Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).
“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.
"centromerer" var klassiskt definieras som områden av undertryckt meiotiska rekombination i genetik och senare erkänd som den primära sammandragning av mitotiska kromosomer, som spelar en viktig roll i exakt kromosomsegregation under mitos. "kinetokorer" beskrevs som de flerskiktade strukturer som binder till mikrotubuli vid ytan av centromerer, såsom avslöjas genom elektronmikroskopi; "kinetokorer" senare definieras som makromolekylära komplex som lokaliserar vid centromeren mitotiska kromosomer. Trots en dramatisk avvikelse av centro DNA-sekvenser bland ryggradsdjur, kinetochor struktur och sammansättning är mycket konserverad. En dynamisk interaktion mellan spindel mikrotubuli och kinetochor krävs för trogen segregering av kromosomer under mitos och defekter i centromer-kinetochor funktion leder till aneuploidi och därmed cancer.
Centromeren i de flesta eukaryoterhar ingen definierad DNA-sekvens, men består av stora matriser (0,3-5 MB) repetitiva alphoid DNA bestående av 171 bp α-satellit-DNA. Utom i knoppande jäst, är centromeridentitet uppnås inte av DNA-sekvensen men genom närvaro av en speciell nukleosomen som innehåller histon H3 varianten CenH3 (centromer Protein A [CENP-A] hos människa). 5 CENP-A nukleosomer lokalisera till inre platta av däggdjurs kinetokorer 7 och binder till 171 bp α-satellit-DNA. Aktiva centromerer kräva CENP-A-innehållande nukleosomer för att rikta rekryteringen av en konstitutiv centromer-associerat nätverk (Ccan) och kinetochor proteiner, som tillsammans reglera vidhäftningen av kromosomer till den mitotiska spolen och efterföljande cykelprogression genom spindeln checkpoint.
Mot bakgrund av ovanstående bevis har CENP-A har föreslagits vara den epigenetiska märke centromeren 8; emellertid den process genom vilken CENP-A är inkorporerad into centro DNA och de faktorer som ligger bakom denna integration har ännu inte väl karakteriserade. En kort centromer-targeting domain (CATD) befinner sig i histon faldig regionen av CENP-A, och ersättning av motsvarande region i H3 med CATD är tillräcklig för att direkt H3 till centromeren. 9 Flera studier föreslog funktionella roller för posttranslationell modifiering (PTM) av CENP-A 16/12; Men, de molekylära mekanismerna bakom dessa PTMs av CENP-A i rekryteringen till centromerer har ännu inte klarlagts. Vi rapporterade tidigare att CUL4A-RBX1-COPS8 E3-ligas-aktivitet krävs för CENP-A K124 ubiquitylation och lokalisering av CENP-A till centromerer. 17
Upptäckten och karakteriseringen av kinetokoren proteiner har lett till nya insikter om kromosomsegregation. 18 Mer än 100 kinetokoren komponenter har identifierats i celler från ryggradsdjur av olika metoder. 19,20 En understående av hur kinetokorer monterar och funktion kommer också från karakterisering av de cellulära funktionerna hos varje centromer-kinetochore proteiner och protein-protein nätverk inom celler. 19 Direkt visualisering och avancerad avbildningsmetoder i fluorescensmikroskopi ger anmärkningsvärd upplösning av centromer-kinetochore komponenter och tillåta direkt observation av specifika molekylära komponenter i centromerer och kinetokorer. Dessutom, metoder för indirekt immunofluorescerande (IIF) färgning med användning av specifika antikroppar är avgörande för dessa observationer. Men trots många rapporter om IIF protokoll, få diskuteras i detalj problem med specifika centromer-kinetochore proteiner. 1-4 är således mycket viktigt att utveckla och rapportering metoder för IIF-färgning och en kvantitativ IIF analys för att specifikt analysera varje centromer-kinetochore protein. I IIF-färgning, bör man fortsätta med färgningsprotokollet för att undvika förlust av proteinet av intresse ellerresten av cellen. Emellertid förstör fixering antigena ställen ibland, och olika antikropp-antigen kombinationer fungerar dåligt med ett fixativ, men mycket väl med en annan, 21 och val av fixativ beror till stor del på protein (er) av intresse. Därför olika fästmetoder är avgörande för IIF-färgning av centromer-kinetochore proteiner.
Här optimerade metoder för indirekt immunofluorescerande (IIF) färgning och en analys för att ta itu med lokalisering av endogena centromer-kinetochore proteiner, innefattande CENP-A och Flag-märkta exogena CENP-A-proteiner, och kvantifiering av dessa proteiner i humana celler har utvecklats. Dessa metoder kan tillämpas på analysen av centromer-kinetochore proteiner i andra arter.
Under senare år har många studier har utvecklat olika kvantitativ mikroskopi analyser för fixerade celler. 42 Framsteg i centromer-kinetochor biologi ofta kräver en förståelse av centromer specifika eller kinetokoren-specifik funktion av proteiner som subcellulär spatial-temporal reglering återspeglar de förändrade funktioner dessa proteiner under cellcykeln. Därför, här har vi utvecklat metoder för IIF-färgning och en kvantitativ IIF analys för att särskilt analysera de relativa nivåerna av…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH bidrag GM68418.
Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |