Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

साइटोक्रोम encapsulating Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53802
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

Summary

इस प्रक्रिया का वर्णन (2 Sio) प-जैल, प्रक्रिया इन जैल encapsulate कैसे साइटोक्रोम ग (CYT। ग) सिलिका में bioaerogels फार्म, और इन bioaerogels का उपयोग तेजी से एक गैस चरण प्रतिक्रिया के माध्यम से नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) पहचान करने के लिए। प्रोटोकॉल के इस प्रकार के biosensors या अन्य Bioanalytical उपकरणों के भविष्य के विकास में सहायता कर सकते हैं।

Abstract

इस तरह के सेंसर, बैटरी, और ईंधन की कोशिकाओं के रूप में आवेदन अत्यधिक झरझरा aerogels के उपयोग के माध्यम से सुधार किया गया है जब कार्यात्मक यौगिकों aerogels भीतर समझाया जाता है। हालांकि, प-जैल के भीतर प्रोटीन encapsulating पर कुछ खबरें हैं कि aerogels फार्म के लिए कार्रवाई कर रहे हैं मौजूद हैं। सिलिका में साइटोक्रोम ग (CYT। ग) encapsulating के लिए एक प्रक्रिया (2 Sio) प-जैल कि supercritically नाइट्रिक ऑक्साइड के लिए गैस चरण गतिविधि के साथ bioaerogels फार्म के लिए कार्रवाई कर रहे हैं (सं) प्रस्तुत किया है। CYT। सी नियंत्रित प्रोटीन एकाग्रता के तहत एक मिश्रित सिलिका प को जोड़ा गया और शक्ति की स्थिति बफर है। सोल मिश्रण तो gelled है और तरल भरने जेल pores तरल कार्बन डाइऑक्साइड के साथ विलायक एक्सचेंजों की एक श्रृंखला के माध्यम से बदल दिया है। कार्बन डाइऑक्साइड अपनी महत्वपूर्ण बात करने के लिए लाया जाता है और बंद निकाल CYT के साथ सूखी aerogels रूप है। ग अंदर समझाया। ये bioaerogels यूवी दृश्य स्पेक्ट्रोस्कोपी एक साथ की विशेषता हैडी परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रोस्कोपी और गैस चरण नाइट्रिक ऑक्साइड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रक्रिया की सफलता CYT। सी एकाग्रता और बफर एकाग्रता को विनियमित करने पर निर्भर करता है और इस तरह के धातु नैनोकणों के रूप में अन्य घटकों की आवश्यकता नहीं है। यह एक समान संभावित भविष्य Bioanalytical डिवाइस के विकास के लिए इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण बना दृष्टिकोण का उपयोग अन्य प्रोटीन encapsulate करने के लिए संभव हो सकता है।

Introduction

साइटोक्रोम सी (CYT। ग) एक महत्वपूर्ण इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण प्रोटीन शरीर की सेलुलर श्वसन प्रतिक्रियाओं में भी शामिल है। यह apoptosis, कोशिका मृत्यु का एक नियंत्रित रूप में शामिल होना दिखाया गया है, और यह नाइट्रिक ऑक्साइड और कार्बन मोनोऑक्साइड 1-3 के रूप में इस तरह के छोटे विषाक्त अणुओं का पता लगा सकते। नाइट्रिक ऑक्साइड (सं), तंत्रिका हृदय, और प्रतिरक्षा प्रणाली में हो रहे शारीरिक प्रक्रियाओं की एक किस्म में एक भूमिका निभाता है। CYT सी। आम तौर पर पीएच तटस्थ मूल्यों के लिए बफर संरचनात्मक रूप से बरकरार है और सक्रिय रहने के लिए एक जलीय वातावरण की आवश्यकता है, अनुसंधान कि CYT दिखाया गया है। ग ठोस कुछ शर्तों के तहत 4-9 aerogels रूप में जाना जाता सामग्री में इसकी संरचना और समारोह को बनाए रखने कर सकते हैं।

Aerogels अत्यधिक झरझरा सामग्री अक्सर प जेल धातु आक्साइड (synthesizing जबकि धातु ऑक्साइड aerogels बहुत आम हैं, कार्बन और aerogels के अन्य प्रकार संश्लेषित किया गया है द्वारा गठित कर रहे हैं। एक उदाहरण InP AER हैogels) 10 और इस तरह से इन प-जैल सुखाने झरझरा ठोस मैट्रिक्स अपरिवर्तित 11-14 छोड़ दिया जाता है। ठोस aerogels में pores के सभी बहुत उपलब्ध सतह क्षेत्र बनाने aerogels किसी भी आवेदन जहां सतह प्रतिक्रियाओं महत्वपूर्ण हैं के लिए अत्यंत उपयोगी में परिणाम। रासायनिक या जैव रासायनिक कार्यक्षमता airgel nanoarchitecture भीतर इकट्ठे जाता है, यह दिखाया गया है कि शारीरिक porosity और aerogels का बढ़ाया सतह क्षेत्र सेंसर, साथ ही बैटरी के लिए इलेक्ट्रोड, ईंधन सेल, और supercapacitor अनुप्रयोगों 11,15-23 में सुधार करने में मदद । आदेश में एक ही रास्ता है कि झरझरा ठोस मैट्रिक्स अपरिवर्तित छोड़ देता aerogels में सुखाने के लिए, यह विलायक कि सुपरक्रिटिकल विलायक निष्कर्षण के माध्यम से प-जेल संश्लेषण के बाद pores में अवशेष को दूर करने के लिए विशिष्ट है। किसी भी ताकना पतन है कि जेल से एक विलायक के रूप में उड सतह तनाव बलों की वजह से हो सकता है क्योंकि सुपरक्रिटिकल सुखाने, एक तरल वाष्प इंटरफ़ेस कभी नहीं रूपों में कम कर रहे हैं।

ग प-जैल कि गीला रखा गया है या कि ambiently 24-30 सूख गया है में समझाया जा रहा है। प-जैल में encapsulating biomolecules कि तब supercritically सूख रहे हैं की रिपोर्ट के लिए फार्म aerogels आवश्यक प्रसंस्करण कि कई प्रोटीन की संरचना के लिए हानिकारक हो सकता है की वजह दुर्लभ हैं। के CYT। ग मामले में, कुछ शर्तों के यह पता लगाने और aerogels के भीतर गैस चरण नाइट्रिक ऑक्साइड के लिए प्रतिक्रिया करने CYT। के सी क्षमता बनाए रखने के लिए संभव बनाते हैं। एक बार जब airgel में स्थिर, airgel के उच्च गुणवत्ता वाले ताकना संरचना के बीच CYT। सी और नाइट्रिक ऑक्साइड 4,8,9 प्रतिक्रिया की सुविधा। CYT। ग पहले समाधान 4-8 में सोने या चांदी नैनोकणों के आसपास कई परतों में यह जोड़ से aerogels भीतर समझाया जा सकता है। ये बहुपरती सुपरस्ट्रक्चर airgel मैट्रिक्स के भीतर प्रोटीन की रक्षा के लिए काम करते हैं। सबसे हाल ही में approacज है कि हम विकसित किया है, जब प्रोटीन एकाग्रता और शक्ति बफर अन्य सिंथेटिक शर्तों के साथ नियंत्रित कर रहे हैं, CYT। सी भी धातु nanoparticle प्रारंभिक एसोसिएशन 9 के बिना aerogels भीतर अखंडता बरकरार रखती है।

संश्लेषण शुरू होता है के रूप में कई airgel syntheses समय का एक निर्धारित अवधि के लिए सिलिका प जेल व्यापारियों के मिश्रण से शुरू करते हैं। यह एक निर्धारित समय है कि CYT। सी मिश्रण में एक बफर समाधान के रूप में जोड़ा जाता है मिश्रण के बाद है। जमाना तो एक झरझरा सिलिका ठोस संरचना में जो pores पानी, मेथनॉल, शेष अभिकारकों और उपोत्पाद से भर रहे फार्म के लिए होता है। यह तरल भर जाता है कि pores विलायक एक्सचेंजों की एक श्रृंखला के माध्यम से विभिन्न सॉल्वैंट्स के साथ बाहर rinsed जा सकता है, तरल कार्बन डाइऑक्साइड एक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने तंत्र के भीतर जगह लेने के साथ पिछले एक्सचेंजों कम तापमान पर रखा। कार्बन डाइऑक्साइड की महत्वपूर्ण तापमान (31.1 डिग्री सेल्सियस) से ऊपर लाने के रूप में जैल के गठन की सुविधादबाव तंत्र है कि सूखा, अत्यधिक झरझरा aerogels के लिए फार्म दिए जा सकते हैं अंदर upercritical तरल पदार्थ। अपेक्षाकृत कम तापमान एक सुपर तरल के रूप में करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के लिए आवश्यक अन्य सॉल्वैंट्स की तुलना में फायदेमंद है क्योंकि यह एक तापमान जिस पर यह denature सका नीचे प्रोटीन रहता है।

क्योंकि यह एक साधारण प्रक्रिया है कि के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रोटीन encapsulating के लिए एक अधिक आम तौर पर लागू प्रोटोकॉल के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते है aerogels में encapsulating CYT। ग के लिए हमारे धातु nanoparticle मुक्त दृष्टिकोण फायदेमंद है। कई प्रोटीन एक ही तरीका है कि CYT में धातु नैनोकणों के साथ बातचीत नहीं कर सकते। सी करता है और धातु nanoparticle संश्लेषण या खरीद प्रक्रिया के लिए अतिरिक्त समय और खर्च कहते हैं। aerogels में प्रोटीन encapsulating पर कुछ रिपोर्टों aerogels कि मैं सहायता कर सकते हैं में अन्य प्रोटीन encapsulating के लिए एक अधिक सामान्य प्रक्रिया पाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम आगे इस प्रक्रिया का विकास करनाn संभावित भविष्य Bioanalytical उपकरणों।

इस पांडुलिपि के प्रोटोकॉल अनुभाग सिलिका प-जैल synthesize कैसे, इन प-जैल में encapsulate CYT। सी, इन समग्र प-जैल aerogels फार्म के लिए सूखी, यूवी दृश्य और परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर इन bioaerogels विशेषताएँ और उपस्थिति का पता लगाने की रूपरेखा इन bioaerogels साथ गैस चरण नाइट्रिक ऑक्साइड की। CYT। सी सफलतापूर्वक aerogels में समझाया गया है जब पहली फॉस्फेट बफर के 4.4 70 मिमी के लिए जलीय समाधान में भंग कर दिया। हालांकि, अनुकूलित aerogels में प्रोटीन संरचना 15 माइक्रोन के 9 को जब CYT 40 मिमी फॉस्फेट बफर समाधान encapsulating परिणाम के लिए पाया गया है। लोड airgel CYT उत्पादन सी। 5 की रेंज में ग सांद्रता। इसलिए, प्रोटोकॉल नीचे दिए गए 15 माइक्रोन की aerogels में सी एकाग्रता एक भरी हुई CYT में जिसके परिणामस्वरूप के CYT। सी 40 मिमी फॉस्फेट बफर समाधान का उपयोग aerogels के संश्लेषण के लिए है।। </ P>

Protocol

सुरक्षा चश्मा या चश्मे, प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और प्रयोगशाला प्रक्रिया के दौरान हर समय पहना जाना चाहिए। कभी सुरक्षा चश्मा या चश्मे के बिना महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने तंत्र कार्य करते हैं। युक्त tetramethoxysilane, मेथनॉल, इथेनॉल, एसीटोन, और अमोनिया सभी समाधान एक धूआं हुड के भीतर कार्रवाई की जानी चाहिए।

1. बफर और CYT बनाओ। सी समाधान

  1. 7 पीएच, 40 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर के ~ 750 मिलीलीटर बनाने के लिए, पहली बार बाहर पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार की 2.72 ग्राम वजन और एक 500 मिलीलीटर फ्लास्क का उपयोग कर पानी में भंग करके 0.04 एम पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार की 500 मिलीलीटर तैयार करते हैं।
  2. पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय की 3.48 ग्राम वजनी और एक 500 मिलीलीटर फ्लास्क का उपयोग कर पानी में भंग करके 0.04 एम पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय की 500 मिलीलीटर की तैयारी।
  3. एक हलचल पट्टी के साथ एक बड़े बीकर में द्विक्षारकीय नमक के घोल डालो और एक हलचल प्लेट पर समाधान सरगर्मी शुरू करते हैं।
  4. धीरे-धीरे अकेले आधार नमक रों के कुछ भागों को जोड़नेएक पीएच इलेक्ट्रोड और मीटर के साथ पीएच की निगरानी करते हुए जब तक पीएच 7.00 है द्विक्षारकीय नमक के घोल को olution। अकेले आधार नमक के घोल के लगभग 250-300 मिलीलीटर इस्तेमाल किया जाएगा।
  5. कांच जगमगाहट शीशी में से CYT। सी और जगह लगभग 0.023 ग्राम वजन। एक micropipette का उपयोग कर तैयार पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 2,000 μl जोड़ें और फिर धीरे ठोस, ​​लाल CYT के सभी जब तक मिश्रण का हल ज़ुल्फ़। सी समाधान में भंग कर दिया है और कोई बात कण बनी हुई है।
  6. तैयार CYT। सी समाधान के 20 μl ले लो और एक 1 सेमी पथ की लंबाई प्लास्टिक क्युवेट में जोड़ें। तैयार बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  7. संदर्भ सेल में बफर का उपयोग 300-700 एनएम से यूवी की तुलना स्पेक्ट्रम ले लो। 106100 एम -1 सेमी -1 के 409 एनएम, विलुप्त होने के गुणांक 31 (ε) पर CYT का प्रयोग करें। सी absorbance (ए), क्युवेट पथ की लंबाई (एल), और बियर-लैम्बर्ट कानून एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए (ग) समाधान के (एक = εlc)।
  8. वापस मूल तैयार समाधान की एकाग्रता की गणना। 2 मिलीलीटर तैयार CYT। सी समाधान आम तौर पर 0.7 मिमी के बीच 0.9 एकाग्रता में है।
  9. एक जगमगाहट शीशी में 0.72 मिमी CYT तैयार किया। सी समाधान के 117 μl pipetting द्वारा 0.105 मिमी के 800 μl करने के लिए मूल तैयार CYT। सी समाधान पतला। तो तैयार बफर के 800 μl (इस मामले में 683 μl) के संतुलन को जोड़ें। मिश्रण करने के भंवर। सटीक मात्रा में मूल तैयार CYT की सटीक एकाग्रता के आधार पर अलग अलग होंगे। CYT की मात्रा के रूप में सी समाधान। सेल्सियस तक pipet के रूप में (800 μl * 0.105 मिमी) गणना की जाती है / (मूल CYT। मिमी में एकाग्रता ग)।
  10. एक फ्रिज में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर मूल से तैयार है और पतला CYT। सी समाधान करने के लिए दो सप्ताह के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक।

2. Synthesize सिलिका (2 Sio) सोल

  1. एक डिस्पोजेबल 50 मिलीलीटर polypropylene बीकर लेबल 'बनेंAker ए '। एक विश्लेषणात्मक संतुलन के तवे पर बीकर रखें और बीकर में 1.88 जी tetramethoxysilane जोड़ने के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करें। शून्य बैलेंस और फिर 'बीकर ए' में मेथनॉल के 2.88 छ पिपेट।
  2. कवर 'बीकर ए' Parafilm के साथ।
  3. एक डिस्पोजेबल 50 मिलीलीटर polypropylene बीकर 'बीकर बी' लेबल। एक विश्लेषणात्मक संतुलन के तवे पर एक चुंबकीय हलचल बार और जगह जोड़ें। 0.75 ग्राम पानी और 3.00 छ मेथनॉल जोड़ने के लिए एक गिलास पिपेट का प्रयोग करें।
  4. Parafilm के साथ कवर 'बीकर बी'।
  5. एक धूआं हुड के अंदर हलचल प्लेट पर 'बीकर बी' की सामग्री को सरगर्मी शुरू हो, तो मिश्रण में कवर किया, जबकि सरगर्मी Parafilm के माध्यम से 28.0-30.0% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान के 5 μl डालने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें।
  6. जैसे ही 2.5 कदम के रूप में पूरा हो गया है, 'बीकर बी' के लिए 'बीकर ए' की सामग्री को जोड़ें। 20 मिनट के लिए मिश्रण हिलाओ, जबकि Parafilm में शामिल किया।

3. जेल Molds तैयार

नोट:जबकि सिलिका प मिश्रण 2.6 चरण में सरगर्मी है जेल के नए नए साँचे तैयार करने के लिए समय है।

  1. 8-9 polypropylene जगमगाहट शीशियों (16 मिमी x 57 मिमी, 6.5 मिलीलीटर मात्रा आकार, नीचे से कटा हुआ) के साथ और इसी टोपियां मोल। शीशी की टोपी अंत पर प्लास्टिक की चादर रखो एक सपाट सतह बनाने के लिए जेल पर फार्म और यह सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक की चादर टोपी के अंदर बरकरार रहता बनाने पर टोपी जगह है।
  2. बेंच शीर्ष पर नीचे टोपी के अंत के साथ शीशियों अप लाइन और नीचे से ऊपर का सामना करना पड़ खोला।

4. CYT तैयार करें। सी -silica सोल-जैल

  1. सोल मिश्रण (2.6 चरण) के पूरा होने पर, एक साफ डिस्पोजेबल 50 मिलीलीटर polypropylene बीकर प मिश्रण के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. धीरे-धीरे 0.105 मिमी पतला CYT। सी समाधान (कदम 1.9 में किए गए) ~ 1 मिनट के पाठ्यक्रम पर 3 मिलीग्राम प मिश्रण के 500 μl ड्रॉप करने के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें। जबकि CYT जोड़ने धीरे मिश्रण चक्कर आने के लिए सुनिश्चित करें। बड़े के गठन से बचने के लिए गलाल गुच्छों। मान लिया जाये कि खंडों additive हैं, 3,500 μl, CYT। सी एकाग्रता में अब प है, सिद्धांत रूप में, 15 माइक्रोन के लिए 0.105 मिमी CYT। सी समाधान के 500 μl गिराए।
  3. Pipet प्रत्येक तैयार मोल्ड में जिसके परिणामस्वरूप CYT। सी सिलिका सोल के 0.5 मिलीलीटर। इसके अलावा एक या दो सांचों में शेष '' सादे सिलिका सोल के 0.5 मिलीलीटर pipet सुपरक्रिटिकल सुखाने की प्रक्रिया के दौरान नियंत्रण के नमूने के रूप में उपयोग करने के लिए।
  4. कवर Parafilm के साथ नए नए साँचे के चेहरे-अप के उद्घाटन और (~ 2-8 डिग्री सेल्सियस) रातोंरात या के लिए कम से कम 12 फ्रिज में रख दिया मानव संसाधन प-जैल का उत्पादन।
  5. रेफ्रिजरेटर से बाहर नए नए साँचे ले लो। एक CYT युक्त एक मोल्ड के ऊपर से Parafilm हटाये ग प जेल। यह भी नीचे से टोपी और प्लास्टिक की चादर को हटा दें।
  6. मोल्ड में एक धोने बोतल से कुछ इथेनॉल जोड़ने के बाद, एक सिरिंज सवार की परिपत्र डिस्क अंत का उपयोग सावधानी से मोल्ड के बाहर और एक साफ 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी शेष भाग में जेल पुश करने के लिएइथेनॉल के लगभग 5 मिलीलीटर aining।
  7. CYT के सभी जब तक इस जेल को हटाने की प्रक्रिया (कदम 4.5 और 4.6) दोहराएँ। सी जैल शीशी के लिए जोड़ रहे हैं और सिलिका जैल के सभी एक अलग शीशी के लिए जोड़ रहे हैं। अगर CYT। सी जेल के एक से अधिक एकाग्रता बना दिया गया है, अलग शीशियों के भीतर जैल की तरह स्टोर करने के लिए एक साथ सुनिश्चित हो। फिर इथेनॉल, टोपी और 2-8 डिग्री सेल्सियस के बीच की दुकान के साथ शीर्ष पर शीशियों भरें।
  8. दिन भर में हर चार घंटे, रेफ्रिजरेटर से जैल हटाने जैल बंद इथेनॉल छानना और ताजा इथेनॉल के साथ बदलें।
  9. एक अतिरिक्त तीन दिनों के दौरान, एसीटोन में गीला प जैल डूब, decanting और ताजा एसीटोन एक दिन में तीन बार जोड़ना।

5. Supercritically सूखी CYT। सी -silica सोल-जैल

  1. 8 डिग्री सेल्सियस के लिए एक संलग्न फैलानेवाला के तापमान की स्थापना करके एक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने उपकरण (चित्रा 1 देखें) 10 डिग्री सेल्सियस के लिए अच्छा है।
  2. एक बार जब तंत्र r गया है10 डिग्री सेल्सियस eached, एसीटोन के साथ एक हस्तांतरण नाव भरने और तंत्र के अंदर सील बंद कर दिया तंत्र पर एक रिसाव परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
    1. तंत्र का भरण वाल्व खोलने और कार्बन डाइऑक्साइड जोड़ने जब तक तंत्र आधा भरा हुआ है।
    2. भरने के वाल्व बंद करो और दरवाजे और वाल्व जहां ओ-रिंग या जवानों बिगड़ती जा सकता है पर hissing के लिए ध्यान से सुनो।
    3. किसी भी हे छल्ले या जवानों की जगह अगर एक रिसाव पाया जाता है।
  3. रिसाव परीक्षण पूरा करने के बाद, एक धूआं हुड की नाली में एसीटोन और कार्बन डाइऑक्साइड जारी करने के लिए नाली वाल्व खुला। फिर तंत्र से स्थानांतरण नाव को हटा दें।
  4. यह सुनिश्चित करना कि तंत्र रिसाव से मुक्त होने के बाद सावधानी से जगमगाहट शीशियों से गीला जैल डालना, एसीटोन के अधिकांश, हस्तांतरण नाव के तीन वर्गों में लंबे समय तक साथ-साथ (नमूना टोकरी या धुंध के कवर के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं)। नाजुक धक्का और संदंश के साथ नाव भीतर जैल ले जाने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी जैल पूरी तरह से मैं डूबे हुए हैंn एसीटोन। अधिक एसीटोन जोड़ें यदि तंत्र के अंदर नाव सीलिंग से पहले की जरूरत है।
  5. कार्बन डाइऑक्साइड को जोड़ने के लिए है, तो जैसे ही एसीटोन कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मिश्रण तंत्र खिड़की के माध्यम से तंत्र की तह तक डूब जाने के लिए मनाया जाता है पांच मिनट के लिए एसीटोन जारी करने के लिए नाली वाल्व खोलने तंत्र का भरण वाल्व खोलें। इससे पहले कि तंत्र पूरी तरह से कार्बन डाइऑक्साइड से भर जाता है नीचे करने के लिए एसीटोन का यह रिसाव हो जाएगा, इसलिए भरने के वाल्व निकासी के दौरान आवश्यक हद तक खुले रहने चाहिए ताकि तंत्र को भरने के लिए भी खुला है, जबकि नाली जारी रहेगा।
  6. नाली वाल्व बंद करें। भरने के वाल्व थोड़ा खुला फटा रखें।
  7. पांच मिनट बाद, फिर पांच मिनट के लिए नाली वाल्व खोलने और भरने के वाल्व को समायोजित करने के लिए पर्याप्त खोले जाने के लिए इतना है कि पूरे तंत्र निकासी के समय के दौरान पूर्ण बनी हुई है। नाली वाल्व बंद, भरने के वाल्व खुला फटा रखने के लिए, तो यह draining कदम एक बार और दोहराने पाँचमिनट बाद।
  8. इन पहले तीन जल निकासी के कदम के बाद, लगभग कम से कम छह घंटे के अंतराल पर हर 40 मिनट के भीतर तरल जैल कार्बन डाइऑक्साइड से एसीटोन की पूरी प्रतिस्थापन सुनिश्चित करने के लिए एक समय में 5 मिनट के लिए नाली खुला। हमेशा भरने के वाल्व को समायोजित प्रत्येक निकासी के दौरान काफी खुला होने के लिए इतना है कि तंत्र में तरल स्तर कभी नहीं draining के दौरान नाव के ऊपर से नीचे चला जाता है।
  9. एक बार draining कदम पूरा कर रहे हैं, को भरने के वाल्व बंद, और तरल कार्बन डाइऑक्साइड नाली स्तर इतना है कि तंत्र खिड़की के माध्यम से देख कर सिर्फ नाव पर prongs के ऊपर दिखाई बनी हुई है।
  10. 40 डिग्री सेल्सियस के लिए तंत्र जुड़ी फैलानेवाला का तापमान सेट सुनिश्चित करें कि अपनी महत्वपूर्ण तापमान और दबाव से ऊपर तरल कार्बन डाइऑक्साइड बढ़ जाता है (टी सी = 31 डिग्री सेल्सियस, पी सी = 7.4 एमपीए)।
  11. लगभग 15 मिनट के बाद, तरल रूप में menisc तंत्र खिड़की के माध्यम से सुपर तरल तरल से संक्रमण का निरीक्षणहमें नाव के prongs के ऊपर गायब हो जाता है। संतुलन समय के कम से कम 15 मिनट के लिए, तो वेंट वाल्व सुपर तरल जारी करने के लिए शुरू करने के लिए एक छोटी राशि खोलने की अनुमति दें।
  12. लगभग 45 मिनट के पाठ्यक्रम पर, इतना है कि रिहा तरल पदार्थ की एक स्थिर है, लेकिन बहुत कम फुफकार सुना जा सकता है संवर्द्धित वेंट वाल्व व्यापक और व्यापक खोलने के लिए जारी रखने और दबाव नापने का यंत्र धीरे-धीरे शून्य करने के लिए कम करने के लिए मनाया जाता है।
  13. बाद तंत्र के दबाव शून्य करने के लिए चला गया है, तंत्र दरवाजा खुला नाव को हटाने, और संदंश का उपयोग स्वच्छ कांच जगमगाहट शीशियों में नव सूखे aerogels जगह है।

6. विशेषताएँ CYT। सी -silica यूवी दृश्य और परिपत्र Dichroism (सीडी) के साथ Aerogels स्पेक्ट्रोस्कोपी

  1. यूवी दृष्टिगोचर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या सीडी स्पेक्ट्रोमीटर की किरण पथ में airgel monoliths धारण करने के लिए एक गत्ता मंच तैयार करें।
    1. हल्के गत्ते का एक 2.5 सेमी x 2.5 सेमी टुकड़ा काट (जैसे LABO के एक बॉक्स से गत्ते के रूप मेंratory ऊतक), आधे में गुना, आधे रास्ते गुना पर कटौती, तो दो फ्लैप, काटने के द्वारा बनाई गई गुना वापस।
    2. हल्के गत्ते का एक 5 सेमी एक्स 5 सेमी टुकड़ा काट, बीच में एक 1.5 सेमी x 1.5 सेमी वर्ग छेद के साथ। फिर 0.5 सेमी x 0.5 सेमी करने के लिए पकड़ के आकार को कम करने के लिए काले बिजली के टेप का उपयोग करें।
    3. टेप तो यह है कि एक छोटे से मुड़े सतह एक airgel केवल पत्थर का खंभा के लिए बनाई गई है गत्ते का 5 सेमी एक्स 5 सेमी टुकड़ा के खिलाफ मुड़ा और कटौती गत्ते का फ्लैप 0.5 सेमी x 0.5 सेमी के छेद के सामने सीधे पर बैठने के लिए (चित्रा 2 देखें) । तब यूवी दृश्य स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए गत्ते का टुकड़ा वापस टेप इतने छेद किरण पथ के साथ कतार में है।
  2. जैल, जो पथ लंबाई के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, एक माइक्रोमीटर के साथ की मोटाई मापने।
  3. गत्ता मंच पर एक जेल प्लेस और यूवी दृश्य स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के संदर्भ डिब्बे में हवा के साथ 300-800 एनएम से एक स्पेक्ट्रम को मापने।
  4. फिट एक बहुपद, एक = एक n, तरंगदैर्ध्य (λ) क्षेत्र जहां absorbance (ए) मुख्य रूप से पृष्ठभूमि बिखरने की वजह से है, ~ 700-800 एनएम के लिए। एक गुणांक के बीच आमतौर पर एक नंबर के लिए फिट है ~ 1 एक्स 10 8 और 1 एक्स 10 6 और एन गुणांक ~ के बीच 2 और 3 के एक नंबर के लिए आम तौर पर फिट है।
  5. अन्य तरंग दैर्ध्य में बिखराव की गणना करें, गुणांक, एक और एन, फिट से प्राप्त का उपयोग कर।
  6. एक तितर बितर सुधारा स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए कच्चे स्पेक्ट्रम से इस गणना बिखराव पृष्ठभूमि absorbance घटाएँ।
  7. 490 उपयुक्त सॉफ्टवेयर (ग्राम / ऐ 8.0) का उपयोग करते हुए शिखर ऊंचाई, शिखर केंद्र, और airgel के Soret चोटी के शिखर चौड़ाई निर्धारित करने के लिए 370 एनएम के क्षेत्र में एक गाऊसी की अवस्था के साथ बिखराव घटाया स्पेक्ट्रम फिट बैठते हैं।
  8. पथ की लंबाई (एल), 106100 एम के विलुप्त होने के गुणांक 31 (ε) के लिए जेल की मापा मोटाई का उपयोग कर बीयर-लैम्बर्ट कानून लागू -1 सेमी -1 सी एकाग्रता (ग) की गणना करने के लिए।
  9. एकाग्रता के लिए गणना की CYT की तुलना करें। सी एकाग्रता सैद्धांतिक रूप से जेल (15 माइक्रोन) के airgel में भीतर की CYT। सी व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए। ठेठ प्रतिशत viabilities 100% के करीब हैं, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन viabilities क्योंकि गणना की CYT। समाधान 31 में सी जो CYT के विलुप्त होने के गुणांक से थोड़ा अलग माना जाता है विलुप्त होने के गुणांक के आधार पर किया जाता है सिर्फ अनुमान कर रहे हैं। aerogels है कि ज्ञात नहीं में सी।
  10. सीडी साधन कम से कम 5 मिनट में चलाने के लिए नाइट्रोजन पर दीपक बदल से पहले।
  11. सीडी स्पेक्ट्रोमीटर के लिए गत्ते धारक टेप इतने छेद किरण पथ के साथ कतार में है।
  12. 100 एनएम / मिनट में 350-500 एनएम से गत्ता धारक में कुछ भी नहीं के साथ एक सतत तरंग दैर्ध्य खाली स्पेक्ट्रम उपाय, तीन स्कैन के एक औसत लेने।
  13. गत्ता मंच पर एक जेल (मोटाई पहले कदम 6.2 में मापा जाता है) की जगह और 100 एनएम / मिनट में 350-500 एनएम से एक स्पेक्ट्रम उपाय, तीन स्कैन के एक औसत ले रही है।
  14. ब्याज के सभी airgel monoliths के लिए यूवी दृश्य और सीडी माप दोहराएँ।

7. CYT के साथ पता लगाने नाइट्रिक ऑक्साइड की उपस्थिति (सं) गैस। सी -silica Aerogels

चेतावनी: NO के साथ कार्य करना खतरनाक है और सब कोई गैस एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए या थक एक धूआं हुड में। नहीं करने के लिए निरंतर जोखिम बनेगी जब कोई हवा के साथ संपर्क में आता है के रूप में अत्यधिक जहरीला नाइट्रोजन डाइऑक्साइड और / या नाइट्रोजन tetroxide ऊतकों को विषैला होता है। गर्मी और संक्षारक धुएं भी उत्पादन किया जाता है जब कोई पानी के साथ संपर्क में आता है।

  1. एक 8 एल नाइट्रिक ऑक्साइड सिलेंडर (10% नाइट्रिक ऑक्साइड, नाइट्रोजन 90%) एक अच्छी तरह हवादार धूआं हुड में रखें और 4 साई दबाव को समायोजित।
  2. दोनों नाइट्रिक ऑक्साइड सिलेंडर के लिए और एक नाइट्रोजन सिलेंडर (दबाव 6 PS करने के लिए सेट करने के लिए ट्यूबिंग कनेक्टi) और एक टी-वाल्व के लिए ट्यूबिंग के सिरों को जोड़ने (चित्रा 3A देखें)।
  3. प्रयोग के लिए एक airgel केवल पत्थर का खंभा चुनते हैं और एक माइक्रोमीटर के साथ मोटाई (या पथ लंबाई) को मापने।
  4. प्लास्टिक की टोपी के साथ एक डिस्पोजेबल क्युवेट में airgel (~ 3 मिमी मोटी) प्लेस और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में क्युवेट डाल दिया। airgel कट थोड़ा यदि आवश्यक हो तो क्युवेट में फिट करने के लिए।
  5. क्युवेट की प्लास्टिक की टोपी, एक टी-वाल्व के उत्पादन से जुड़ा है, और एक एक ट्यूब से जुड़ा (चित्रा 3 बी देखें) धूआं हुड में निकास के रूप में काम करने के लिए दो में सिरिंज सुई डालें। ट्यूबिंग और क्युवेट करने के लिए टोपी के लिए सुइयों सील करने के लिए Parafilm का प्रयोग करें।
  6. सेल संदर्भ में एक खाली डिस्पोजेबल क्युवेट रखें।
  7. यह सुनिश्चित करें कि airgel प्रयोग शुरू करने से पहले किरण पथ में निहित है airgel क्युवेट स्थिति को समायोजित करें।
  8. 800 से 300 एनएम के लिए एक प्रारंभिक स्पेक्ट्रम ले लो।
  9. 4 पर absorbance के बीच के अंतर को मॉनिटर14 एनएम और 408 एनएम पर absorbance जबकि टी-वाल्व मोड़ यकीन है कि नाइट्रोजन या नाइट्रिक ऑक्साइड / नाइट्रोजन मिश्रण इतनी अधिक है कि के प्रवाह की दर है कि कुछ ही समय में बना निर्धारित समय अंतराल पर नाइट्रोजन और नाइट्रिक ऑक्साइड / नाइट्रोजन के मिश्रण के बीच स्विच करने के लिए airgel क्युवेट में चारों ओर ले जाता है।
  10. एक बार जोखिम चक्र खत्म हो रहे हैं, 800 से 300 एनएम से एक अंतिम स्पेक्ट्रम ले लो।
  11. एक औसत संवेदन प्रतिक्रिया प्राप्त तीन से चार monoliths के साथ प्रक्रिया को दोहराएं।

Representative Results

युक्त व्यवहार्य CYT। सी aerogels में वर्णित प्रक्रिया का परिणाम है। परिचय के अंत में निर्दिष्ट के रूप में, CYT। सी जलीय बफर समाधान है कि 4.4 से 70 मिमी फॉस्फेट के लिए सीमा से समझाया जा सकता है। CYT के उदाहरण हैं। ग -silica (CYT। सी -SiO 2) विभिन्न बफर सांद्रता वाले समाधान से बना aerogels 4 चित्र में दिखाया गया है। सभी जैल, अपेक्षाकृत पारदर्शी हैं 70 से बनाया गया जैल के साथ मिमी बफर सबसे अपारदर्शी।

CYT। के सी अलग अलग परिस्थितियों में स्पेक्ट्रोस्कोपी की तुलना चित्रा 5 में दिखाया गया है। एक ठेठ स्पेक्ट्रम (चित्रा 5C) CYT के लिए 408 एनएम के आसपास बड़े Soret चोटी से पता चलता है। ग -SiO 2 aerogels और बहुत CYT के स्पेक्ट्रम के समान है । समाधान (चित्रा 5 ए) में सी। इसके अलावा, CYT की एक स्पेक्ट्रम।सी धातु नैनोकणों के साथ aerogels भीतर समझाया भी (चित्रा 5 ब) और CYT दिखाया गया है। ग -SiO 2 airgel स्पेक्ट्रम के रूप में अच्छी तरह से इस स्पेक्ट्रम के समान है। CYT। सी -SiO 2 airgel नाइट्रिक ऑक्साइड के संपर्क में है, Soret चोटी का एक विशिष्ट स्थानांतरण मनाया जाता है (चित्रा 5 डी)।

CYT से बना जैल के लिए यूवी की तुलना स्पेक्ट्रा। बदलती बफर सांद्रता में ग समाधान 6 चित्र में दिखाए जाते हैं। इन जैल के सभी लक्षण दिखाई यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी का संकेत है कि CYT। सी जैल के भीतर एक विकृत राज्य में नहीं है सुविधाओं को दिखाने के। हालांकि, जैल की कमी आई है translucency इन स्पेक्ट्रा के लिए एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात में से 70 मिमी बफर परिणाम बनाया है।

CYT की सीडी स्पेक्ट्रा। सी -SiO 2 aerogels CYT के स्पेक्ट्रा के समान हैं। ग सी एक स्पेक्ट्रम से अलग (चित्रा 7)।

8 चित्रा CYT के लिए एक विशिष्ट नाइट्रिक ऑक्साइड निगरानी प्रतिक्रिया से पता चलता। सी -SiO 2 aerogels और इसी aerogels भी है कि करने के लिए CYT। सी अलावा धातु नैनोकणों होते हैं। 414 एनएम पर absorbance और कहा कि 408 एनएम के बीच का अंतर बढ़ाने के लिए और फिर जब जैल उत्तराधिकार में क्रमश: नाइट्रोजन नाइट्रिक ऑक्साइड को उजागर कर रहे हैं और फिर कम करने के लिए देखा जाता है।

सुपर कार्बन डाइऑक्साइड एक धीमी गति से पर्याप्त दर, CYT की व्यवहार्यता पर रिहा नहीं किया जाता है तो। सी का गठन aerogels के भीतर समझौता हो जाएगा। यह अलग से कार्बन डाइऑक्साइड को रिहा द्वारा जैल बनाने के बाद परिणामस्वरूप यूवी दृश्य स्पेक्ट्रा की तुलना से पता चला हैदरों (9 चित्रा)।

आकृति 1
चित्रा 1: गंभीर बिंदु सुखाने तंत्र महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने उपकरण (ए) के सामने और (बी) से दिखाया तंत्र की पीठ के बगल में दिखाया हस्तांतरण नाव और तंत्र दरवाजे के साथ वापस आ गया।।

चित्र 2
चित्रा 2: गत्ता मंच एक साधन के बीम के रास्ते में एक airgel के आयोजन के लिए इकट्ठे गत्ता मंच।।

चित्र तीन
चित्रा 3: नाइट्रिक ऑक्साइड संवेदन सेट-अप नाइट्रिक ऑक्साइड संवेदन सेट-अप (ए) धूआं हुड संलग्न 10% नाइट्रिक ऑक्साइड सहित दिखाया गया है।90% नाइट्रोजन सिलेंडर, ट्यूबिंग, और टी-वाल्व, और (बी) डाला सुइयों के साथ क्युवेट।

चित्रा 4
चित्रा 4:।। नमूना CYT ग -SiO 2 aerogels 4.4 मिमी, 40 मिमी, 70 मिमी और पोटेशियम फॉस्फेट बफर में 15 माइक्रोन के CYT encapsulating aerogels सी एक पैसा भी की तुलना में दिखाया जाता है बाएं से दाएं।। ये aerogels लगभग 0.2-0.5 सेमी उच्च रहे हैं। 9 अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

चित्रा 5
चित्रा 5:। CYT ग -SiO 2 airgel स्पेक्ट्रोस्कोपी (क) 50 मिमी फॉस्फेट बफर सोल में 15 माइक्रोन के साइटोक्रोम ग दिखाई स्पेक्ट्रा।संविधान; (ख) Au (5 एनएम) ~ CYT ग -SiO 2 airgel। (ग) CYT ग -SiO 2 airgel (हवा के संपर्क में)। (घ) CYT। सी -SiO 2 airgel (3.5 मिनट के लिए नाइट्रिक ऑक्साइड से अवगत कराया)। जेल के प्रत्येक प्रकार के ये प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा स्पष्टता के लिए भरपाई कर रहे हैं, और धराशायी लाइन बफर में CYT। के सी Soret चोटी की स्थिति को दर्शाता है। प्रत्येक स्पेक्ट्रम के 15 माइक्रोन के CYT। सी है, वहीं जेल मोटाई (या ऊंचाइयों) 1 सेमी समाधान cuvet एक उच्च समाधान absorbance में जिसके परिणामस्वरूप की तुलना में केवल 0.2-0.5 सेमी हैं। 9 अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

चित्रा 6
चित्रा 6: समझाया बफर एकाग्रता के रूप में Aerogel स्पेक्ट्रोस्कोपी विविध है औसतन यूवी दृश्य encapsulating 15 जैल के लिए जेल पथ की लंबाई से विभाजित aerogels के वर्णक्रम absorbance _।6, एम CYT 70 मिमी (काला) (4 स्पेक्ट्रा के औसत), 40 मिमी (लाल, डॉटेड) (8 स्पेक्ट्रा की औसत), और 4.4 मिमी (हरे, धराशायी) (9 स्पेक्ट्रा के औसत) पोटेशियम फॉस्फेट बफर में सी। । 9 अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

चित्रा 7
चित्रा 7:।।। Aerogel परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रोस्कोपी की सोडियम फॉस्फेट बफर समाधान में CYT सी (ठोस) परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रा, CYT के दो प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा ग -SiO 2 aerogels (धराशायी), और Au के दो प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा (5-एनएम) ~ CYT। सी SiO- 2 aerogels (बिंदीदार)। 9 अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: CYT साथ नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने ग -SiO 2। । sub> aerogels पारी निगरानी (ΔA = एक 414 एनएम - एक 408 एनएम)। CYT की Soret तीव्रता में सी (ठोस लाल) और Au ~ CYT सी (नीले धराशायी) गैस प्रवाह के रूप में 2 Sio समग्र airgel nanoarchitectures में समझाया। और नाइट्रिक ऑक्साइड (जहां Soret चोटी अधिकतम ~ 414 एनएम पर है) (~ 408 एनएम पर जहां Soret चोटी अधिकतम है) नाइट्रोजन के बीच toggled है। प्रत्येक वक्र CYT से दो के साथ, 3-4 परीक्षणों के एक औसत है ग -SiO 2 परीक्षण ΔA पर नजर रखी = एक 414 एनएम -। एक 407 एनएम के बाद प्रारंभिक Soret चोटी अधिकतम इन परीक्षणों के लिए 407 एनएम पर था। 9 अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

9 चित्रा
चित्रा 9:। सुपर तरल रिलीज के समय का प्रभाव औसतन यूवी दृश्य वर्णक्रम absorbance CYT के लिए जेल पथ की लंबाई से विभाजित ग -SiO 2 aerogels ENCA।psulating 10 माइक्रोन CYT। 50 मिमी फॉस्फेट बफर जिसमें supercritically सूखे aerogels 45 मिनट (ठोस, काली (9 स्पेक्ट्रा की औसत)) या 7 मिनट (धराशायी, लाल (4 की औसत से अधिक है या तो रिहा सुपर कार्बन डाइऑक्साइड द्वारा किए गए थे में ग स्पेक्ट्रा))। 9 अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

Discussion

के रूप में वर्णित है, इस प्रक्रिया लगातार व्यवहार्य CYT का उत्पादन किया गया। सी aerogels भीतर समझाया। Aerogels भीतर की CYT। सी एकाग्रता 5 से 15 माइक्रोन और प्रारंभिक CYT। सी समाधान aerogels 4.4 से प्रोटीन व्यवहार्यता पर गंभीर हानिकारक प्रभाव के बिना 70 मिमी फॉस्फेट के लिए अलग किया जा सकता भीतर समझाया का बफर एकाग्रता से अलग किया जा सकता है। हालांकि, शिखर केंद्र और विशेषता CYT के शिखर चौड़ाई। सी aerogels में Soret चोटी के लिए वे क्या CYT। घोल में ग रहे हैं जब CYT। सी 40 मिमी बफर 9 के समाधान से aerogels में समझाया है के करीबी रहे हैं।

CYT के संश्लेषण। सी -SiO 2 aerogels शुरू अभिकर्मकों में से कुछ की उम्र से प्रभावित है। मेथनॉल, tetramethoxysilane, और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान सभी हीड्रोस्कोपिक रहे हैं और हर एक से दो महीने प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। बढ़ी हुई है कि पानी में बनाता हैसमय के साथ इन अभिकर्मकों जेल संरचनात्मक विशेषताओं और सोल करने वाली जेल संक्रमण का समय प्रभावित करता है।

जब सुपरक्रिटिकल सुखाने प्रदर्शन, महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने तंत्र के स्थानांतरण नाव मोटी अठारह 0.5 सेमी, 1 सेमी व्यास जैल को पकड़ कर सकते हैं। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित है, एक विशिष्ट भरने और draining प्रक्रिया प-जैल में कार्बन डाइऑक्साइड को हस्तांतरण करने के बाद किया जाना चाहिए। यह ध्यान रखें कि निकासी प्रोटोकॉल की शुरुआत में महत्वपूर्ण है, कार्बन डाइऑक्साइड और एसीटोन की draining मिश्रण इस तरह के एक उच्च दर है कि नाली ट्यूब नमी बाहर पर बर्फ के लिए संघनक के साथ कड़ी जमा देता है पर बहता है। बाद एसीटोन निर्जल नहीं है और इस पानी को कभी-कभी एक हद तक है कि नाली ट्यूब वास्तव में मोज़री को स्थिर हो सकता है मिश्रण बाहर draining कुछ पानी होता है। यह इस तरह के मोज़री के लिए घड़ी और प्रवाह के एक ठहराव के लिए सुनने के लिए आवश्यक है। नाली वाल्व में कुछ मिनट के लिए बंद कर दिया जाना चाहिए ताकि रोकना है, तो एक रोकना पता चला है पिघल जाएगा। मेंसबसे खराब स्थिति है, अगर नाली वाल्व बंद नहीं है, एक रोकना इतना दबाव का निर्माण करने के लिए है कि नाली ट्यूब जबरदस्ती उपकरण बंद चबूतरे का कारण बन सकता है। पहले कुछ समय के बाद नाली, एसीटोन के बहुमत तंत्र के बाहर rinsed होगा किया गया है, और गीला बर्फ मात्रा की घटना को नाटकीय रूप से कम हो जाएगा। मुक्ति उत्तरोत्तर सूखी बर्फ के समान होगा के रूप में निकासी प्रोटोकॉल एसीटोन उपस्थिति (जैसे खुशबू के रूप में) के किसी भी अवशिष्ट सबूत के साथ जारी निकासी की प्रक्रिया के अंत तक undetectable हो रहा है।

बाद तंत्र में कार्बन डाइऑक्साइड सुपर तरल तरल से संक्रमित कर दिया है और निकाल प्रक्रिया शुरू हो गया है, यह कम से कम 45 मिनट से अधिक एक धीमी दर पर तरल पदार्थ के रूप में जारी करने के लिए प्रक्रिया 9 में संकेत आवश्यक है। रिलीज के एक उच्च दर aerogels के भीतर (जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 9) CYT की व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं। सी और aerogels खुद को वास्तव वीं के रूप में अलग तोड़ सकता हैई तरल पदार्थ जैल से बचने के लिए जाती है। सामान्य में, यहाँ तक कि जब aerogels तंत्र दरवाजा खोलने के बाद बरकरार रहेगा, यह महत्वपूर्ण है उन्हें ध्यान से और धीरे से संभाल करने के रूप में वे भंगुर होते हैं और आसानी से तोड़ सकते है।

नियंत्रण सिलिका जैल कि CYT के साथ डाल रहे हैं। ग -SiO 2 जैल निर्धारित करने के लिए यदि जैल में कार्बन डाइऑक्साइड हस्तांतरण सफल रहा था सुपरक्रिटिकल सुखाने के बाद किया जाता है। कभी कभी CYT। सी -SiO 2 जैल बादल प्रकट हो सकता है और यह महत्वपूर्ण है निर्धारित करने के लिए अगर यह अधूरा विलायक हस्तांतरण की वजह से है या यह CYT। सी की एकाग्रता के साथ क्या करने के लिए या जैल भीतर समझाया बफर है हो सकता है। CYT बिना सिलिका जैल। भर में एक सजातीय, पारदर्शी उपस्थिति है प्रकट ग, तो इस सबूत के रूप में है कि विलायक हस्तांतरण पूरी तरह से भले ही CYT हुआ लिया जा सकता है। ग -SiO 2 जैल उन्हें कुछ बादल की है। सिलिका जैल के भीतर बादलCYT। बिना सी सुखाने के बाद यह संकेत करता है कि कुछ एसीटोन निकाल दौरान जैल के अंदर बने रहे।

जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में संकेत दिया है, महत्वपूर्ण सुरक्षा सावधानियों जब नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) के साथ काम कर लिया जाना चाहिए। aerogels का उपयोग कर कोई पता लगाने के लिए, यह बहुत अच्छी तरह से क्युवेट सील करने के लिए और गैस एक धूआं हुड में aerogels पर बह निकास के लिए आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, पूरी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर कोई गैस के लिए निवेश की सीमा को अतिरिक्त सावधानी के लिए कोई गैस सिलेंडर के साथ एक धूआं हुड में ले जाया जा सकता है। पर हवा सं साथ संपर्क तुरंत अत्यधिक जहरीला नाइट्रोजन डाइऑक्साइड, नाइट्रोजन tetroxide या दोनों का उत्पादन होगा। कोई भी गर्मी और संक्षारक धुएं का उत्पादन करने के लिए पानी के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं। इसलिए, कोई जोखिम को निरंतर प्रत्यक्ष ऊतक विषाक्तता में परिणाम हो सकता है।

CYT का उपयोग करते हैं। ग -SiO 2 aerogels नाइट्रिक ऑक्साइड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए, Soret बैंड शुरू में ~ 408 एनएम पर होगा और बदलाव होगानाइट्रिक ऑक्साइड की उपस्थिति में ~ 414 एनएम के लिए। वापस नाइट्रोजन के लिए स्विचन के बाद, Soret बैंड ~ 408 एनएम पर केंद्रित किया जा रहा करने के लिए वापस रिवर्स चाहिए। यह भी CYT का उपयोग करने के लिए संभव हो सकता है। ग -SiO 2 aerogels जैसे कार्बन मोनोऑक्साइड 27 के रूप में अन्य ligands की उपस्थिति का पता लगाने के लिए।

अलग प्रकाशित प्रक्रियाओं समाधान में साथ CYT। ग सोने या चांदी नैनोकणों के संयोजन सोल के साथ मिश्रण और supercritically aerogels 4-8 फार्म को सुखाने से पहले का एक जोड़ा कदम शामिल हैं। CYT की यूवी दृश्य स्पेक्ट्रोस्कोपी की तुलना। सी CYT की है कि धातु नैनोकणों के साथ aerogels में समझाया। सी धातु नैनोकणों बिना aerogels में समझाया पता चलता है कि encapsulation तकनीक के इन दो प्रकार का उत्पादन aerogels के भीतर इसी तरह की व्यवहार्यता CYT। सी (चित्रा 5) । हालांकि, CYT। सी धातु नैनोकणों के साथ समझाया CYT की तुलना में थोड़ा अधिक स्थिर है। ग encapsulateडी aerogels 9 भीतर धातु नैनोकणों के बिना। CYT। सी aerogels के दोनों प्रकार की सीडी स्पेक्ट्रा हालांकि दोनों की aerogels भीतर CYT। सी कुछ खुलासा का संकेत (चित्रा 7) बफर में की CYT। सी स्पेक्ट्रम से अलग भी इसी तरह के हैं। CYT पर पिछली रिपोर्टों। सी aerogels में समझाया सुझाव है कि परिपत्र द्विवर्णता स्पेक्ट्रोस्कोपी की संभावना सबसे अधिक प्रोटीन की सबसे बाहरी परत का आकलन किया जाता है, सिलिका जेल के साथ संपर्क पर सामने आया तो धातु nanoparticle-केन्द्रक बहुपरती CYT के भीतर। सी संरचनाओं या शिथिल संगठित संरचनाओं कि फार्म जब कोई धातु नैनोकणों aerogels 4,9 में मौजूद हैं। के रूप में हालांकि यूवी दृश्य स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा aerogels अंदर स्वयं संगठित संरचना के किसी भी प्रकार के भीतर CYT। ग के बहुमत मुड़ा रहता है। प्रोटोकॉल के साथ साथ बिना नैनोकणों वर्णित का लाभ यह है कि महंगी खरीद या धातु का समय लेने वाली संश्लेषणनैनोकणों आवश्यक नहीं है। प्रोटीन नहीं अक्सर सफलतापूर्वक aerogels भीतर समझाया गया है, और इसलिए इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है कि यह भविष्य Bioanalytical उपकरणों के लिए संभावित महत्व के साथ aerogels में अन्य प्रोटीन encapsulating के लिए एक अधिक सामान्य विधि के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम और / या प्रकाशन के लिए समर्थन विज्ञान प्रगति के लिए फेयरफील्ड विश्वविद्यालय के कॉलेज कला के विज्ञान संस्थान और विज्ञान, फेयरफील्ड विश्वविद्यालय के संकाय अनुसंधान अनुदान, एक Cottrell कॉलेज विज्ञान पुरस्कार अनुसंधान निगम से, कला और विज्ञान फेयरफील्ड विश्वविद्यालय के कॉलेज और द्वारा प्रदान किया गया फेयरफील्ड विश्वविद्यालय के रसायन विज्ञान और जैव रसायन विभाग। हम कृतज्ञता यह सामान्य अनुसंधान के क्षेत्र के लिए काफी उपयोगी अंतर्दृष्टि और संबंध में सलाह के लिए जीन मैरी वालेस स्वीकार करते हैं। इसके अलावा, हम विस्तार एक बहुत ही खास सब अतीत, वर्तमान, और हार्पर-Leatherman रिसर्च लैब के भविष्य के स्नातक शोधकर्ताओं के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 ml
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0%-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 ml syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
  2. Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
  3. Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
  4. Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
  5. Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
  6. Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
  7. US Patent. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
  8. Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
  9. Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
  10. Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
  11. Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
  12. Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
  13. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
  14. Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
  15. Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
  16. Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
  17. Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
  18. Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
  19. Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
  20. Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
  21. Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
  22. Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
  23. Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
  24. Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
  25. Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
  26. Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
  27. Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
  28. Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
  29. Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
  30. Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
  31. Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 109 साइटोक्रोम प-जैल aerogels सिलिका aerogels पराबैंगनी दर्शनीय नाइट्रिक ऑक्साइड
साइटोक्रोम encapsulating<em&gt; ग</em&gt; धातु नैनोकणों बिना सिलिका Aerogel Nanoarchitectures में जबकि बनाए रखना गैस चरण bioactivity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E.… More

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter