Summary
Denne prosedyren beskriver hvordan du kapsle cytokrom c (cyt. C) i silika (SiO 2) sol-geler, prosess disse gels å danne bioaerogels, og bruke disse bioaerogels å raskt gjenkjenne nitrogenoksid (NO) gjennom en gassfase reaksjon. Denne type protokoll kan hjelpemiddel i den fremtidige utviklingen av biosensorer eller andre Bioanalytical enheter.
Abstract
Applikasjoner som sensorer, batterier og brenselceller har blitt forbedret ved bruk av meget porøse aerogel når funksjonelle forbindelser er innkapslet i aerogeler. Men noen rapporter om innkapsle proteiner i sol-gels som er behandlet for å danne aerogels eksistere. En fremgangsmåte for innkapsling av cytokrom c (cyt. C) på silika (SiO 2), Sol-geler som er superkritisk bearbeidet for å danne bioaerogels med gassfase-aktivitet for nitrogenoksid (NO) er presentert. Cyt c. Ble tilsatt til en blandet silikasol under kontrollerte proteinkonsentrasjon og bufferstyrkeforhold. Solen Blandingen blir deretter gelert og væsken fyller gelen porene er erstattet gjennom en serie av løsningsmiddelutveksling med flytende karbondioksid. Karbondioksidet blir brakt til sitt kritiske punkt og luftet ut for å danne tørre aerogel med cyt. C innkapslet inne. Disse bioaerogels er preget med UV-synlig spektroskopi end sirkulærdikroisme spektroskopi, og kan brukes for å påvise nærværet av gass-fase nitrogenoksid. Suksessen med denne fremgangsmåten er avhengig av regulering av cyt. C konsentrasjonen og bufferkonsentrasjon, og krever ikke andre komponenter slik som metall nanopartikler. Det kan være mulig å innkapsle andre proteiner ved bruk av en lignende fremgangsmåte som gjør denne prosedyren viktig for potensiell fremtidig utvikling bioanalytical enhet.
Introduction
Cytokrom c (cyt. C) er en viktig elektron-transfer protein som er involvert i kroppens celleåndingen reaksjoner. Det har vist seg å være involvert i apoptose, en kontrollert form for celledød, og den kan detektere så små toksiske molekyler som nitrogenoksid og karbonmonoksid 1-3. Nitrogenoksyd (NO) spiller en rolle i en rekke fysiologiske prosesser som finner sted i den nervøse, kardiovaskulære, og immunsystemet. Mens cyt. C vanligvis krever et vandig miljø bufret til pH-nøytralt verdier for å forbli strukturelt intakt og aktiv, har forskning vist at cyt. C kan beholde sin struktur og funksjon i solide materialer kjent som aerogels under visse betingelser 4-9.
Aerogeler er meget porøse materialer, som ofte dannes ved å syntetisere sol-gel metalloxyder (mens metalloksid aerogeler er meget vanlig, har karbon og andre typer av aerogeler blitt syntetisert. Et eksempel er InP aerogels) 10 og tørking av disse sol-gelene på en slik måte at den porøse faste matriks forblir uendret 11-14. Alle porene i faststoff aerogeler resultere i mye tilgjengelige overflateareal som gjør aerogeler svært nyttige for alle anvendelser hvor overflatereaksjoner er viktige. Når kjemisk eller biokjemisk funksjonaliteten er montert inne i aerogelen nanoarchitecture, har det vist seg at den fysiske porøsitet og forbedret overflatearealet til aerogeler bidra til å forbedre sensorer, samt elektroder for batterier, brenselceller og supercapacitor applikasjoner 11,15-23 . For å kunne tørke aerogeler på en måte som etterlater den porøse faste matriks uforandret, er det vanlig å fjerne løsningsmidlet som er igjen i porene etter at sol-gel syntese gjennom superkritisk oppløsningsmiddel-ekstraksjon. Enhver pore kollaps som kan forårsakes ved overflatespenningskreftene som et oppløsningsmiddel fordamper fra gelen blir minimalisert fordi i overkritisk tørking, en væske-damp-grensesnitt aldri former.
c blir innkapslet i sol-gels som har blitt holdt våt eller som har blitt tørket ambiently 24-30. Rapporter om innkapslende biomolekyler i sol-geler som deretter tørkes for å danne superkritisk aerogeler er sjeldnere på grunn av den nødvendige behandling som kan være skadelig for strukturen av mange proteiner. I tilfelle av cyt. C, visse betingelser gjør det mulig å beholde evnen til cyt c. Å detektere og reagere på gassfase-nitrogenoksid innenfor aerogeler. Når stabilisert i aerogel, høy kvalitet porestruktur aerogel letter reaksjonen mellom cyt. C og nitrogenoksid 4,8,9. Cyt. C kan innkapsles i aerogels ved først å knytte det i flere lag rundt gull eller sølv nanopartikler i løsning 4-8. Disse flerlags oppbygninger tjener til å beskytte proteinet i aerogel matrisen. I den siste approach som vi har utviklet seg, når proteinkonsentrasjonen og bufferstyrke styres sammen med andre syntetiske betingelser, cyt. c beholder integritet i løpet av de aerogeler selv uten metall nanopartikkel innledende krets 9.
Syntesen begynner som mange aerogel synteser begynne ved å blande silika sol-gel forløpere for en bestemt periode. Det er etter en viss tid å blande det cyt. C blir tilsatt som en bufret oppløsning inn i blandingen. Gelering skjer deretter for å danne en porøs silisiumdioksyd fast struktur hvor porene er fylt med vann, metanol, gjenværende reaktanter og biprodukter. Denne væsken som fyller porene kan skylles ut sammen med forskjellige oppløsningsmidler gjennom en serie av løsemiddel utveksling, de siste utveksling med flytende karbondioksyd finner sted innenfor et kritisk punkt tørkeapparat holdes ved lav temperatur. Å bringe gelene over den kritiske temperatur (31,1 ° C) av karbondioksyd letter dannelsen av såupercritical fluid inne i trykkapparat som kan luftes for å danne tørre, høyporøse aerogeler. Den relativt lave temperatur som kreves for karbondioksid for å danne et superkritisk fluid er fordelaktig sammenlignet med andre løsningsmidler for den holder proteinet under en temperatur ved hvilken den kunne denaturere.
Våre metall nanopartikkel-fri tilnærming for å innkapsle cyt. Ci aerogeler er fordelaktig fordi det er en enkel fremgangsmåte som kan føre til utvikling av en mer generelt anvendelig protokoll for innkapsling av andre proteiner i tillegg. Mange proteiner kan ikke reagerer med metallnanopartikler på samme måte som cyt. C gjør, og metall nanopartikkel syntese eller kjøp gir ekstra tid og kostnader til fremgangsmåten. De få rapporter om innkapsle proteiner i aerogels gjøre utviklingen av denne prosedyren et betydelig skritt fremover for å finne en mer generell prosedyre for innkapsling av andre proteiner i aerogels som kan hjelpe in potensielle fremtidige Bioanalytical enheter.
Protokollen delen av dette manuskriptet skisserer hvordan å syntetisere -silisiumdioksydsol-gels, kapsle cyt. C inn i disse sol-gels, tørke disse sammensatte sol-gels å danne aerogels, karakteriserer disse bioaerogels bruker UV-synlig og sirkulærdikroismeanalyse spektroskopi og påvise tilstedeværelse av gassfase-nitrogenoksid med disse bioaerogels. Cyt. C har blitt innkapslet i aerogel når først oppløst i 4,4 til 70 mM, vandige oppløsninger av fosfatbuffer. Imidlertid har optimalisert proteinstrukturen i aerogeler blitt funnet å resultere når innkapsling av 40 mM fosfatbufferoppløsninger av cyt c. Fremstilling av belastede aerogel cyt. C konsentrasjoner i området fra 5 til 15 uM 9. Derfor protokollen gitt nedenfor, er å syntetisere aerogeler ved anvendelse av 40 mM fosfatbufferoppløsninger av cyt c. Som resulterer i en lastet cyt c. Konsentrasjonen i de aerogeler av 15 uM. </ P>
Protocol
Vernebriller, laboratoriefrakk og laboratorie hansker bør brukes til enhver tid under prosedyren. Bruk aldri kritisk punkt tørkeapparat uten vernebriller. Alle løsninger som inneholder tetrametoksysilan, metanol, etanol, aceton og ammoniakk skal behandles innen en avtrekkshette.
1. Kontroller Buffer og Cyt. C Solutions
- For å gjøre ~ 750 ml pH 7, 40 mM kaliumfosfatbuffer, først fremstille 500 ml av 0,04 M kaliumfosfat monobasisk ved å veie ut 2,72 g av monobasisk kaliumfosfat og oppløsning i vann ved anvendelse av en 500 ml målekolbe.
- Fremstille 500 ml av 0,04 M kaliumfosfat dibasisk ved å veie ut 3,48 g av kaliumfosfat dibasisk og oppløsning i vann ved anvendelse av en 500 ml målekolbe.
- Hell dibasisk saltoppløsningen inn i et stort begerglass med en rørestav og begynne omrøring av oppløsningen på en røreplate.
- Tilsett langsomt partier av monobasisk salt solution til den dibasiske saltoppløsningen mens overvåking av pH-verdien med en pH-elektrode og måler inntil pH-verdien er 7,00. Ca. 250-300 ml av enverdig saltoppløsningen vil bli benyttet.
- Vei ut ca 0,023 g cyt. C og plasser i scintillasjonsglass. Legg 2,000 mL av klare kaliumfosfatbuffer ved anvendelse av en mikropipette og deretter virvle løsningen å blande inntil alt av det faste, red cyt. C er løst opp i løsningen, og ingen partikler forblir.
- Ta 20 mL av forberedt cyt. C løsning og legge til en 1 cm banelengde plastkuvette. Tilsett 3 ml forberedt buffer.
- Ta UV-vis spekteret 300-700 nm ved anvendelse av buffer i referansecellen. Bruk cyt. C absorbans (A) ved 409 nm, ekstinksjonskoeffisienten 31 (ε) av 106100 M -1 cm -1, kyvetten veilengden (L), og den Beer-Lamberts lov for å bestemme konsentrasjonen (c) av løsningen (A = εlc).
- Tilbake beregne konsentrasjonen av den opprinnelige fremstilte oppløsning. De 2 ml stilles cyt c. Oppløsningen er vanligvis mellom 0,7 til 0,9 mM i konsentrasjon.
- Fortynne den opprinnelige fremstilt cyt c. Oppløsningen til 800 ul av 0,105 mM ved å pipettere 117 pl av 0,72 mM fremstilt cyt. C oppløsning inn i en scintillasjonsflaske. Deretter legger balansen av 800 ul (683 mikroliter i dette tilfellet) preparerte buffer. Swirl å blande. Den eksakte volumer vil variere avhengig av den nøyaktige konsentrasjon av det opprinnelige fremstilt cyt. C oppløsning som volumet av cyt. C til pipette er beregnet som (800 pl * 0,105 mM) / (opprinnelig cyt. C konsentrasjon i mM).
- Oppbevar originale forberedt og utvannet cyt. C løsninger ved 2-8 ° C i kjøleskap til den er klar til bruk i opptil to uker.
2. syntetisere Silica (SiO 2) Sol
- Merk en engangs 50 ml polypropylen beger 'Væraker A '. Plasser begeret på pannen av en analytisk balanse og bruke et glass Pasteur pipette for å legge til 1,88 g tetrametoksysilan i begerglasset. Null balanse og deretter pipetter 2,88 g metanol inn i 'Beger A'.
- Cover 'Beaker A' med Parafilm.
- Merk en engangs 50 ml polypropylen beger 'Beaker B'. Legg en magnetisk oppsikt bar og plass på pannen av en analytisk balanse. Bruk et glass pipette for å legge til 0,75 g vann og 3,00 g metanol.
- Cover 'Beaker B' med Parafilm.
- Begynn omrøring innholdet av 'Beger B' på en røreplate inne i et avtrekksskap, og deretter bruke en sprøyte for å sette 5 ul av 28,0 til 30,0% ammoniumhydroksyd-løsning gjennom Parafilm dekke inn i blandingen under omrøring.
- Så snart steg 2,5 er ferdig, legge innholdet i 'Beaker A' til 'Beaker B'. Omrør blandingen i 20 minutter mens dekket av Parafilm.
3. Forbered Gel Molds
Merk: Deter tid for å fremstille gelen mens formene silikasolen blandingen under omrøring i trinn 2,6.
- Erverve 8-9 polypropylen scintillasjonsglass (16 mm x 57 mm, volum størrelse 6,5 ml, med bunner skiver av) og tilsvarende caps. Sett plastfolie over cap slutten av hetteglasset for å skape et flatt underlag for gelen for å danne på og legg lokket over det å sørge for at plastfolie forblir intakt inne i hetten.
- Stille opp hetteglass med cap-end ned på benken toppen og åpnet bunner vendt opp.
4. Forbered Cyt. C silice Sol-gels
- Ved ferdigstillelse av sol blande (trinn 2,6), tilsett 3 ml av sol blandingen til en ren engangs 50 ml polypropylen beger.
- Bruke et glass Pasteur-pipette til langsomt å slippe 500 ul av de 0,105 mM fortynnet cyt. C-løsning (fremstilt i trinn 1.9) i 3 ml sol blandingen i løpet av ~ 1 min. Sørg for å virvle blandingen mens du legger den cyt. C for å unngå dannelse av storerøde klumper. Forutsatt at volumene er additive, ved fortynning av 500 ul av 0,105 mM cyt. C løsningen på 3500 pl, c-konsentrasjonen nå i solen er cyt., I teorien, 15 uM.
- Pipetter 0,5 ml av den resulterende cyt. C silikasol i hver forberedt form. Også pipettér 0,5 ml av gjenværende "ren" silikasol inn i ett eller to støpeformer til bruk som kontrollprøver i løpet av det overkritiske tørkeprosessen.
- Dekk til ansikt-opp åpninger av formene med Parafilm og satt i kjøleskap (~ 2-8 ° C) over natten eller i minst 12 timer for å produsere sol-geler.
- Ta formene ut av kjøleskapet. Fjern det Parafilm fra toppen av en form inneholdende en cyt c sol-gel.; også fjerne hetten og plast brytes fra bunnen.
- Etter tilsetning av noe etanol fra en vaskeflaske inn i formen, bruker sirkulær skive enden av en sprøytestemplet til skyv gelen ut av formen og inn i en ren 20 ml scintillasjonsglass fortseller innelukker ca. 5 ml etanol.
- Gjenta denne gel for fjerning av komponenten (trinnene 4,5 og 4,6) inntil alt cyt. C geler blir tilsatt til flasken og alle de silikageler blir tilsatt til en separat ampulle. Hvis mer enn én konsentrasjon av cyt. C gel er gjort, må du huske å lagre som gels sammen i adskilte beholdere. Deretter fyller hetteglassene til toppen med etanol, lue og lagre mellom 2-8 ° C.
- Hver fjerde time i løpet av dagen, fjerne gels fra kjøleskapet, dekanter etanol off gels og erstatte med ny etanol.
- I løpet av ytterligere tre dager, senk den våte sol-geler i aceton, dekantering og tilsetning av frisk aceton tre ganger om dagen.
5. superkritisk Dry Cyt. C silice Sol-gels
- Avkjøl et kritisk punkt tørkeapparat (se figur 1) til 10 ° C ved å innstille temperaturen på en vedlagt sirkulator til 8 ° C.
- Så snart anordningen har reached 10 ° C, utføre en lekkasjetest på anordningen ved å fylle en overføring båt med aceton og forsegles inne i anordningen.
- Åpne påfyllingsventilen i apparatet og tilsett karbondioksyd inntil anordningen er halvfull.
- Steng påfyllingsventilen og lytte nøye for piping på dører og ventiler der O-ringer eller pakninger kan bli dårligere.
- Skift eventuelle o-ringer eller pakninger hvis en lekkasje er funnet.
- Etter endt lekkasjetest, åpne tømmeventilen for å slippe aceton og karbondioksid i renne av en avtrekkshette. Deretter fjerner overførings båt fra apparatet.
- Etter å sikre at apparatet er lekkasjefri, forsiktig helle den våte geler fra scintillasjonsampuller, sammen med mesteparten av acetonet, inn i overførings båtens tre lange seksjoner (prøvekurver eller gasbind deksler er ikke nødvendig). Delikat presse og flytte gels i båten med tang for å sikre at alle gels er helt nedsenket in aceton. Tilsett mer aceton, om nødvendig før forsegling av båten innsiden av anordningen.
- Åpne påfyllingsventilen av anordningen for å legge til karbondioksyd, og åpne tømmeventilen for å slippe aceton i fem minutter så snart aceton blandes med karbondioksyd er observert å være synker til bunnen av anordningen gjennom apparatet vinduet. Det siger av aceton til bunnen vil inntreffe før apparatet er helt fylt med karbondioksyd, slik at fylleventilen skal være åpen i den grad det er nødvendig i løpet av dreneringen, slik at apparatet vil fortsette å fylle selv når avløpet er åpent.
- Lukk tappeventilen. Hold fylleventilen sprakk åpne litt.
- Fem minutter senere, åpner tappeventilen i fem minutter igjen og juster påfyllingsventilen skal åpnes nok slik at apparatet fortsatt full under hele drenering tid. Lukk tømmeventilen, holde påfyllingsventilen sprekker åpne, deretter gjenta denne drenering skritt en gang femminutter senere.
- Etter disse tre første dreneringstrinn, åpner avløpet i 5 min ved et tidspunkt omtrent hvert 40 min i løpet av den periode på minst seks timer for å sikre fullstendig utbytting av aceton av flytende karbondioksid i gelene. Juster alltid fylleventilen for å være åpen nok i løpet av hver drenering slik at væskenivået i apparatet aldri faller under toppen av båten under tømming.
- Når drenering trinnene er fullført, lukker fylleventilen, og tøm flytende karbondioksid, slik at nivået fortsatt er synlig like ovenfor de ledende delene på båten ved å se gjennom apparatet vinduet.
- Sette temperaturen til anordningen festet sirkulatoren til 40 ° C for å sikre at de flytende karbondioksid stiger over sin kritiske temperatur og trykk (T c = 31 ° C; P c = 7,4 MPa).
- Etter omtrent 15 min, observerer overgangen fra væske til superkritisk fluid gjennom apparatet vinduet som væsken meniscoss over de ledende delene av båten forsvinner. La det være minst 15 minutter av likevekt tid, og åpne lufteventilen et lite beløp for å begynne å slippe superkritisk væske.
- I løpet av ca 45 min, fortsette å inkrementelt å åpne lufteventilen bredere og bredere, slik at en jevn, men meget lav fres til å frigjøre fluid kan bli hørt og trykkmåleren er observert å sakte avta til null.
- Etter press fra apparatet har gått til null, åpne apparatet døren, ta ut båten, og bruke pinsett til å plassere de nylig tørket aerogels i rene glass scintillasjonsglass.
6. karakter Cyt. C silice Aerogels med UV-synlig og sirkulærdikroismeanalyse (CD) spektroskopi
- Forbered en papp plattform for å holde aerogel bautasteiner i strålebanen av UV-synlig spektrofotometer eller CD spektrometer.
- Klipp ut en 2,5 cm x 2,5 cm stykke tynn papp (for eksempel papp fra en boks av Laboratory vev), brett den i to, kuttet halvveis opp på fold, deretter kaste de to klaffer, laget ved å kutte, tilbake.
- Klipp ut en 5 cm x 5 cm stykke tynn papp, med en 1,5 cm x 1,5 cm firkantet hull i midten. Deretter bruker svart elektriske tape for å redusere størrelsen på lasterommet til 0,5 cm x 0,5 cm.
- Tape klaffene av det brettede og snitt papp mot 5 cm x 5 cm stykke papp, slik at en liten bøyd overflate er opprettet for en aerogel monolitt å sitte rett foran den 0,5 cm x 0,5 cm hull (se Figur 2) . Deretter tape baksiden stykke papp til UV-synlig spektrofotometer, slik at hullet er på linje med strålebanen.
- Måle tykkelsen av gelene, som vil bli brukt for veilengder, med et mikrometer.
- Plasser en gel på papp og måle et spektrum 300-800 nm med luft i referansekammeret av UV-synlig spektrofotometer.
- Monter et polynom, A = en n, til bølgelengden (λ) region hvor absorbans (A) er hovedsaklig på grunn av bakgrunns spredning, ~ 700-800 nm. Det er en koeffisient typisk skikket til et tall mellom ~ 1 x 10 8 og 1 x 10 6 og n koeffisienten er typisk i form av en rekke mellom ~ 2 og 3.
- Beregn scatter ved andre bølgelengder, ved hjelp av koeffisientene a og n, erholdt fra det passer.
- Trekk fra dette beregnes scatter bakgrunnen absorbans fra rå spektrum for å få et scatter korrigert spektrum.
- Monter scatter subtrahert spektrum med en gaussisk kurve i området på 370 til 490 nm ved bruk av passende software (GRAM / Al 8,0) for å bestemme topphøyden, topp senter, og maksimal bredde av Soret toppen av aerogel.
- Påfør Beer-Lambert lov å bruke den målte tykkelsen på gel for veilengden (l), utryddelse koeffisienten 31 (ε) av 106 100 M -1 cm -1 ci aerogel (A = εlc).
- Sammenligne den beregnede cyt c. Konsentrasjonen til konsentrasjonen teoretisk i gelen (15 uM) for å fastslå levedyktigheten til cyt. C i aerogel. Typiske prosent viabilities er nær 100%, men det bør bemerkes at disse viabilities er bare anslag fordi beregningen er basert på utryddelse koeffisient cyt. C i løsning 31 som antas å være litt annerledes enn utryddelse koeffisient cyt. ci aerogeler som ikke er kjent.
- Kjør nitrogen i CD instrument minst 5 min før du slår på lampen.
- Tape papp holderen til CD-spektrometer, slik at hullet er på linje med strålebanen.
- Måle en kontinuerlig bølgelengde blank spektrum med ingenting i pappen holderen 350-500 nm ved 100 nm / min, ta et gjennomsnitt av tre skanninger.
- Plasser en gel (tykkelse tidligere målt i trinn 6.2) på papp og måle et spektrum 350-500 nm ved 100 nm / min, ta et gjennomsnitt av tre skanninger.
- Gjenta UV-synlig og CD-målinger for alle aerogel monolitter av interesse.
7. Detect Tilstedeværelse av nitrogenoksid (NO) Gas med Cyt. C silice Aerogels
FORSIKTIG: Arbeide med NO er farlig og alt NO gass skal håndteres i et avtrekksskap eller utmattet i en avtrekkshette. Vedvarende eksponering til NO er giftig for vev som meget giftige nitrogendioksid og / eller nitrogen-tetroksyd vil dannes når ingen kommer i kontakt med luft. Varme og korroderende damp produseres også når det ikke kommer i kontakt med vann.
- Plasser en 8 L nitrogenoksid sylinder (10% nitrogenoksid, 90% nitrogen) i et godt ventilert avtrekk og justere trykket til 4 psi.
- Koble slangen til både den nitrogenoksid sylinder og til en nitrogensylinder (trykk innstilt på 6 psi) og koble opp endene av slangen til en T-ventil (se figur 3a).
- Velge en aerogel monolitt for eksperimentet og måle tykkelsen (eller banelengde) med et mikrometer.
- Plasser aerogel (~ 3 mm tykk) i en engangs kyvette med plastlokk og sette kyvetten inn i spektrofotometer. Skjær aerogel litt om nødvendig for å få plass i kyvetten.
- Sette inn to sprøytespisser inn i plasthetten av kyvetten, som er koblet til utgangen av T-ventil, og en er koblet til et rør for å tjene som eksos inn i avtrekksskap (se figur 3b). Bruk Parafilm å forsegle nålene til røret og hetten til kuvetten.
- Plasser en tom disponibel kyvette i referansecellen.
- Juster aerogel kyvetten posisjon for å sikre at aerogel ligger i strålebanen før start av eksperimentet.
- Ta en første spektrum 800-300 nm.
- Overvåke forskjellen mellom absorbansen ved 414 nm og absorbansen ved 408 nm mens dreie-T-ventilen til å veksle mellom nitrogen og nitrogenoksid / nitrogen-blanding til faste tidsintervaller å sørge for at ikke på noe tidspunkt er strømningshastigheten for nitrogen eller nitrogenoksyd / nitrogen-blanding så høy at aerogelen beveger seg rundt i kyvetten.
- Ta en siste spekteret fra 800 til 300 nm, når eksponerings sykluser er ferdig.
- Gjenta prosedyren med tre til fire bautasteiner for å oppnå en gjennomsnittlig sensing respons.
Representative Results
De beskrevne prosedyren resulterer i aerogels inneholder levedyktig cyt. C. Som angitt ved slutten av innføringen, kan cyt. C innkapsles fra vandige bufferløsninger som spenner 4,4 til 70 mM fosfat. Eksempler på cyt c. Silice (cyt. C -SiO 2) aerogel fremstilt av oppløsninger inneholdende forskjellige buffer-konsentrasjoner er vist i figur 4. Alle geler er relativt gjennomskinnelige, med geler fremstilt fra 70 mM buffer mest opake.
En sammenligning av spektroskopi av cyt c. Under forskjellige betingelser er vist i figur 5. En typisk spektrum (figur 5c) viser den store Soret topp rundt 408 nm for cyt. C -SiO 2 aerogeler og er svært lik den spekteret av cyt c. i løsning (figur 5a). I tillegg er et spektrum av cyt.c innkapslet i aerogeler med metallnanopartikler er også vist (figur 5b) og cyt c. -SiO 2 aerogel spektrum ligner dette spekteret også. Når cyt c. -SiO 2 aerogel utsettes for nitrogenoksid, er en typisk forskyvning av Soret topp observert (figur 5d).
UV-vis spektrene for geler fremstilt fra cyt. C løsninger i varierende bufferkonsentrasjoner er vist i figur 6. Alle disse geler viser karakteristisk uv-synlig spektroskopi-funksjoner som indikerer at cyt c. Er ikke i en denaturert tilstand i løpet av gelene. Imidlertid er redusert gjennomskinnelighet av gelene laget av 70 mM buffer resulterer i et lavere signal-til-støy-forholdet for disse spektra.
CD-spektra av cyt. C -SiO 2 aerogeler er lik spektrene av cyt c. c. i bufret oppløsning (figur 7).
Figur 8 viser en typisk nitrogenoksid overvåkning respons for cyt. C -SiO 2 aerogeler og tilhørende aerogeler som også inneholder metallnanopartikler i tillegg til cyt. C. Forskjellen mellom absorbansen ved 414 nm, og at ved 408 nm er vist å øke og deretter avta når gelene blir utsatt for nitrogenoksid og deretter nitrogen henholdsvis etter hverandre.
Dersom det superkritiske karbondioksyd ikke frigjøres på en langsom nok hastighet, levedyktigheten av cyt. C innenfor de dannede aerogeler vil bli kompromittert. Dette er åpenbart ved å sammenligne resulterende UV-synlige spekteret etter dannelse av geler ved å løsne karbondioksyd ved forskjelligpriser (figur 9).
Figur 1: Kritisk punkt tørkeapparat Det kritiske punktet tørkeapparatet som er vist fra (A) foran, og (B) tilbake med overføring båten og apparat dør er vist ved siden av baksiden av anordningen..
Figur 2: Papp plattform montert papp plattform for å holde en aerogel i veien for et instrument stang..
Figur 3: Nitrogenoksid sensing oppsett nitrogenoksid sensing oppsett er vist inkludert (A) avtrekksskap vedlagte 10% nitrogenoksid., 90% nitrogen sylinder, rør og T-ventil, og (B) kyvetten med innsatte nåler.
Figur 4:.. Prøve cyt c -SiO 2 aerogeler aerogeler innkapsling av 15 uM cyt c i 4,4 mM, 40 mM og 70 mM kaliumfosfatbuffer er vist i forhold til en krone fra venstre til høyre.. Disse aerogels er ca 0,2-0,5 cm høy. Gjengitt med tillatelse 9.
Fig. 5: Cyt c -SiO 2 aerogel-spektroskopi synlige spektra av 15 pM cytokrom c i (a) 50 mM fosfatbuffer sol.ution; (B) Au (5 nm) ~ cyt c -SiO 2 aerogel.; (C) cyt c -SiO 2 aerogel (eksponert for luft.); (D) cyt c. -SiO 2-aerogel (utsatt for nitrogenoksid for 3,5 min). Disse representative spektra for hver type gel er forskjøvet for klarhet, og den stiplede linje angir stillingen av Soret toppen av cyt. C i buffer. Mens hvert spektrum er fra 15 uM cyt. C, gel tykkelser (eller høydene) er bare 0,2-0,5 cm sammenlignet med en-oppløsning cm cuvet resulterer i en høyere oppløsning absorbans. Gjengitt med tillatelse 9.
Figur 6: Aerogel spektroskopi som innkapslet bufferkonsentrasjon varieres Gjennomsnittet av UV-synlige spektrale absorbans av aerogeler dividert med gel-banelengde for geler som innkapsler 15 _.6; M cyt c i 70 mM (sort) (gjennomsnitt av 4-spektra), 40 mM (rød, prikket) (gjennomsnitt av 8-spektra), og 4,4 mM (grønn, stiplet) (gjennomsnitt av 9-spektra) kaliumfosfatbuffer. . Gjengitt med tillatelse 9.
Figur 7:... Aerogel sirkulærdikroismeanalyse spek sirkulærdikroismeanalyse spektra av cyt c i natriumfosfat bufret løsning (fast), to representative spektra av cyt c -SiO 2 aerogels (stiplet), og to representative spektra av Au (5 nm) ~ cyt. c SiO 2 aerogels (stiplet). Gjengitt med tillatelse 9.
Figur 8: Nitrogenoksid deteksjon med cyt c -SiO to. . sub> aerogels Overvåking av shift (Aa = A 414 nm - A 408 nm). i Soret intensiteten av cyt c (lyser rødt) og Au ~ cyt c (stiplet blå) innkapslet i SiOs to sammensatte aerogel nanoarchitectures som gasstrømmen. er slått mellom nitrogen (hvor Soret toppmaksimum er på ~ 408 nm) og nitrogenoksid (der Soret toppmaksimum er på ~ 414 nm). Hver kurve er et gjennomsnitt av 3-4 forsøk, med to av cyt c -SiO 2 forsøk overvåket ved Aa = A 414 nm -. A 407 nm etter at den opprinnelige Soret toppmaksimum ved 407 nm var for disse studiene. Gjengitt med tillatelse 9.
Figur 9:. Effekt av superkritisk væske utgivelsen tidsgjennomsnittede UV-synlig spektral absorbans dividert med gel banelengde for cyt c -SiO 2 aerogels enca.psulating 10 uM cyt. c i 50 mM fosfatbuffer der superkritisk tørkede aerogel ble fremstilt ved enten å slippe superkritisk karbondioksyd i løpet av 45 min (fast, sort (gjennomsnitt av 9-spektra)) eller 7 min (stiplet, rød (gjennomsnitt av fire spektra)). Gjengitt med tillatelse 9.
Discussion
Som beskrevet, er denne fremgangsmåten konsekvent produsert levedyktig cyt. C innkapslet i aerogeler. Konsentrasjonen av cyt. C i løpet av de aerogeler kan varieres fra 5 til 15 uM og bufferkonsentrasjonen av den første cyt. C løsningen innkapslet innenfor aerogeler kan varieres 4,4 til 70 mM fosfat uten alvorlige skadelige virkninger på protein levedyktighet. Imidlertid topp senter og toppbredden av den karakteristiske cyt c. Soret topp i aerogeler kommer nærmest hva de er for cyt c. I oppløsning når cyt. C er innkapslet i aerogeler fra oppløsninger av 40 mM buffer 9.
Syntesen av cyt. C -SiO 2 aerogels påvirkes av alder på noen av de som starter reagenser. Metanol, tetrametoksysilan, og ammoniumhydroksidløsning er alle hygroskopisk og bør skiftes ut hver en-til-to måneder. Den økte vann som bygger seg opp idisse reagensene over tid påvirker gel strukturelle egenskaper og den sol-til-gel overgangstiden.
Når du utfører superkritisk tørking, kan det kritiske punktet tørkeapparat overførings båt holde opp til atten 0,5 cm tykke, 1 cm diameter gels. Som beskrevet i protokollen delen, bør en bestemt fylling og tømming prosedyre følges for å overføre karbondioksid i sol-geler. Det er viktig å merke seg at ved begynnelsen av den drenering protokollen, drenering blanding av karbondioksyd og aceton strømmer ved en slik høy hastighet at tapperøret fryser stiv med fuktighet kondenserer til is på utsiden. Blandingen drenering ut inneholder litt vann siden aceton er ikke vannfri og dette vannet kan tidvis fryse i et omfang som dreneringsrøret faktisk tresko. Det er nødvendig å se etter slike tresko og for å lytte etter en stans av flyt. Avløpsventilen skal være stengt for et par min så tette vil smelte hvis en tresko er oppdaget. Iworst case, hvis avløpsventilen ikke er stengt, kan en tresko føre til så mye press for å bygge opp at avløpsrøret hardt spretter av apparatet. Etter de første dreneringsperioder, vil mesteparten av acetonet er blitt skyllet ut av apparatet, og forekomst av våt is biter vil avta dramatisk. Utladningen vil gradvis ligne tørris som tømme- protokollen fortsetter med eventuelle gjenværende tegn på nærvær aceton (eksempel duft) bli detekterbar ved slutten av dreneringen prosessen.
Etter at karbondioksyd i anordningen har gått fra væske til superkritisk fluid og lufteprosessen har begynt, er det nødvendig å frigjøre fluidet ved en langsom hastighet i løpet av minst 45 min som angitt i prosedyren 9. En høyere frigjøringshastighet kan redusere levedyktighet av cyt. C (som vist i figur 9) innenfor aerogeler og aerogeler selv kan faktisk bryte fra hverandre som the væske skynder seg å flykte fra gels. Generelt, selv når aerogeler forblir intakt etter åpning av anordningen døren, er det viktig å behandle dem forsiktig og forsiktig som de er sprø og kan lett brekke.
Kontroll silikageler som er strømmet langs cyt. C -SiO 2-geler anvendes etter overkritiske tørkingen for å bestemme om karbondioksyd overføringen inn i de geler var vellykket. Noen ganger cyt. C -SiO 2 gels kan vises overskyet og det er viktig å finne ut om dette er på grunn av ufullstendig løsemiddel overføring eller om det kan ha å gjøre med konsentrasjonen av cyt. C eller buffer innkapslet innenfor gels. Dersom silikageler uten cyt. C synes å ha en homogen, gjennomskinnelig utseende hele, kan dette tas som bevis på at oppløsningsmidlet overføring inntraff fullstendig selv om cyt c. -SiO 2-geler ha en viss uklarhet til dem. Uklarhet innenfor silikageleruten cyt. c etter tørking indikerer at noen aceton forble innenfor gels under lufting.
Som angitt i protokollen delen, viktige sikkerhetsregler må tas når du arbeider med nitrogenoksid (NO). For å detektere NO hjelp av aerogeler, er det nødvendig å forsegle kyvetten meget godt og for å slippe ut gassen som strømmer gjennom aerogeler inn i en avtrekkshette. Alternativt kan hele spektrofotometer bli flyttet inn i et avtrekksskap sammen med NO gassflasken som en ekstra forholdsregel å begrense eksponering for NO gass. Ved kontakt med luft NO vil umiddelbart frembringe den meget giftige nitrogendioksyd, dinitrogentetraoksid eller begge deler. INGEN kan også reagere med vann for å produsere varme og etsende gasser. Derfor kan vedvarende eksponering til NO resultere i direkte vevstoksisitet.
Ved bruk av cyt. C -SiO 2 aerogeler for å påvise tilstedeværelse av nitrogenoksid, vil Soret båndet i utgangspunktet være på ~ 408 nm og vil skiftetil ~ 414 nm i nærvær av nitrogenoksyd. Etter at du bytter tilbake til nitrogen, bør Soret bandet reversere tilbake til å være sentrert på ~ 408 nm. Det kan også være mulig å benytte den cyt. C -SiO 2 aerogeler for å detektere nærværet av andre ligander slik som karbonmonoksid 27.
Forskjellige publiserte prosedyrer inkluderer en ekstra trinn å kombinere gull eller sølvnanopartikler med cyt. C i løsning før blanding med solen og superkritisk tørking for dannelse av aerogeler 4-8. Sammenligning av UV-synlig spektroskopi av cyt. C innkapslet i aerogeler med metall nanopartikler til det i cyt. C innkapslet i aerogeler uten metallnanopartikler viser at disse to typer av innkapslingsteknikker produsere cyt. C av samme levedyktighet i løpet av de aerogeler (figur 5) . Imidlertid cyt. C innkapslet med metallnanopartikler er noe mer stabil enn cyt. C innkapsled uten metall nanopartikler innenfor aerogels 9. CD-spektrene for begge typer av cyt. C aerogeler er også lik, selv om begge er forskjellig fra spekteret for cyt c. I buffer som indikerer noen utfolding av cyt. C innenfor aerogeler (figur 7). Tidligere rapporter om cyt. C innkapslet i aerogeler tyder på at sirkulærdikroisme spektroskopi er sannsynligvis å vurdere det ytterste laget av protein, utfoldet ved kontakt med silikagel, i enten metall nanopartikkel-kjernedannelse flerlags cyt. C konstruksjoner eller løst organiserte strukturer som danner når ingen metallnanopartikler er tilstede i aerogels 4,9. Størstedelen av cyt c. Innenfor en av typene av selvorganisert struktur inne i aerogeler forblir foldet som målt ved hjelp av UV-synlig spektroskopi skjønt. Fordelen med den protokoll som er beskrevet heri sans nanopartikler er så dyre kjøp eller tidkrevende syntese av metallnanopartikler er ikke nødvendig. Proteiner er ikke ofte blitt innkapslet i aerogeler, og slik at denne fremgangsmåten er viktig ved at den kan føre til utvikling av en mer generell metode for innkapsling av andre proteiner i aerogeler med potensiell betydning for fremtidige Bioanalytical enheter.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Støtte for dette arbeidet og / eller offentliggjøring ble gitt av Science Institute of Fairfield University College of Arts and Sciences, Fairfield universitetets fakultet Forskning Grant, en Cottrell College Science Award fra Research Corporation for Science Advancement, Fairfield University College of Arts & Sciences og Fairfield University Chemistry & biokjemi avdeling. Vi erkjenner takknemlig Jean Marie Wallace for mye nyttig innsikt og råd i forhold til denne generelle forskningsområdet. I tillegg utvider vi en helt spesiell takk til alle tidligere, nåværende og fremtidige undervisning forskere av Harper-Leatherman Research Lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
| Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
| pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
| Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
| Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
| Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
| Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 ml |
| Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
| Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0%-30.0% |
| General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor |
| generic plastic wrap | various | ||
| Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 ml syringe | |
| Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
| Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
| Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
| Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
| Micrometer | Central Tool Company | ||
| GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
| Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
| 10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
| Tygon tubing | various | ||
| T-switch valve | various | ||
| syringe needles | various |
References
- Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
- Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
- Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
- Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
- Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
- Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
- US Patent. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
- Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
- Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
- Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
- Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
- Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
- Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
- Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
- Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
- Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
- Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
- Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
- Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
- Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
- Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
- Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
- Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
- Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
- Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
- Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
- Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
- Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
- Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
- Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
- Margoliash, E., Frohwirt, N.
