تلطيخ باستخدام أجسام مضادة محددة ذات أهمية حاسمة لهذه الملاحظات. ومع ذلك، على الرغم من العديد من التقارير حول بروتوكولات معهد التمويل الدولي، وعدد قليل مناقشتها في مشاكل التفاصيل بروتينات معينة، السنترومير الحيز الحركي 1-4 وهكذا، وتطوير وسائل معهد التمويل الدولي تلطيخ وفحص معهد التمويل الدولي الكمي التقارير إلى تحليل تحديدا كل من البروتين السنترومير الحيز الحركي أمر مهم للغاية. في معهد التمويل الدولي تلطيخ، ينبغي للمرء أن المضي قدما في بروتوكول تلطيخ لتجنب فقدان البروتين في المصالح أوبقية الخلية. ومع ذلك، تثبيت يدمر مواقع المستضدات في بعض الأحيان، ومختلف مجموعات الضد مستضد عمل سيئة مع تثبيتي واحد، ولكن بشكل جيد جدا مع آخر، 21 واختيار تثبيتي يعتمد إلى حد كبير على البروتين (ق) من الفائدة. لذلك، وأساليب مختلفة تثبيتي حاسمة في تلطيخ معهد التمويل الدولي من البروتينات السنترومير الحيز الحركي.
وقد تم تطوير أساليب هنا الأمثل للمناعي غير مباشر (معهد التمويل الدولي) تلطيخ ومقايسة لمعالجة توطين البروتينات السنترومير الحيز الحركي الذاتية، بما في ذلك CENP-A والعلم الموسومة الخارجية البروتينات CENP-A، والكميات من هذه البروتينات في الخلايا البشرية. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحليل البروتينات السنترومير الحيز الحركي في الأنواع الأخرى.
في السنوات الأخيرة قد وضعت العديد من الدراسات المختلفة المقايسات المجهر الكمي للخلايا ثابتة. 42 التقدم في علم الأحياء السنترومير-الحيز الحركي وغالبا ما يتطلب فهم وظيفة السنترومير محددة أو الحيز الحركي محددة من البروتينات التي التحت خلوية تنظيم المكانية والزم?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM68418.
Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |