Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).
“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.
"centrômeros" foram classicamente definidos como regiões de recombinação meiótica suprimida em genética e, mais tarde reconhecida como a constrição primária de cromossomos mitóticos, que desempenha um papel essencial na segregação cromossômica precisas durante a mitose. "cinetócoros" foram descritos como as estruturas em camadas múltiplas que se ligam aos microtúbulos na superfície de centrómeros, conforme revelado por microscopia electrónica; "cinetócoros" foram definidos mais tarde, como o complexo macromolecular que localiza no centrômero dos cromossomos mitóticos. Apesar da divergência dramática de sequências de ADN centromérico entre os vertebrados, cinetócoro estrutura e composição são altamente conservadas. A interacção dinâmica entre os microtúbulos do fuso e do kinetochore é necessário para a segregação fiel de cromossomos durante a mitose e defeitos na função centrômero-kinetochore levam a aneuploidia e, assim, o câncer.
O centrómero na maioria dos eucariotasnão tem nenhuma sequência de ADN definida, mas é composto por matrizes grandes (0,3-5) Mb de ADN repetitivo consistindo alphoid de ADN satélite α-171-pb. Salvo em brotamento de levedura, identidade centrómero é conseguido não por a sequência de ADN mas pela presença de um nucleossoma especial que contém a variante histona H3 CenH3 (centrómero Proteína A [CENP-A] em seres humanos). 5 nucleossomas CENP-A localizar a placa interna de cinetócoros mamíferos 7 e se ligam ao DNA α-satélite 171 pb. centrômeros ativos requerem CENP-A contendo nucleossomos para dirigir o recrutamento de uma rede constitutiva associada ao centrômero (CCAN) e as proteínas cinetócoro, que em conjunto regulam a fixação dos cromossomas ao fuso mitótico e subsequente progressão do ciclo através do ponto de verificação do fuso.
À luz da evidência acima, CENP-A tem sido proposta para ser a marca epigenética do centrômero 8; No entanto, o processo pelo qual CENP-A é incorporada into de ADN centromérico e os fatores responsáveis por essa incorporação ainda não foram bem caracterizados. Um domínio de direccionamento centrómero curta (CATD) reside na histona dobrar região de CENP-A, e a substituição da região correspondente de H3 com o CATD é suficiente para H3 directa ao centrómero. 9 Vários estudos sugeriram papéis funcionais para pós-translacional modificação (PTM) de CENP-A 12-16; No entanto, os mecanismos moleculares destes PTMs de CENP-A no recrutamento para centrómeros ainda não foram elucidados. Nós relatado anteriormente que a atividade ligase CUL4A-RBX1-COPS8 E3 é necessário para CENP-A K124 ubiquitinação e localização de CENP-A para centrômeros 17.
A descoberta e caracterização de proteínas cinetócoro levaram a nova visão sobre a segregação de cromossomas. 18 mais de 100 componentes cinetócoro foram identificados em células de vertebrados por várias abordagens. 19,20 Um sobpe de como cinetócoros montar e função também vem da caracterização das funções celulares de cada rede centrômero-kinetochore proteínas e proteína-proteína dentro das células. 19 visualização direta e de imagem avançados métodos de microscopia de fluorescência fornecer notável resolução de componentes centrômero-kinetochore e permitir observação direta de componentes moleculares específicos dos centrômeros e cinetócoros. Além disso, métodos de imunofluorescência indirecta (IIF) A coloração por utilização de anticorpos específicos são cruciais para estas observações. No entanto, apesar dos numerosos relatórios sobre protocolos de IFI, alguns problemas discutidos em de proteínas específicas de centrómero-cinetócoro detalhe. 1-4 Assim, o desenvolvimento de métodos e relatórios de coloração IIF e um ensaio quantitativo para o IFI analisar especificamente cada proteína centrómero-cinetócoro é extremamente importante. Na coloração IIF, deve-se proceder com o protocolo de coloração para evitar a perda da proteína de interesse ouo resto da célula. Contudo, a fixação destrói os locais antigénicos ocasionalmente, e diferentes combinações de anticorpos para o antigénio funcionar mal com um fixador, mas muito bem com a outra, 21 e escolha de fixador depende em grande parte da proteína (s) de interesse. Portanto, diferentes métodos fixadoras são cruciais na coloração IIF de proteínas centrômero-kinetochore.
Aqui métodos optimizados de imunofluorescência indirecta (IIF) e um ensaio de coloração para dirigir a localização de proteínas de centrómero-cinetócoro endógenos, incluindo CENP-A e CENP-A proteínas exógenas Bandeira-marcadas, e a quantificação destas proteínas em células humanas têm sido desenvolvidos. Estes métodos podem ser aplicados para a análise de proteínas de centrómero-cinetócoro em outras espécies.
Nos últimos anos, muitos estudos têm desenvolvido diferentes ensaios de microscopia quantitativa em células fixas. 42 Progress em biologia centrômero-kinetochore muitas vezes requer uma compreensão da função específica do centrômero ou específicos de kinetochore de proteínas das quais regulação espacial-temporal subcelular reflete a evolução das funções do estas proteínas durante o ciclo celular. Portanto, aqui desenvolvemos métodos de coloração IIF e um ensaio quantitativo para o IFI ana…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM68418.
Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |