Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).
“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.
"Centromeren" werden klassiek gedefinieerd als gebieden onderdrukt meiotische recombinatie in de genetica en later gezien als het belangrijkste vernauwing van mitotische chromosomen, die een essentiële rol speelt nauwkeurige chromosoomsegregatie in mitose. "Kinetochoren" werden beschreven als het meerlagige structuren die binden aan microtubuli aan het oppervlak centromeren, zoals aangetoond door elektronenmicroscopie; "Kinetochoren" werden later gedefinieerd als macromoleculaire complex localiseert in het centromeer van mitotische chromosomen. Ondanks een dramatisch verschil in centromeer DNA-sequenties bij vertebraten, kinetochoor structuur en samenstelling sterk geconserveerd. Een dynamische interactie tussen spindel microtubuli en het kinetochoor vereist voor trouwe segregatie van chromosomen tijdens de mitose en defecten in centromeer-kinetochoor functie leidt tot aneuploïdie en daardoor kanker.
Het centromeer in de meeste eukaryotengeen gedefinieerde DNA-sequentie, maar is samengesteld uit grote arrays (0,3-5 Mb) repeterende alphoid DNA bestaat uit 171 bp α-satelliet DNA. Behalve in gist, wordt centromeer identiteit bereikt niet de DNA-sequentie, maar door de aanwezigheid van een speciale nucleosomen die de histon H3 variant CenH3 bevat (centromeer eiwit A [CENP-A] bij de mens). 5 CENP-A nucleosomen lokaliseren de binnenste plaat van zoogdier kinetochoren 7 en binden aan de 171-bp α-satelliet DNA. Actieve centromeres vereisen CENP-A-bevattende nucleosomen voor de aanwerving van een constitutieve-centromeer geassocieerd netwerk (CKan) en de kinetochoor eiwitten te leiden, die samen reguleren van de aanhechting van de chromosomen van de mitotische spindel en de daarop volgende cyclus progressie door de spil checkpoint.
In het licht van het bovenstaande bewijs heeft CENP-A voorgesteld om de epigenetische merkteken van het centromeer 8 zijn; echter, het proces waardoor CENP-A opgenomen into centromeer DNA en de factoren die tot deze opname nog niet goed gekarakteriseerd. Een korte-centromeer doeldomein (CATD) ligt in het histon voudige regio CENP-A, en vervanging van het overeenkomstige gebied van H3 de CATD zorgdragen om H3 het centromeer. 9 Verschillende studies suggereerde functionele rol voor post-translationele modificatie (PTM) van CENP-A 12-16; De moleculaire mechanismen van deze PTMs van CENP-A in de rekrutering van centromeren nog niet opgehelderd. We hebben eerder gemeld dat CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase activiteit is vereist voor CENP-A K124 ubiquitinering en lokalisatie van CENP-A naar centromeres. 17
De ontdekking en karakterisering van kinetochore eiwitten hebben geleid tot nieuwe inzichten over chromosoomscheiding. 18 meer dan 100 kinetochoor componenten zijn in gewervelde cellen die door verschillende benaderingen. 19,20 Een onderstaande hoe kinetochoren assembleren en functie komt ook uit het karakteriseren van de cellulaire functies van elke centromeer-kinetochoor eiwitten en eiwit-eiwit netwerk in cellen. 19 Directe visualisatie en geavanceerde imaging werkwijzen fluorescentiemicroscopie bieden opmerkelijke resolutie van centromeer-kinetochore componenten en laat directe observatie van de specifieke moleculaire componenten van de centromeren en kinetochoren. Bovendien, de methoden van indirecte immunofluorescentie (IIF) kleuring met behulp van specifieke antilichamen zijn cruciaal voor deze waarnemingen. Ondanks talrijke rapporten over IIF protocollen weinig besproken problemen specifieke centromeer-kinetochore eiwitten. 1-4 Zo ontwikkelen en rapporteringsmethoden van IIF kleuring en een kwantitatieve bepaling om IIF specifiek wat elke centromeer-kinetochoor eiwit is zeer belangrijk. In IIF kleuring, moet men overgaan tot de kleuringsprotocol verlies van het eiwit van belang voorkomen ofde rest van de cel. Echter, fixatie vernietigt antigene plaatsen af en verschillende antilichaam-antigeen combinaties werken slecht met een fixatief, maar zeer goed met elkaar, en 21 keuze fixeermiddel hangt grotendeels af van de eiwit (ten) van belang. Daarom verschillende fixerende methoden zijn van cruciaal belang in IIF kleuring van centromeer-kinetochoor eiwitten.
Hier geoptimaliseerde werkwijzen voor indirecte immunofluorescentie (IIF) kleuring en een test om lokalisatie van endogeen centromeer-kinetochore eiwitten, waaronder CENP-A en Flag-tagged exogene CENP-A eiwitten en kwantificering van deze eiwitten in menselijke cellen aanpakken ontwikkeld. Deze methoden kunnen worden toegepast op de analyse van centromeer-kinetochore eiwitten in andere species.
De laatste jaren zijn veel studies verschillende kwantitatieve microscopie assays ontwikkeld voor gefixeerde cellen. 42 Progress in centromeer-kinetochoor biologie vereist vaak een begrip van de centromeer-specifieke of kinetochoor specifieke functie van eiwitten waarvan subcellulaire ruimtelijk-temporele regulering weerspiegelt de veranderende functies deze eiwitten tijdens celcyclus. Daarom hier ontwikkelden wij werkwijzen IIF kleuring en een kwantitatieve bepaling om IIF specifiek wat de relatieve niveaus …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie GM68418.
Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |