Summary
この手順は、シリカにシトクロムc（CYT。c）をカプセル化する方法を説明し（SiO 2）でゾル-ゲルプロセスこれらのゲルはbioaerogelsを形成し、急速気相反応により一酸化窒素（NO）を認識するために、これらのbioaerogelsを使用します。このタイプのプロトコルは、バイオセンサーまたは他の生体分析機器の将来の発展を助けることができます。
Abstract
官能性化合物は、エアロゲル内にカプセル化されたときに、センサ、電池、燃料電池などのアプリケーションは、非常に多孔性のエアロゲルを使用することによって改善されています。しかし、エアロゲルを形成するために処理されているゾル - ゲル内のタンパク質をカプセル化するには、いくつかの報告が存在します。超臨界酸化窒素（NO）は、気相活性を有するbioaerogelsを形成するために処理されるシリカ（SiO 2）ゾル-ゲルにシトクロムc（CYT。C）をカプセル化するための手順が示されています。 CYT。Cは制御タンパク質濃度で混合シリカゾルに加え、強度条件をバッファリングします。ゾル混合物をゲル化し、ゲルの孔に充填された液体は、液体二酸化炭素と溶媒交換の一連の置換されています。二酸化炭素は、その臨界点にし、CYTで乾燥エアロゲルを形成するためにオフに排出される。cは内部に封入されました。これらのbioaerogelsは、紫外可視分光ANと特徴付けられますD円偏光二色性分光法及び気相酸化窒素の存在を検出することができます。この方法の成功はCYT。C濃度と緩衝液濃度を調整するに依存し、このような金属ナノ粒子のような他の成分を必要としません。潜在的な将来の生物分析機器開発のための重要なこの手順を行う同様のアプローチを使用して、他のタンパク質をカプセル化することが可能です。
Introduction
シトクロムc（CYT。c）は、身体の細胞呼吸の反応に関与する重要な電子伝達タンパク質です。細胞死の制御された形態、アポトーシスに関与することが示されており、それは、一酸化窒素及び一酸化炭素1-3のような小さな毒性分子を検出することができます。一酸化窒素（NO）は、神経、心血管系で起こる生理学的過程、および免疫系の様々な役割を果たしています。 CYTは。Cは、一般的に、構造的に無傷でアクティブなままにしたpH中性の値に緩衝水性環境が必要ですが、研究はそのCYTを示している。cは一定の条件4-9の下でエアロゲルとして知られている固体材料で、その構造と機能を保持することができます。
エアロゲルは、多くの場合、金属酸化物エアロゲルは非常に一般的であるが、炭素およびエアロゲルの他のタイプの合成された（ゾル - ゲル金属酸化物を合成することによって形成された高度に多孔質の材料である。一例では、InPのAERありますogels）10と多孔質固体マトリックスは11-14変更されないような方法でこれらのゾル-ゲルを乾燥させます。固体エアロゲルの細孔の全てが表面反応が重要である任意のアプリケーションのためのエアロゲルは、非常に有用にする多くの利用可能な表面積になります。化学的または生化学的機能がエアロゲルナノアーキテクチャ内で組み立てられる場合には、エーロゲルの物理的な多孔度および表面増強領域は、センサ、並びに電池用電極、燃料電池、及びスーパーキャパシタアプリケーション11,15-23を改善するのに役立つことが示されています。不変の多孔質固体マトリックスを残すようにエアロゲルを乾燥させるためには、超臨界溶媒抽出を介して、ゾル - ゲル合成後の細孔中に残存溶媒を除去することが典型的です。ゲルからの溶媒が蒸発するように表面張力によって生じ得る任意の孔の崩壊が原因超臨界乾燥、液体 - 蒸気界面は決して形で最小化されます。
24-30乾燥させたゾル-ゲル中にカプセル化されているcは 。その後、エアロゲルが原因で多くのタンパク質の構造に損害を与える恐れがあります必要な処理に稀です形成するために超臨界乾燥させて、ゾル - ゲル中の生体分子をカプセル化するレポート。 CYT。Cの場合には、一定の条件により、検出およびエーロゲルの中に気相窒素酸化物に反応するのCYT。C能力を保持することを可能にします。一度エアロゲルで安定化、エアロゲルの高品質な細孔構造はCYT。cおよび一酸化窒素4,8,9との間の反応を促進します。 CYT。cが最初のソリューション4-8に金または銀ナノ粒子の周囲に複数の層でそれを関連付けることにより、エアロゲル内にカプセル化することができます。これらの多層超構造は、エアロゲルマトリックス内にタンパク質を保護するのに役立ちます。最新approacでタンパク質濃度およびバッファー強度が他の合成条件と一緒に制御されている我々が開発している時間は、CYT。cがあっても、金属ナノ粒子の初期の関連付け9なしエアロゲル内の整合性を保持しています。
合成は、多くのエアロゲル合成は、一定期間のためのシリカゾルゲル前駆体を混合することにより開始し始めます。これは、cは 、混合物中に緩衝溶液として添加することがCYT。混合時間セットした後です。ゲルはその後細孔が水、メタノール、残りの反応物及び副生成物で充填された多孔質シリカ固体構造を形成するために起こります。毛穴を埋めるこの液体は、溶媒交換の一連の様々な溶媒を用いてすすぐことができ、液体二酸化炭素は、臨界点乾燥装置内で行わとの最後の交流が低温に保ちました。二酸化炭素の臨界温度（31.1℃）より上のゲルをもたらすことなどの形成を促進します乾燥し、高度に多孔性エアロゲルを形成するために排出することができ、加圧装置内upercritical流体。それが変性可能性がある温度以下にタンパク質を保持するための超臨界流体を形成するために、二酸化炭素のために必要な比較的低い温度が他の溶媒に比べて有利です。
それは、他のタンパク質をカプセル化するための、より一般的に適用可能なプロトコルの開発につながる可能性があり、簡単な手順であるため、エアロゲルにCYT。Cをカプセル化する当社の金属ナノ粒子を含まないアプローチが有利で す。多くのタンパク質は、CYT同じように金属ナノ粒子と相互作用しないことがあります。cが行い、金属ナノ粒子の合成または購入手続きに追加の時間と費用を追加します。エアロゲル中のタンパク質をカプセル化するには、いくつかの報告は私を助けることができるエアロゲル中の他のタンパク質をカプセル化するための、より一般的な手順を見つけるための重要な一歩は、この手順の開発を行いますnは潜在的な将来の生体分析装置。
この原稿のプロトコルセクションでは、シリカのゾル-ゲルを合成し、これらのゾル-ゲルにCYT。Cをカプセル化し 、エアロゲルを形成するために、これらの複合ゾル-ゲルを乾燥、紫外可視および円偏光二色性分光法を使用して、これらのbioaerogelsを特徴付け、存在を検出する方法について説明しますこれらbioaerogelsと気相酸化窒素の。第一リン酸緩衝液の4.4 mMの70の水溶液中に溶解した場合CYT。cが正常エアロゲル中に封入されています。しかし、エアロゲルで最適化されたタンパク質の構造は、CYTの40mMのリン酸緩衝液を封入する際に生じることが判明した。ロードされたエアロゲルCYTを生産Cは 5~9μM〜15の範囲のC濃度 。したがって、下記のプロトコルは、CYTの40mMのリン酸緩衝液を使用してエアロゲルを合成することである。ロードされたcytその結果、C。C濃度15μMのエアロゲルインチ</ P>
Protocol
安全メガネまたはゴーグル、実験室コート、実験用手袋は、手順の間に常に着用します。安全メガネまたはゴーグルなしで臨界点乾燥装置を操作しないでください。テトラメトキシシラン、メタノール、エタノール、アセトン、及びアンモニアを含有する全ての溶液をドラフト内で処理されるべきです。
1.バッファとCYTしてください。Cソリューション
- 、pH7の40 mMリン酸カリウム緩衝液〜750 mlとするために、第一リン酸二水素カリウム2.72gのを秤量500 mlの容量フラスコを用いて水に溶解して0.04 Mリン酸二水素カリウムを500mlを調製します。
- リン酸カリウム二塩基性の3.48グラムを秤量し、500ミリリットルのメスフラスコを用いて水に溶解して0.04 Mリン酸カリウム二塩基性の500ミリリットルを準備します。
- 攪拌棒を備えた大型のビーカーに二塩基性塩溶液を注ぎ、撹拌プレート上の溶液を攪拌し始めます。
- ゆっくりと一塩基性塩秒の部分を追加します。pHが7.00になるまでpH電極とメーターでpHをモニターしながら二塩基性塩溶液にolution。一塩基性塩溶液の約250-300 mlを使用します。
- ガラスシンチレーションバイアル中でCYT。c及び場所の約0.023グラムを量り分けます。マイクロピペットを用いて調製されたリン酸カリウム緩衝液2000μlを添加し、その後緩やかに固体、赤のcytのすべてになるまで混合するためのソリューションを渦巻く。cが溶液中に溶解しており、無粒子状物質が残っています。
- 用意したcyt。C溶液 20μlを取り、1cmの経路長のプラスチックキュベットに追加します。準備されたバッファーの3ミリリットルを追加します。
- 参照セル内のバッファを使用して、300〜700 nmのからのUV-VISスペクトルを取ります。 CYTを使用してください。C吸光度濃度（c）を決定するために、409 nmの（A）、106100 M -1 cm -1 で 、キュベットの経路長（L）、およびランベルト・ベールの法則の吸光係数31（ε）溶液（A =εLC）の。
- 元調製した溶液の濃度を計算します。 2ミリリットルを調製CYT。C溶液は、mMの0.9から0.7の間の濃度であるのが典型的です。
- シンチレーションバイアルに0.72 mMの準備のcyt。C溶液の117μLをピペットで0.105 mMの800μlの元の準備のcyt。C溶液を希釈します。その後、準備されたバッファー800μlの（この場合は683μl）をのバランスを追加します。混合する渦巻。正確なボリュームは、元の準備のcytの正確な濃度に依存して変化する。チトクロームのボリュームとしてC溶液を。ピペットを（800μlの* 0.105 mM）のように計算されるC /（オリジナルCYT。mMの中のC濃度）。
- オリジナルの準備および希釈CYTを格納します。Cソリューションを2-8℃の冷蔵庫で2週間まで使用する準備ができるまで。
2.合成シリカ（SiO 2）ソル
- 使い捨ての50ミリリットルのポリプロピレンビーカーにラベルを付ける」してアーカーA '。化学天秤の皿の上にビーカーを置き、ビーカーに1.88グラムのテトラメトキシシランを追加するためにガラスパスツールピペットを使用しています。ゼロバランスと「ビーカーA 'にメタノール2.88グラムをピペット。
- パラフィルムでカバー「ビーカーA '。
- 使い捨ての50ミリリットルのポリプロピレンビーカー「ビーカーB 'をラベルを付けます。化学天秤の皿の上に磁気攪拌棒と場所を追加します。 0.75グラムの水および3.00グラムのメタノールを追加するためにガラスピペットを使用してください。
- パラフィルムでカバー「ビーカーB '。
- その後、攪拌しながら混合物にカバーし、パラフィルムを介して28.0から30.0パーセントの水酸化アンモニウム溶液5μlを挿入するために注射器を使用し、ヒュームフード内部の撹拌プレート上で「ビーカーB 'の内容物を攪拌し始めます。
- すぐにステップ2.5が完了すると、「ビーカーB 'に'ビーカーA」の内容を追加します。パラフィルムでカバーしながら20分間、混合液を撹拌しました。
3.ジェル金型を準備します
注：ありシリカゾルの混合物は、ステップ2.6で撹拌しながら、ゲル型を準備する時間です。
- 8-9ポリプロピレンシンチレーションバイアル（オフスライスした底部とのx 57ミリメートル16ミリメートル、ボリュームサイズ6.5ミリリットル、）とそれに対応するキャップを獲得。ゲルは上の形成と、それはプラスチック製のラップはキャップの内側そのままとどまることを確認することの上にキャップを配置するための平坦な表面を作成するために、バイアルのキャップ端部の上にラップを入れてください。
- 作業台の上にキャップエンドとバイアルを上下線と上を向いて底を開きました。
4. CYTを準備します。C -シリカゾル-ゲル
- （ステップ2.6）を混合ゾルが完了すると、きれいな使い捨ての50ミリリットルのポリプロピレンビーカーにゾル混合物の3ミリリットルを追加します。
- ゆっくりと0.105 mMの希釈CYT。〜1分かけて3ミリリットルゾル混合物にC溶液（ステップ1.9で行われた）の500μLをドロップするようにガラスパスツールピペットを使用してください。 CYTを加えながら静かに混合物を旋回するようにしてください。cが大の形成を回避するために、赤い塊。 0.105ミリモルのチトクローム500μlの希釈することにより、ボリュームが添加されていると仮定。3500μLにC溶液を、ゾル中になりましたcyt。C濃度は、理論的には、15μMです。
- ピペットで各準備金型内に生じたCYT。Cシリカゾルの0.5ミリリットル。また、超臨界乾燥工程中に、対照試料として使用するために、1つまたは2つの金型に残った「プレーン」シリカゾルを0.5mlをピペット。
- （〜2〜8℃）で一晩またはゾル - ゲルを生成するために、少なくとも12時間、パラフィルムで金型のフェイスアップ開口部を覆い、冷蔵庫に入れて。
- 冷蔵庫から出し金型を取ります。 CYTを含む1の金型の上からパラフィルムを外しCゾルゲル。また、底部からキャップ、プラスチックのラップを取り外します。
- 金型内に洗浄瓶からいくつかのエタノールを添加した後、慎重に金型のうち、きれいな20mlガラスシンチレーションバイアルの続きにゲルをプッシュするシリンジプランジャの円形ディスクの端を使用エタノールの約5ミリリットルをaining。
- CYTの全てまで、このゲルを除去手順（4.5および4.6ステップ）を繰り返す。Cゲルをバイアルに添加し、シリカゲルの全てを別のバイアルに添加します。 CYT。Cゲルの複数の濃度がなされた場合は、別々のバイアル内で一緒にゲルのように保管してください。その後、2〜8℃の間のエタノール、キャップや店舗でトップにバイアルを埋めます。
- 一日を通して4時間ごとに、冷蔵庫からゲルを削除ゲルからエタノールをデカントし、新鮮なエタノールと交換します。
- 追加の3日間、一日三回をデカントし、新鮮なアセトンを追加し、アセトンで湿ったゾルゲルを水没。
5.超臨界乾燥CYT。C -シリカゾル-ゲル
- 8℃に取り付けられたサーキュレータの温度を設定することにより、10°Cに臨界点乾燥装置（ 図1参照 ） を冷却します。
- 装置は、rを持っていたら、10°Cをeached、アセトンで転送ボートを充填し、装置の内部でそれを密封することにより装置上のリークテストを実行します。
- 装置の充填弁を開き、装置が半満杯になるまで二酸化炭素を追加します。
- 充填弁を閉じ、Oリングやシールが悪化することができるドアやバルブでヒスノイズのために注意深く耳を傾けます。
- 漏れが見つかった場合に任意のOリングやシールを交換してください。
- リークテストを完了した後、ドラフトのドレインにアセトン及び二酸化炭素を放出する排出弁を開きます。その後、装置から転送ボートを削除します。
- 装置は、漏れがないことを確認した後、慎重に転送ボートの三長いセクション（検体バスケットやガーゼカバーは必要ありません）に、大部分のアセトンと一緒に、シンチレーションバイアルからの湿ったゲルを注ぎます。微妙にプッシュし、すべてのゲルが完全に私が水没していることを確認するためにピンセットでボート内でゲルを動かしますn個のアセトン。装置の内部にボートを密封する前に、必要に応じてより多くのアセトンを追加します。
- その後、二酸化炭素を追加するとすぐに二酸化炭素と混合し、アセトンを装置の窓から装置の底に沈むことが観察されるように5分間アセトンを解放するために、排水弁を開くために、装置の充填弁を開きます。装置が完全に二酸化炭素が充填されているので、ドレインが開いている間に装置があっても記入していきますように、充填弁が排水中に必要な範囲で開いたままにする必要があります前に、下にアセトンをこの染み出しが発生します。
- 排水バルブを閉じます。充填弁が少し開いて割れておいてください。
- 5分後、再び5分間排水バルブを開き、装置が完全なままであるように全体の排水時に十分に開放する充填弁を調整します。この排水ステップ1より多くの時間5を繰り返した後、充填弁が開いて割れておく、排水バルブを閉じます分後。
- これらの最初の3排水ステップに続いて、ゲル内の液体二酸化炭素によってアセトンの完全な交換を確実にするために、少なくとも6時間のスパンで約時ごとに40分を5分間ドレンを開きます。常に装置内の液面が排水中にボートの上を下回ったことがないように、各排水中に十分に開放する充填弁を調整します。
- いったん排水の手順が完了し、レベルは装置の窓を通して見ることによってだけでボートに乗って突起の上に表示されたままとなるよう充填弁を閉じ、液体二酸化炭素を排出します。
- 確実にするために40°Cに取り付けられた装置サーキュレータの温度を設定することをその臨界温度及び圧力より液体二酸化炭素が上昇（TはC = 31°C、PのC = 7.4 MPaで）。
- 約15分後、液体meniscの装置の窓を通して超臨界流体への液体の移行を観察しますボートのプロング上記の私たちが消えます。平衡時間の少なくとも15分、その後、超臨界流体を放出するために開始する通気弁を少量開く許可します。
- 約45分かけて、インクリメンタル広いベント弁を開放し続け、より広くなるように流体を放出するの着実な、しかし非常に低いヒスを聞くことができ、圧力ゲージがゆっくりとゼロに減少することが観察されます。
- 装置の圧力がゼロになった後は、装置の扉を開くボートを削除し、清潔なガラスシンチレーションバイアル中で、新たに乾燥エアロゲルを配置するために鉗子を使用しています。
6.特徴付けCYT。C -シリカUV可視および円偏光二色性（CD）とのエアロゲル分光
- 紫外可視分光光度計またはCD分光計のビーム経路にエアロゲルモノリスを保持するために段ボールプラットフォームを準備します。
- そのようなラボの箱から段ボールとして（軽量段ボール2.5cmの×2.5センチメートル片を切り取りratory組織）、当時、切断することによって作成された2つのフラップを、倍、倍に途中でカットアップ、半分に折ります。
- ミドルさ1.5cm×1.5平方cmの穴で、軽量段ボールの5センチメートル×5センチの部分を切り取ります。その後、0.5センチメートル×0.5 cmのホールドのサイズを小さくするために黒い絶縁テープを使用します。
- 小さ な曲がった表面はエアロゲルモノリスのために作成されるように、段ボールの5センチメートル×5センチピースに対して折り畳まれ、カット段ボールのフラップが0.5センチメートル×0.5センチメートルの穴の正面に座るためのテープ（ 図2を参照します） 。穴がビーム経路に沿ったものであるので、次に、紫外可視分光光度計に段ボールの背面部分をテープで固定します。
- マイクロメータを用いて、経路長のために使用されるゲルの厚さを測定します。
- 段ボールのプラットフォーム上で1つのゲルを配置し、紫外可視分光光度計の参照コンパートメント内の空気と300から800ナノメートルからスペクトルを測定します。
- 多項式を取り付け、A = A λnは 、吸光度（A）は、バックグラウンド散乱が主な原因である波長（λ）領域、〜700〜800 nmまで。係数は〜1×10の間、通常、数に適合している8と1×10 6とn係数は、一般的に〜2と3の間の数に適合しています。
- 係数を用いて、他の波長での散乱を計算し、A及びnは 、フィットから得られます。
- 散布補正スペクトルを得るために、生のスペクトルから、この計算された散乱バックグラウンドの吸光度を減算します。
- 散布は、ピーク高さ、ピーク中心、及びエアロゲルのソーレーピークのピーク幅を決定するために、適切なソフトウェア（GRAMS / AI 8.0）を用いて、370〜490ナノメートルの領域にガウス曲線でスペクトルを差し引いフィット。
- 、経路長（L）は106100 Mの吸光係数31（ε）をゲルの測定厚さを使用して、ランベルト・ベール法則を適用-1 cm -1 で cyt。Cの濃度（c）を計算します。
- 計算されたCYTを比較してください。C濃度を濃度に理論的にはゲル（15μM）にエアロゲル内のcyt。Cの生存能力を確認します。典型的なパーセント生存率は100％に近いが、これらの生存率は計算がCYTの吸光係数よりもわずかに異なると推定されるソリューション31中のcyt。Cの吸光係数に基づいているためだけでは推定していることに留意すべきです。知られていないエアロゲルにおけるc。
- 上のランプをオンにする前に少なくとも5分のCD楽器に窒素を実行します。
- 穴がビーム経路に沿ったものであるので、CD分析計に段ボールホルダーをテープで固定します。
- 3回のスキャンの平均を取って、100 nmの/ minで350〜500ナノメートルから段ボールホルダーに何もないとの連続波長のブランクスペクトルを測定します。
- 段ボールのプラットフォーム上で1つのゲル（以前にステップ6.2で測定された厚さ）を配置し、3回のスキャンの平均を取って、100 nmの/ minで350〜500ナノメートルからスペクトルを測定します。
- 関心のあるすべてのエアロゲルモノリスのための紫外可視およびCD測定を繰り返します。
7. CYTで一酸化窒素の存在（NO）ガスを検出します。C -シリカエアロゲル
注意：NOでの作業は危険であり、すべてのNOガスは、ヒュームフードにドラフト内で取り扱うないか、排出されるべきです。 NOへの持続的な曝露は、NOが空気に接触したときに形成されるように非常に有毒な二酸化窒素および/または四酸化二窒素の組織に対して毒性です。 NOは、水と接触すると、熱及び腐食性のフュームも生成されます。
- よく換気ドラフト内で8 L一酸化窒素シリンダー（10％一酸化窒素、90％の窒素）を配置し、4 psiのに圧力を調整します。
- 一酸化窒素シリンダーの両方に6 PSに設定さ窒素ボンベ（圧力にチューブを接続しますi）およびT-バルブにチューブの端部をリンクアップ（ 図3a参照 ）。
- 実験用のエアロゲルモノリスを選択し、マイクロメーターで厚さ（またはパスの長さ）を測定。
- プラスチック製のキャップを使い捨てキュベットにエアロゲル（〜3mm厚）を配置し、分光光度計にキュベットを置きます。キュベットに収まるように、必要に応じて少しエアロゲルをカットします。
- キュベットのプラスチックキャップ、T-バルブの出力に接続された1つ、およびヒュームフードに排気として機能するチューブに接続された1つ（ 図3bを参照）に2注射針を挿入します。チューブとキュベットにキャップに針をシールするためにパラフィルムを使用してください。
- 基準セルに空の使い捨てキュベットを置きます。
- エアロゲルは、実験前を開始するビーム経路にあることを確認するために、エアロゲルのキュベット位置を調整します。
- 800〜300nmの初期スペクトルを取ります。
- 4での吸光度の差を監視します14 nmおよび408 nmでの吸光度を確認し、その時間がないで、窒素または一酸化窒素/窒素混合物の流量は非常に高いことを行う設定時間間隔で窒素及び一酸化窒素/窒素混合物の間で切り替えるためにT-バルブを回しながらエアロゲルは、キュベット中で動き回ります。
- 露光サイクルが終了したら、800〜300nmの最終的なスペクトルを取ります。
- 平均センシング応答を得るために3〜4モノリスを使用して手順を繰り返します。
Representative Results
実行可能なCYT。Cを含むエアロゲルで説明する手順をもたらします。導入の最後に指定されているように、CYT。cが 4.4から70 mMのリン酸の範囲で緩衝水溶液からカプセル化することができます。 CYTの例。C -シリカ（CYT。C -SiO 2）異なる緩衝液濃度を含有する溶液から製造されたエアロゲルは、 図4に示されている。70ミリモルから製造されたゲルは最も不透明なバッファを用いてすべてのゲルは、比較的半透明です。
CYTの分光法との比較。異なる条件の下でcは 、図5に示されている。典型的なスペクトル（ 図5c）が 2エアロゲルC -SiO。CYTための408 nmの周りに大きなソーレーピークを示し、チトクロームのスペクトルに非常に類似しています溶液中。C（ 図5a）。また、CYTのスペクトル。金属ナノ粒子がエーロゲルの中にカプセル化されたCは 、（ 図5b）とCYTが示されている。C -SiO 2エアロゲルスペクトルは、同様に、このスペクトルに類似しています。 CYT。C -SiO 2エアロゲルは窒素酸化物に暴露されると、ソーレーピークの典型的なシフトは、（ 図5d）で観察されています。
CYTから作られたゲルのためのUV-VISスペクトルを変化させる緩衝液濃度でのCソリューションは、 図6に示されている。これらのゲルのすべての特性UV-可視分光はCYT。cは 、ゲル内の変性状態にないことを示す特徴を示しています。しかし、これらのスペクトルのためのより低い信号対雑音比で70 mMの緩衝結果から作られたゲルの減少透光。
CYTのCDスペクトル。C -SiO 2エアロゲルはCYTのスペクトルに類似している。C CYT。Cのスペクトルと異なっているが、金属ナノ粒子を有するエアロゲル内に封入された （ 図7）。
図8は 、CYTのための典型的な酸化窒素監視応答を示している。C -SiO 2エアロゲルともCYT。Cに加えて、金属ナノ粒子を含んで対応するエアロゲル。 408 nmで414 nmでの吸光度との差が増大し、次いでゲルを連続してそれぞれ窒素を一酸化窒素に露出されたときに減少することが分かります。
超臨界二酸化炭素を十分に遅い速度、CYTの生存能力にリリースされていない場合。形成されたエアロゲル内のcが危険にさらされます。これは、異なる時に二酸化炭素を放出することによってゲルを形成した後、得られた紫外可視スペクトルを比較することによって明らかにされます料金（ 図9）。
図1：臨界点乾燥装置 （A）正面および（B）から示される臨界点乾燥装置背面次の装置の背面に示す伝達ボートおよび装置、ドア付き。
図2：ダンボールプラットフォーム楽器のビームの経路にエアロゲルを保持するための組み立てられた段ボールプラットフォーム。
図3：一酸化窒素感知セットアップ一酸化窒素感知セットアップは、（A）10％の一酸化窒素囲まドラフト含むように示されています。、90％窒素シリンダー、チューブ、およびT-バルブ、及び（B）に挿入針をキュベット。
図4：試料CYT C -SiO 2 エーロゲルは、15μMのCYTをカプセル化エアロゲルCを 4.4ミリメートル、40ミリメートル、70 mMのリン酸カリウム緩衝液中で左から右にダイムと比較して示されています。これらのエアロゲルは、約0.2から0.5 cmの高されています。許可9を得て転載。
図5：CYT C -SiO 2 エアロゲル分光法 （a）は、50 mMリン酸緩衝ゾル中の15μMのシトクロムcの可視スペクトル。ution; （b）の金（5-nm）の 〜のcyt C -SiO 2エアロゲル。 。（空気にさらさ）（c）のチトクロームC -SiO 2エアロゲル。 （d）に CYT。（3.5分間酸化窒素にさらさ）C -SiO 2エアロゲル。ゲルの各タイプのこれらの代表的なスペクトルは、明確にするためにオフセットされており、破線は、バッファ内のCYT。Cソーレーピークの位置を示します。各スペクトルは、15μMのcyt。cがあるが、ゲルの厚さ（または高さ）が高い溶液の吸光度が得られた1cmソリューションのキュベットに比べて唯一の0.2から0.5センチです。許可9を得て転載。
図6：カプセル化された緩衝液の濃度を変化させたとして、エアロゲル分光法 15 _をカプセル化するゲルについてゲルパスの長さで分割されたエアロゲルの平均化紫外可視分光吸光度。6; MのCYTは、70mMの（黒）（4スペクトルの平均）、40mMの（赤、点線）（8スペクトルの平均）、及び4.4 mMの（緑、破線）（9スペクトルの平均）、リン酸カリウム緩衝液中で、C。 。許可9を得て転載。
図7：。。。エアロゲル円偏光二色性分光法 （固体）、リン酸ナトリウム緩衝溶液中のチトクロームCの円偏光二色性スペクトル、チトクロームの2つの代表的なスペクトルC -SiO 2エアロゲル（破線）、及びAuの2つの代表的なスペクトル（5-nm）の 〜CYT。C SiO- 2エアロゲル（点線）。許可9を得て転載。
図8：CYTと一酸化窒素の検出 C -SiO 2。 エアロゲル （ΔAは414 nmで = - 408 nm）をシフトの監視。。。ガス流としてのSiO 2複合エアロゲルナノアーキテクチャにカプセル化のcytのソーレー強度でC（固体赤）とAu〜のチトクロームC（青点線） （ソーレーピーク最大値は〜414 nmである）、窒素（ソーレーピーク最大値は〜408 nmである）と一酸化窒素との間でトグルされます。各曲線は、チトクロームの2で、3-4回の平均値であるΔAで監視C -SiO 2試験では、414ナノメートル = - 。初期ソーレーピーク最大値は、これらの試験のための407 nmであったため、407 nmのを 。許可9を得て転載。
図9：超臨界流体の放出時間の影響 CYTためのゲル経路の長さで割った紫外可視分光吸光度を平均化C -SiO 2エアロゲルenca。50 mMの超臨界乾燥エアロゲルは45分（9スペクトルの固体、黒（平均））または7分（4の破線、赤（平均の上のいずれか解放する超臨界二酸化炭素によって作られたリン酸緩衝液中の10μMのCYTをpsulating。Cスペクトル））。許可9を得て転載。
Discussion
説明したように、この手順は、一貫して実行可能なCYTを生成した。エアロゲル内に封入Cはエアロゲル内CYT。Cの濃度は5〜15μMおよび4.4からのタンパク質の生存度に深刻な悪影響なしに70 mMのリン酸に変えることができるエアロゲル内に封入初期CYT。C溶液の緩衝液濃度から変化させることができます。しかし、ピーク中心と特性のcytのピーク幅。ソーレーピークCエアロゲルで、彼らはCYTためのものであるものに最も近い。溶液中のCのcyt。cが 40 mMのバッファ9の溶液からエアロゲル中にカプセル化されたとき。
CYTの合成。C -SiO 2エアロゲルは、出発試薬のいくつかの年齢によって影響されます。メタノール、テトラ、および水酸化アンモニウム溶液は、すべての吸湿性であり、すべて1対2ヶ月を交換する必要があります。中に蓄積増加した水時間をかけてこれらの試薬は、ゲル構造特性およびゾルからゲルへの遷移時間に影響を与えます。
超臨界乾燥を行う場合には、臨界点乾燥装置の転送ボートが厚い18 0.5センチメートル、直径1cmのゲルを保持することができます。プロトコルセクションで概説したように、特定の充填および排出手順は、ゾル - ゲルに二酸化炭素を転送するために従うべきです。排水プロトコルの開始時に、二酸化炭素とアセトンの排出液は、ドレインチューブは水分が外部に氷に凝縮と硬い凍結するような高速で流れることに留意することが重要です。アセトン、無水なく、この水は時折排水管が実際に詰まら程度にフリーズすることがあるため外排出混合物は、いくつかの水が含まれています。このような目詰まりを監視するために、フローの停止をリッスンする必要があります。詰まりが検出された場合、目詰まりが溶融するので、排水弁が数分間閉鎖されるべきです。に排水バルブが閉じていない場合は最悪のシナリオは、目詰まりはそんなに圧力が排水管が強制的に装置をオフにポップすることを構築することがあります。最初のいくつかのドレイン期間の後、アセトンの大部分は、装置の外に洗浄されています、と濡れた氷の塊の発生が大幅に減少します。排水プロトコルは（そのような香りなど）アセトンの存在の任意の残留証拠を継続するように、放電は次第に排水処理の終了により検出不能となってドライアイスのようになります。
装置内の二酸化炭素を超臨界流体への液体から移行したと通気プロセスが始まった後、手順9に示されるように、少なくとも45分間にわたってゆっくりとした速度で流体を放出することが必要です。リリースの高いレートは、チトクロームの生存率を減少させることができます。エアロゲルとエアロゲル自身内のcが （ 図9に示すように）実際に目のようにバラバラにすることができますE液をゲルから逃れるために突入します。彼らは脆く、簡単に破ることができるように一般的に、エアロゲルは、装置の扉を開いた後に無傷のまま場合でも、慎重に、静かにそれらを処理することが重要です。
CYTと一緒に注入する制御シリカゲル。C -SiO 2ゲルは、ゲルへの二酸化炭素の移動が成功したかどうかを決定するために超臨界乾燥の後に使用されます。時にはCYT。C -SiO 2ゲルは曇って見えることがあり、これは不完全な溶剤転送するか、CYTの濃度に関係しています。Cまたはゲル内に封入されたバッファリングすることができるかの原因であるかどうかは決定することが重要です。 CYTなしのシリカゲルが。全体に均質な、半透明の外観を有するように見えるcの場合、溶媒の転送が完全にたとえCYTを発生したこと、これが証拠として撮影することができます。C -SiO 2ゲルは、それらにいくつかの曇りを持っています。シリカゲル内雲量CYTずに乾燥後。cが 、いくつかのアセトンが通気中にゲルの内部に残っていることを示しています。
プロトコルセクションで示したように、一酸化窒素（NO）で作業するとき、重要な安全上の予防措置をとる必要があります。エアロゲルを用いてNOを検出するために、非常によく、キュベットを密閉し、ドラフト内にエアロゲル上を流れるガスを排出する必要があります。また、全体の分光光度計は、NOガスへの露出を制限するために追加の予防策として、NOガスシリンダーと一緒にヒュームフード内に移動させることができます。空気NOと接触するとすぐに非常に有毒な二酸化窒素、四酸化二窒素または両方を生成します。 NO、熱及び腐食性のフュームを生成するために水と反応することができます。したがって、NOへの持続的な曝露は、直接的な組織毒性をもたらす可能性があります。
CYTを使用する場合。C -SiO 2エアロゲルの一酸化窒素の存在を検出するために、ソーレー帯は、最初〜408 nmであろうと移行します一酸化窒素の存在下で〜414 nmまで。バック窒素に切り替えた後、ソーレー帯は〜408 nmの中心とされているに戻って逆必要があります。また、CYTを使用することも可能である。C -SiO 2エアロゲル、一酸化炭素27のような他のリガンドの存在を検出します。
異なる公開された方法は、従来のゾルと混合し、超臨界エアロゲル4-8を形成するために乾燥に溶液中のcyt。Cと金または銀ナノ粒子を合成する追加ステップを含みます。 CYTのUV-可視分光法を比較した。cは CYTのものと金属ナノ粒子とのエーロゲルの中にカプセル化金属ナノ粒子なしエーロゲルの中にカプセル化Cは、カプセル化技術のこれらの2つのタイプがCYTを生成することを示している。エアロゲル内の類似の生存率C（ 図5） 。しかし、金属ナノ粒子でカプセル化CYT。cが CYTよりわずかに安定である。Cの封入エアロゲル9内の金属ナノ粒子を含まないD。両方がいくつかのエアロゲル内のcyt。Cの展開を示すバッファ内のcyt。Cのスペクトル（ 図7）と異なるものの、CYT。Cエアロゲルの両方のタイプのCDスペクトルは、また類似しています。 CYT上の以前の報告。エアロゲル中にカプセル化さcは円偏光二色性分光法は、最も可能性の高いタンパク質の最外層を評価していることを示唆しているが、金属ナノ粒子核形成多層CYTいずれかの内、シリカゲルとの接触の際に展開するcの構造や形成緩く組織化構造いかなる金属ナノ粒子は、エアロゲル4.9に存在しない場合。しかし紫外可視分光法により測定されたエアロゲル内部に自己組織化構造のいずれかのタイプ内のcyt。Cの大部分は、折り畳まれたままになります。本明細書のSANナノ粒子を記載したプロトコルの利点は、高価な購入または金属の時間のかかる合成ナノ粒子は必要ありません。タンパク質は、多くの場合、正常にエアロゲル内にカプセル化されておらず、それが将来のバイオ分析装置のための潜在的な重要性を持つエアロゲル中の他のタンパク質をカプセル化するための、より一般的な方法の開発につながる可能性があり、その中にため、この手順は重要です。
Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作業および/または出版のサポートは、芸術と科学のフェアフィールド大学・カレッジの科学研究所、フェアフィールド大学の学部研究助成、科学振興のための研究・コーポレーションからコットレル大学科学賞、芸術科学フェアフィールド大学の大学によって提供されたとフェアフィールド大学の化学・生化学科。我々は感謝して、この一般的な研究分野に関しては多くの有用な洞察とアドバイスをジャン・マリー・ウォレスを認めます。加えて、我々は非常に特別な、すべての過去、現在、そしてハーパー・レザーマン研究所の今後の学部の研究者にあなたに感謝して延びています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
| Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
| pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
| Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
| Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
| Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
| Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 ml |
| Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
| Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0%-30.0% |
| General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor |
| generic plastic wrap | various | ||
| Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 ml syringe | |
| Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
| Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
| Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
| Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
| Micrometer | Central Tool Company | ||
| GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
| Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
| 10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
| Tygon tubing | various | ||
| T-switch valve | various | ||
| syringe needles | various |
References
- Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
- Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
- Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
- Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
- Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
- Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
- US Patent. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
- Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
- Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
- Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
- Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
- Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
- Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
- Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
- Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
- Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
- Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
- Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
- Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
- Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
- Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
- Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
- Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
- Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
- Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
- Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
- Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
- Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
- Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
- Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
- Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).
