Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

inkapslande cytokrom Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53802
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

Summary

Här beskrivs hur att inkapsla cytokrom c (cyt. C) i kiseldioxid (SiO 2) sol-geler, process dessa geler att bilda bioaerogels, och använda dessa bioaerogels att snabbt känna igen kväveoxid (NO) genom en gas-fas reaktion. Denna typ av protokoll kan bidra till den framtida utvecklingen av biosensorer eller andra bioanalytiska enheter.

Abstract

Applikationer såsom sensorer, batterier och bränsleceller har förbättrats genom användningen av mycket porösa aerogel när funktionella föreningar inkapslas inom aerogel. Men några rapporter om att kapsla in proteiner i sol-geler som behandlas för att bilda aerogeler existerar. Ett förfarande för inkapsling av cytokrom c (cyt. C) i kiseldioxid (SiO 2) sol-geler som supercritically bearbetas för att bilda bioaerogels med gasfas-aktivitet för kväveoxid (NO) presenteras. Cyt. C sätts till en blandad kiseldioxidsol under kontrollerad proteinkoncentration och buffertstyrkeförhållanden. Sol Blandningen får därefter gelas och vätskan fyller gelporerna är ersatt genom en serie av utbyte av lösningsmedel med flytande koldioxid. Koldioxiden förs till sin kritiska punkt och ventileras bort för att bilda torra aerogel med cyt. C inkapslad inuti. Dessa bioaerogels karakteriseras med UV-synlig spektroskopi end cirkulär dikroism-spektroskopi och kan användas för att detektera närvaron av gas-fas kväveoxid. Framgången med detta förfarande beror på reglering av C-koncentration och buffertkoncentrationen cyt. Och inte kräva andra komponenter såsom metallnanopartiklar. Det kan vara möjligt att inkapsla andra proteiner med användning av ett liknande tillvägagångssätt som gör detta förfarande viktig för potentiella framtida bioanalytisk enhet utveckling.

Introduction

Cytokrom c (cyt. C) är en viktig elektrontransferprotein involverat i kroppens cellandningen reaktioner. Det har visats vara involverad i apoptos, en kontrollerad form av celldöd, och det kan detektera sådana små toxiska molekyler såsom kväveoxid och kolmonoxid 1-3. Kväveoxid (NO) spelar en roll i en mängd olika fysiologiska processer som äger rum i nerv-, kardiovaskulära, och immunsystem. Medan cyt c. Typiskt kräver en vattenmiljö buffrat till pH-neutral värden att förbli strukturellt intakt och aktiv, har forskning visat att cyt c. Kan bibehålla sin struktur och funktion i fasta material som är kända som aerogel under vissa förutsättningar 4-9.

Aerogeler är högporösa material ofta bildade genom att syntetisera sol-gel-metalloxider (Medan metalloxid aerogeler är mycket vanliga, har kol och andra typer av aerogeler syntetiserats. Ett exempel är InP aerogels) 10 och torkning av dessa sol-geler på ett sådant sätt att den porösa fasta matrisen lämnas oförändrad 11-14. Alla porerna i fasta aerogel resulterar i mycket tillgänglig yta gör aerogel mycket användbara för alla tillämpningar där ytreaktioner är viktiga. När kemisk eller biokemisk funktionalitet är hopsatt inuti aerogel nanoarchitecture, har det visat sig att den fysiska porositet och ökad ytarea av aerogeler bidra till att förbättra sensorer, samt elektroder för batterier, bränsleceller och superkondensatortillämpningar 11,15-23 . För att torka aerogeler på ett sätt som lämnar den porösa fasta matrisen oförändrade, är det typiskt att avlägsna lösningsmedlet som finns kvar i porerna efter sol-gel-syntes genom superkritisk lösningsmedelsextraktion. Alla por kollaps som kan orsakas av ytspänningskrafterna som lösningsmedel avdunstar från gelén minimeras eftersom överkritisk torkning, en vätske-ång-gränssnitt aldrig former.

c. inkapslas i sol-geler som har hållits våt eller som har torkats ambiently 24-30. Rapporter av inkapslande biomolekyler i sol-geler som därefter torkas supercritically att bilda aerogeler är ovanligare på grund av den nödvändiga behandlingen, som kan vara skadligt för strukturen hos många proteiner. När det gäller cyt. C, vissa villkor gör det möjligt att behålla möjligheten för cyt. C för att upptäcka och reagera på gas-fas kväveoxid inom aerogel. När stabiliseras i aerogel, hög kvalitet porstruktur aerogelen underlättar reaktionen mellan cyt c. Och kväveoxid 4,8,9. Cyt. C kan kapslas in i aerogel genom att först associera den i flera lager runt guld eller silvernanopartiklar i lösning 4-8. Dessa flerskiktade överbyggnader tjänar till att skydda proteinet inom aerogelen matrisen. I den senaste approach som vi har utvecklat, när proteinkoncentrationen och buffertstyrka styrs tillsammans med andra syntetiska villkor, cyt c. behåller integritet inom aerogel även utan metallnanopartikel inledande förening 9.

Syntesen börjar så många aerogel synteser börja genom att blanda silikasol-gel prekursorer under en viss tidsperiod. Det är efter en viss blandning tid att cyt c. Tillsätts som en buffrad lösning i blandningen. Gelning sker sedan för att bilda en porös kiseldioxid fast struktur i vilken porerna är fyllda med vatten, metanol, återstående reaktanter och biprodukter. Denna vätska som fyller porerna kan sköljas ut med olika lösningsmedel genom en serie av utbyte lösningsmedels, de sista utbyten med flytande koldioxid som äger rum inom en kritisk punkt torkningsanordning hålls vid låg temperatur. Att föra gelerna över den kritiska temperaturen (31,1 ° C) av koldioxid underlättar bildandet av somupercritical fluiden inuti den trycksatta anordningen som kan ventileras för att bilda torra, mycket porösa aerogeler. Den relativt låga temperaturen som erfordras för koldioxid för bildning av en superkritisk fluid är fördelaktig jämfört med andra lösningsmedel eftersom det håller proteinet under en temperatur vid vilken den kunde denaturera.

Vår metall nanopartikel-fri metod för att kapsla in cyt c. I aerogel är fördelaktigt eftersom det är en enkel procedur som kan leda till utveckling av en mer allmängiltig protokoll för inkapsling av andra proteiner. Många proteiner kan inte interagera med metallnanopartiklar på samma sätt som cyt. C gör och metallnanopartikel syntes eller köpa lägger till ytterligare tid och kostnad för förfarandet. De få rapporter om att kapsla in proteiner i aerogel göra utvecklingen av detta förfarande ett betydande steg framåt för att hitta ett mer allmänt förfarande för inkapsling av andra proteiner i aerogel som kan hjälpa mign potentiell framtida bioanalytiska enheter.

Protokollet delen av detta manuskript beskriver hur man syntetisera kiseldioxidsol-geler, kapsla cyt c. I dessa sol-geler, torka dessa sammansatta sol-geler för att bilda aerogel, karakterisera dessa bioaerogels användning av UV-synlig och cirkulär dikroism-spektroskopi och detektera närvaron av gas-fas kväveoxid med dessa bioaerogels. Cyt. C har framgångsrikt inkapslat i aerogel när först upp i 4,4 till 70 mM vattenlösningar av fosfatbuffert. Emellertid har optimerad proteinstruktur i aerogeler befunnits resultera när inkapsling 40 mM fosfat buffrade lösningar av cyt c. Producera loaded aerogel cyt. C koncentrationer i området av 5 till 15 ^ M 9. Därför är protokollet som ges nedan för att syntetisera aerogeler med användning av 40 mM fosfat buffrade lösningar av cyt c. Vilket resulterar i en laddad cyt. C koncentrationen i aerogeler av 15 ^ M. </ P>

Protocol

Skyddsglasögon, laboratorierock och laboratoriehandskar vid alla tidpunkter under förfarandet. Använd aldrig den kritiska punkten torkapparat utan skyddsglasögon. Alla lösningar innehållande tetrametoxisilan, metanol, etanol, aceton och ammoniak bör behandlas inom ett dragskåp.

1. Gör buffert och Cyt. C Solutions

  1. För att göra ~ 750 ml pH 7, 40 mM kaliumfosfatbuffert, först förbereda 500 ml 0,04 M kaliumfosfat monobasisk genom att väga upp 2,72 g kaliumfosfat monobasisk och upplösning i vatten under användning av en 500 ml mätkolv.
  2. Bereda 500 ml av 0,04 M kaliumfosfat dibasisk genom att väga upp 3,48 g kaliumfosfat dibasisk och upplösning i vatten under användning av en 500 ml mätkolv.
  3. Häll det dibasiska saltlösningen i en stor bägare med en omrörarstav och börja omröring av lösningen på en omrörningsplatta.
  4. Tillsätt långsamt delar av monobasiskt salt solution till den dibasiska saltlösningen under övervakning av pH med en pH-elektrod och mätare tills pH är 7,00. Cirka 250-300 ml av den monobasiska saltlösningen kommer att användas.
  5. Väga in ca 0,023 g cyt. C och plats i glasscintillationsbehållare. Lägga 2.000 | il av beredd kaliumfosfatbuffert med användning av en mikropipett och sedan försiktigt virvla lösningen att blanda tills allt av den fasta, röda cyt c. Har lösts upp i lösningen och ingen typ av partiklar kvar.
  6. Ta 20 l av det beredda cyt c. Lösning och lägga till ett 1 cm väglängd plastkyvett. Tillsätt 3 ml av beredd buffert.
  7. Ta UV-vis-spektrum 300-700 nm med buffert i referenscellen. Använda cyt. C absorbansen (A) vid 409 nm, extinktionskoefficienten 31 (ε) av 106.100 M -1 cm -1, kyvetten väglängden (l), och Beer-Lamberts lag för att bestämma koncentrationen (c) av lösningen (A = εlc).
  8. Tillbaka beräkna koncentrationen av den ursprungliga framställda lösningen. Cyt. 2 ml beredd c lösning är typiskt mellan 0,7 till 0,9 mM i koncentration.
  9. Späd ursprungliga beredd cyt c. Lösning till 800 | il 0,105 mM genom att pipettera 117 pl 0,72 mM beredd cyt. C lösning i en scintillationsflaska. Tillsätt sedan resten av de 800 pl (683 | il i detta fall) av beredd buffert. Snurra för att blanda. De exakta volymerna kommer att variera beroende på den exakta koncentrationen av den ursprungliga framställd cyt. C lösning när volymen av cyt c. Att pipett beräknas som (800 | j, l * 0,105 mM) / (ursprunglig cyt. C-koncentration i mM).
  10. Lagra ursprungliga förberedda och utspädd cyt. C lösningar vid 2-8 ° C i kylskåp tills den ska användas i upp till två veckor.

2. Synthesize Kiseldioxid (SiO 2) Sol

  1. Märka en engångs 50 ml polypropylenbägaren "Varaker A '. Placera bägaren på pannan av en analytisk balans och använda ett glas pasteurpipett att lägga 1,88 g tetrametoxisilan i bägaren. Noll balans och sedan pipett 2,88 g metanol i "Bägare A".
  2. Cover "Bägare A 'med Parafilm.
  3. Märka en engångs 50 ml polypropylenbägaren "Bägare B". Lägg till en magnetisk omrörarstav och plats på pannan av en analytisk balans. Använd en glaspipett för att lägga till 0,75 g vatten och 3,00 g metanol.
  4. Cover "Bägare B" med Parafilm.
  5. Börja röra innehållet i "Bägare B" på en omrörningsplatta i ett dragskåp, sedan använda en spruta för att infoga 5 pl 28,0-30,0% ammoniumhydroxidlösning genom Parafilm täcker in i blandningen under omrörning.
  6. Så snart steg 2,5 är klar, lägg till innehållet i "Bägare A" till "Bägare B". Rör om blandningen under 20 min medan täckt i Parafilm.

3. Förbered Gel Formar

Obs: Detär dags att förbereda gel formar medan kiseldioxidsolen blandningen under omrörning i steg 2,6.

  1. Förvärva 8-9 polypropylen scintillationsflaskor (16 mm x 57 mm, volym 6,5 ml, med bottnar skivad off) och motsvarande lock. Sätt plastfolie över locket änden av flaskan för att skapa en plan yta för gel bildas på och placera locket över den och se till att den plastfolie förblir intakt inuti locket.
  2. Rada upp flaskorna med lock slut ner på bänken toppen och öppnade bottnar uppåt.

4. Förbered Cyt. C -silica Sol-geler

  1. Efter slutförandet av sol blandning (steg 2,6), tillsätt 3 ml av sol blandningen till en ren engångs 50 ml polypropen-bägare.
  2. Använd ett glas pasteurpipett att långsamt släppa 500 pl av 0,105 mM utspädd cyt c. Lösning (i steg 1,9) till 3 ml sol blandning under loppet av ~ 1 min. Se till att snurra försiktigt blandningen under tillsats av cyt c. För att undvika bildandet av storaröda klumpar. Under antagande volymerna är additiva, genom att späda 500 | il av C lösning 0,105 mM cyt. Till 3500 | j, l, det c koncentrationen nu i solen är cyt., I teorin, 15 ^ M.
  3. Pipett 0,5 ml av den resulterande cyt c. Kiseldioxidsol till varje förberedd gjutform. Pipettera också 0,5 ml återstår "vanligt" kiseldioxidsol i en eller två formar för att använda som kontrollprover under superkritiska torkningen.
  4. Täck uppåtvända öppningar formarna med Parafilm och sätta i kylskåp (~ 2-8 ° C) över natten eller i minst 12 timmar för att producera sol-geler.
  5. Ta formarna ur kylskåpet. Avlägsna Parafilm från toppen av en form som innehåller en cyt c sol-gel.; också ta bort locket och plastfolie från botten.
  6. Efter att ha lagt en viss mängd etanol från en tvättflaska i formen, använder cirkulär skiva slutet av en sprutkolven försiktigt trycka gelen ut ur formen och in i en ren 20 ml glasscintillationsbehållare fortsaining ca 5 ml etanol.
  7. Upprepa denna gel borttagningsproceduren (steg 4,5 och 4,6) tills allt cyt c. Geler läggs till flaskan och alla kiseldioxidgeler läggs till en separat flaska. Om mer än en koncentration av cyt c. Gel har gjorts, vara noga med att lagra som geler tillsammans inom separata ampuller. Fyll sedan flaskorna till toppen med etanol, mössa och lagra mellan 2-8 ° C.
  8. Var fjärde timme under dagen, ta bort geler ur kylskåpet, dekan etanolen från gelerna och ersätta med färsk etanol.
  9. Under ytterligare tre dagar, översvämmas de våta sol-geler i aceton, dekantering och tillsätta färsk aceton tre gånger om dagen.

5. Supercritically Dry Cyt. C -silica Sol-geler

  1. Kyla en kritisk punkt torkningsanordning (se figur 1) till 10 ° C genom att ställa in temperaturen på en bifogad cirkulator till 8 ° C.
  2. Så snart anordningen har reached 10 ° C, utföra ett läckagetest på apparaten genom att fylla en överförings båt med aceton och tätande den insidan av apparaten.
    1. Öppna fyllningsventilen i anordningen och tillsätt koldioxid tills anordningen är halv-full.
    2. Stäng påfyllningsventilen och lyssna noga för väsande på dörrar och ventiler där O-ringar eller tätningar kan försämras.
    3. Byt ut O-ringarna eller tätningar om en läcka hittas.
  3. Efter avslutad läckagetestet, öppna dräneringsventilen för att frigöra aceton och koldioxid till kollektor-elektroden hos ett dragskåp. Ta sedan bort överförings båt från apparaten.
  4. Efter att se till att apparaten är läckagefritt, häll försiktigt de våta gelerna från scintillationsfläskor, tillsammans med de flesta av aceton, till överförings båtens tre långa sektioner (prov korgar eller gasbinda täcker är inte nödvändigt). Fint tryck och flytta gelerna inom båten med pincett för att garantera att alla geler är helt nedsänkt in aceton. Tillsätt mer aceton vid behov innan tätning båten inne i apparaten.
  5. Öppna fyllningsventil av anordningen för att lägga till koldioxid, sedan öppna avloppsventilen för att frigöra aceton under fem minuter så snart acetonen blandning med koldioxiden observeras att sjunka till botten av anordningen genom apparaten fönstret. Detta sipprar av aceton till botten kommer att ske innan apparaten är helt fylld med koldioxid, så påfyllningsventilen bör förbli öppna för den utsträckning som krävs under tömningen så att anordningen kommer att fortsätta att fylla även när avloppet är öppen.
  6. Stäng tömningsventilen. Håll påfyllningsventilen öppnade något.
  7. Fem minuter senare, öppna avtappningsventil för fem minuter igen och justera fyllningsventilen öppnas nog så att apparaten förblir fullt under hela tömningen tiden. Stäng tömningsventilen, hålla påfyllningsventilen öppnade, sedan upprepa detta dräneringssteg en gång femminuter senare.
  8. Efter dessa första tre dräneringssteg öppnar avlopp för 5 minuter i taget ungefär var 40 minut under loppet av minst sex timmar för att säkerställa fullständig ersättning av aceton av flytande koldioxid inom gelerna. Justera alltid fyllningsventilen för att vara tillräckligt öppen under varje dränering, så att vätskenivån i anordningen aldrig sjunker under toppen av båten under tömningen.
  9. När dränerande steg är klar stänger påfyllningsventilen, och dränera den flytande koldioxiden så att nivån förblir synlig strax ovanför stiften på båten genom att titta genom apparaten fönstret.
  10. Ställ in temperaturen hos apparaten fäst cirkulatorn till 40 ° C för att säkerställa att den flytande koldioxiden stiger över dess kritiska temperatur och tryck (T ^ = 31 ° C; P c = 7,4 MPa).
  11. Efter ca 15 minuter, observera övergången från vätska till superkritisk vätska genom apparaten fönster som vätske Meniskoss ovanför stiften i båten försvinner. Tillåt minst 15 min av jämviktstiden, öppna avluftningsventilen en liten mängd för att börja släppa den superkritiska vätskan.
  12. Under loppet av ca 45 minuter, fortsätter att stegvis öppna avluftningsventilen bredare och bredare så att en stadig, men mycket låg brus att frigöra vätska kan höras och manometern observeras att långsamt minska till noll.
  13. Efter det att trycket i apparaten har gått till noll öppnar apparaten dörren, ta båten och använda pincett för att placera nyligen torkade aerogeler i rena glas scintillationsflaskor.

6. Karakterisera Cyt. C -silica Aerogel med UV-synligt och cirkulär dikroism (CD) spektroskopi

  1. Förbereda en papp plattform för att hålla aerogelen monoliter i strålgången av UV-Visible spektrofotometer eller CD-spektrometer.
    1. Klipp ut en 2,5 cm x 2,5 cm bit av lätt kartong (såsom kartong från en låda med laboratoriet vävnad), vik den på mitten, skär halvvägs upp på luckan, sedan vika två flikar, som skapats genom att skära, tillbaka.
    2. Klipp ut en 5 cm x 5 cm bit av lättvikts kartong, med en 1,5 cm x 1,5 cm fyrkantigt hål i mitten. Använd sedan svart eltejp för att minska storleken på last till 0,5 cm x 0,5 cm.
    3. Tejpa flikar vikta och skär kartong mot 5 cm x 5 cm bit kartong så att en liten böjd yta skapas för en aerogel monolit att sitta på direkt framför 0,5 cm x 0,5 cm hål (se figur 2) . Då tejpa tillbaka bit kartong för UV-synlig spektrofotometer så hålet är i linje med strålgången.
  2. Mäta tjockleken av de geler, som kommer att användas för väglängder, med en mikrometer.
  3. Placera en gel på kartong plattformen och mäta ett spektrum från 300 till 800 nm med luft i referensfacket på UV-synlig spektrofotometer.
  4. Montera ett polynom, A = a n, våglängden (λ) region där absorbansen (A) är i huvudsak på grund av bakgrundsspridning, ~ 700-800 nm. Den en koefficient är typiskt lämplig att ett tal mellan ~ 1 x 10 8 och 1 x 10 6 och den n koefficienten är typiskt lämplig att ett tal mellan ~ 2 och 3.
  5. Beräkna scatter vid andra våglängder, med användning av koefficienterna, a och n, som erhållits från passform.
  6. Subtrahera detta beräknade spridnings bakgrundsabsorbansen från den råa spektrumet för att erhålla en scatter korrigerat spektrum.
  7. Montera scatter subtraheras spektrum med en Gauss kurva i regionen på 370 till 490 nm med hjälp av lämplig mjukvara (gram / AI 8,0) för att bestämma topphöjden, topp centrum, och toppbredden av Soret toppen av aerogelen.
  8. Applicera Beer-Lambert lagen genom att använda den uppmätta tjockleken av gelén för banlängden (l), extinktionskoefficienten 31 (ε) av 106.100 M -1 cm -1 c i aerogelen (A = εlc).
  9. Jämför den beräknade cyt c. Koncentration till koncentrationen teoretiskt i gelén (15 ^ M) för att säkerställa livskraft cyt. C inom aerogelen. Typiska procent viabilitet är nära 100%, men det bör noteras att dessa livsduglighet är bara uppskattningar eftersom beräkningen baseras på extinktionskoefficienten för cyt c. I lösning 31 som antas vara något annorlunda än extinktionskoefficienten för cyt. c i aerogel som inte är känd.
  10. Kör kväve i CD instrumentet åtminstone 5 minuter innan du slår lampan på.
  11. Tejpa kartonghållaren till CD spektrometern så hålet är i linje med strålgången.
  12. Mäta ett kontinuerligt våglängds tom spektrum med ingenting i kartonghållaren 350-500 nm vid 100 nm / min, med ett genomsnitt av tre avsökningar.
  13. Placera en gel (tjocklek som tidigare uppmätts i steg 6,2) på kartong-plattformen och mäta ett spektrum från 350 till 500 nm vid 100 nm / min, med ett genomsnitt av tre avsökningar.
  14. Upprepa UV-synliga och CD mätningar för alla aerogel monoliter av intresse.

7. Identifiera Förekomst av kväveoxid (NO) Gas med Cyt. C -silica Aerogel

VARNING: Att arbeta med NO är farligt och alla NO-gas ska hanteras i ett dragskåp eller utmattad i ett dragskåp. Ihållande exponering för NO är giftigt för vävnader som mycket giftig kvävedioxid och / eller kvävetetroxid bildas när ingen kommer i kontakt med luft. Värme och korrosiva gaser produceras också när ingen kommer i kontakt med vatten.

  1. Placera en 8 L kväveoxid cylinder (10% kväveoxid, 90% kväve) i ett väl ventilerat dragskåp och justera trycket till 4 psi.
  2. Ansluta slangen till både kväveoxid cylindern och till en kvävecylinder (tryck satt till sex psi) och koppla samman ändarna av slangen till en T-ventil (se figur 3a).
  3. Välj en aerogel monolit för experimentet och mäta tjockleken (eller väglängd) med en mikrometer.
  4. Placera aerogelen (~ 3 mm tjock) i en engångskyvett med plastlock och placera kyvetten i spektrofotometer. Skär aerogelen något om det behövs för att passa i kyvetten.
  5. Infoga två sprutnålar i plastlocket av kyvetten, en ansluten till utgången av den T-ventil, och en förbunden med ett rör för att fungera som avgaser in i dragskåpet (se figur 3b). Använd Parafilm för att täta de nålar för att slangen och locket till kyvetten.
  6. Placera en tom engångskyvett i referenscellen.
  7. Justera aerogel kyvetten position för att se till att aerogelen ligger i strålgången före start av experimentet.
  8. Ta en initial spektrum 800-300 nm.
  9. Övervaka skillnaden mellan absorbansen vid 414 nm och absorbansen vid 408 nm, medan vrida T-ventilen för att växla mellan kväve och kväveoxid / kväveblandning vid bestämda tidsintervall att se till att vid något tillfälle är flödet av kväve eller kväveoxid / kväveblandning så hög att aerogelen rör sig runt i kyvetten.
  10. Fatta ett slutgiltigt spektrum från 800 till 300 nm, när exponeringscykler är klar.
  11. Upprepa proceduren med tre till fyra monoliter för att erhålla en genomsnittlig avkänning svar.

Representative Results

De beskrivna förfarande resulterar i aerogel som innehåller livskraftig cyt. C. Såsom anges i slutet av inledningen, kan cyt c. Inkapslas från vattenbuffertlösningar som sträcker sig från 4,4 till 70 mM fosfat. Exempel på cyt. C -silica (cyt. C-SiO 2) aerogeler tillverkas av lösningar innehållande olika buffertkoncentrationer visas i figur 4. Alla geler är relativt genomskinliga med gelerna tillverkade av 70 mM buffra mest opaka.

En jämförelse av spektroskopi av cyt c. Under olika betingelser visas i figur 5. Ett typiskt spektrum (Figur 5c) visar den stora Soret topp runt 408 nm för cyt. C-SiO 2 aerogeler och är mycket lik det spektrum av cyt . c i lösning (Figur 5a). Dessutom ett spektrum av cyt.c inkapslad i aerogeler med metallnanopartiklar visas också (figur 5b) och cyt. c-SiO 2 aerogel spektrum liknar detta spektrum som väl. När cyt. C-SiO 2 aerogel utsätts för kväveoxid, är en typisk växling av Soret topp observeras (Figur 5d).

UV-vis-spektra för geler framställda av cyt. C lösningar i varierande buffertkoncentrationer visas i figur 6. Alla dessa geler visar karakteristiska UV-synliga spektroskopiska terar indikerar att cyt. C är inte i ett denaturerat tillstånd inom gelerna. Emellertid den minskade translucens av gelerna tillverkade av 70 mM buffertresulterar i en lägre signal-till-brusförhållandet för dessa spektra.

CD-spektra för cyt. C-SiO 2 aerogeler liknar spektra för cyt c. c. i buffrad lösning (Figur 7).

Figur 8 visar en typisk kväveoxid övervakning respons för cyt. C-SiO 2 aerogeler och motsvarande aerogeler som också innehåller metallnanopartiklar förutom cyt. C. Skillnaden mellan absorbansen vid 414 nm och den vid 408 nm ses att öka och sedan minska när gelerna utsätts för kväveoxid och sedan kväve respektive i följd.

Om superkritisk koldioxid inte släpps vid en tillräckligt låg hastighet, livskraft cyt. C inom de bildade aerogeler kommer att äventyras. Det visar en jämförelse resulterande UV-synliga spektrat efter bilda geler genom att släppa koldioxid vid olikapriser (Figur 9).

Figur 1
Figur 1: Kritisk punkt torkapparat Den kritiska punkten torkapparat som visas från (A) fram och (B) tillbaka med överförings båt och apparater dörren visas bredvid baksidan av apparaten..

figur 2
Figur 2: Kartong plattform Den sammansatta papp plattform för att hålla en aerogel i vägen för ett instruments balk..

Figur 3
Figur 3: Kväveoxid avkänning set-up kväveoxid avkänning set-up visas inklusive (A) dragskåp bifogade 10% kväveoxid.90% kväve cylinder, slangar och T-ventil, och (B) kyvetten med införda nålar.

figur 4
Figur 4:.. Prov cyt c-SiO 2 aerogeler aerogeler inkapsling 15 pM cyt c i 4,4 mM, 40 mM och 70 mM kaliumfosfatbuffert visas i jämförelse med en dime från vänster till höger.. Dessa aerogel är ungefär 0,2-0,5 cm hög. Återges med tillstånd 9.

figur 5
Figur 5:. Cyt c SiO 2 aerogel spektroskopi synliga spektrat av 15 iM cytokrom c i (a) 50 mM fosfatbuffert sol.ution; (B) Au (5 nm) ~ cyt c SiO 2 aerogel. (C) cyt c SiO 2 aerogel (kontakt med luft). (D) cyt c. SiO 2 aerogel (utsätts för kväveoxid för 3,5 min). Dessa representativa spektra för varje typ av gel är förskjutna för tydlighets skull, och den streckade linjen betecknar läget av Soret-toppen i cyt. C i buffert. Även om varje spektrum är 15 iM cyt c., Gel tjocklekar (eller höjd) är endast 0,2-0,5 cm jämfört med 1 cm lösning kyvett resulterar i en högre lösning absorbans. Återges med tillstånd 9.

figur 6
Figur 6: Aerogel spektroskopi som inkapslade buffertkoncentration varieras Medelvärdes UV-synliga spektrala absorbans av aerogel dividerat med gel banlängden för geler inkapslande 15 _.6;. Cyt M c i 70 mM (svart) (i genomsnitt fyra spektra), 40 mM (röd, streckad) (genomsnitt 8 spektra), och 4,4 mM (grön, streckad) (i genomsnitt 9 spektra) kaliumfosfatbuffert . Återges med tillstånd 9.

figur 7
Figur 7:... Aerogel cirkulär spektroskopi Cirkulär dikroism spektra av cyt c natrium fosfatbuffrad lösning (fast), två representativa spektra av cyt c SiO 2 aerogel (streckad) och två representativa spektra av Au (5 nm) ~ cyt c. SIO- 2 aerogeler (streckade). Återges med tillstånd 9.

Figur 8
Figur 8: Kväveoxid detektering med cyt c SiO 2. . sub> aerogel Övervakning av shift (AA = A 414 nm - A 408 nm). i Soret intensitet cyt c (fast rött) och Au ~ cyt c (streckad blå) inkapslad i SiO 2 sammansatta aerogel nanoarchitectures som gasflödet. växlas mellan kväve (där Soret toppmaximum är ~ 408 nm) och kväveoxid (där Soret toppmaximum är på ~ 414 nm). Varje kurva är i genomsnitt 3-4 försök, med två av cyt c SiO 2 prövningar övervakas på AA = A 414 nm -. En 407 nm sedan den första Soret toppmaximum var vid 407 nm för dessa försök. Återges med tillstånd 9.

figur 9
Figur 9:. Effekt av superkritisk frigöra tid vätska Medelvärdes UV-synliga spektrala absorbans dividerat med gel banlängden för cyt c SiO 2 aerogeler ENCA.psulating 10 pM cyt c. i 50 mM fosfatbuffert, i vilken de supercritically torkade aerogeler gjordes av antingen släppa superkritisk koldioxid under 45 min (fast, svart (medelvärde för 9-spektra)) eller 7 min (streckad, röd (i genomsnitt 4 spektra)). Återges med tillstånd 9.

Discussion

Såsom beskrivits, har denna procedur konsekvent producerade viabla cyt. C inkapslad i aerogeler. Koncentrationen av cyt c. Inom de aerogeler kan varieras från 5 till 15 | iM och buffertkoncentrationen av den initiala cyt c. Lösningen inkapslas i aerogeler kan varieras från 4,4 till 70 mM fosfat utan allvarliga skadliga effekter på proteinlivsduglighet. Men toppcenter och toppbredden av den karakteristiska cyt c. Soret topp i aerogel är närmast vad de är för cyt c. I lösning när cyt. C är inkapslad i aerogeler från lösningar av 40 mM buffert 9.

Syntesen av cyt. C SiO 2 aerogel påverkas vid en ålder av några av utgångsreagens. Metanol, tetrametoxisilan, och ammoniumhydroxidlösning är alla hygroskopisk och bör bytas ut en-till-två månader. Den ökade vatten som byggs upp idessa reagens över tiden påverkar gel strukturella egenskaper och övergångstiden sol-till-gel.

När du utför överkritisk torkning, kan den kritiska punkten torkapparat överförings båt håller upp till arton 0,5 cm tjocka, geler cm diameter 1. Som framgår av protokollet avsnitt bör en särskild fyllning och tömning förfarande följas för att överföra koldioxiden i sol-geler. Det är viktigt att notera att i början av dräneringen protokoll, dränerings blandning av koldioxid och aceton strömmar med en sådan hög hastighet, att dräneringsröret fryser stel med fukt kondenserar till is på utsidan. Blandningen rinner ut innehåller lite vatten eftersom aceton är inte vattenfri och detta vatten kan ibland frysa i en omfattning som dräneringsröret faktiskt träskor. Det är nödvändigt att titta på sådana träskor och lyssna efter ett stopp av flödet. Avloppsventilen bör stängas för några minuter så att täppa smälter om en träsko upptäcks. Idet värsta scenariot, om dräneringsventilen inte är stängd, kan en täppa orsaka så mycket tryck att bygga upp, att dräneringsröret dyker kraft av apparaten. Efter de första dränerings perioder, kommer majoriteten av aceton har sköljts ut ur apparaten, och förekomsten av våt is bitar kommer att minska dramatiskt. Urladdningen kommer successivt att likna torris som dräneringen protokollet fortsätter med eventuellt kvarvarande bevis aceton närvaro (såsom doft) blir odetekterbara i slutet av dräneringsprocessen.

Efter koldioxiden i anordningen har gått från vätska till superkritiska fluiden och ventileringsprocess har påbörjats, är det nödvändigt att frigöra fluiden vid en långsam hastighet under åtminstone 45 minuter såsom anges i förfarandet 9. En högre frisättningshastighet kan minska lönsamheten i cyt c. (Som visas i figur 9) inom aerogel och aerogel själva kan faktiskt sönder som the vätska rusar att fly från gelerna. I allmänhet, även om aerogel förblir intakt efter att ha öppnat apparaten dörren, är det viktigt att hantera dem noggrant och försiktigt eftersom de är sköra och kan gå sönder lätt.

Styr silikageler som hälls vid sidan av cyt c. SiO 2 geler används efter superkritisk torkning för att avgöra om överföringen koldioxiden i gelerna var framgångsrik. Ibland cyt c. SiO 2 geler kan verka grumligt och det är viktigt att ta reda på om det är på grund av ofullständig lösningsmedel överföring eller om det kan ha att göra med koncentrationen av cyt c. Eller buffert inkapslade i gelerna. Om kiseldioxidgeler utan cyt c. Tycks ha en homogen, genomskinligt utseende hela, kan detta tas som bevis för att lösningsmedels överföringen skedde helt även om cyt c. SiO 2 geler har några grumlighet till dem. Grumlighet inom kiseldioxidgelerutan cyt c. efter torkning indikerar att vissa aceton kvar inne gelerna under ventilering.

Som framgår av protokollet avsnittet viktiga säkerhetsåtgärder måste vidtas vid arbete med kväveoxid (NO). För att detektera NR med användning av de aerogeler, är det nödvändigt att täta kuvetten mycket väl och att uttömma gas som strömmar över aerogeler i ett dragskåp. Alternativt kan hela spektrofotometer flyttas till ett dragskåp tillsammans med NO gasflaska som en extra försiktighetsåtgärd för att begränsa exponering för NO-gas. Vid kontakt med luft NO omedelbart kommer att producera den mycket giftiga kvävedioxid, kvävetetroxid eller båda. NO kan också reagera med vatten för att producera värme och korrosiva gaser. Därför kan fortsatt exponering för NO resultera i toxicitet direkt vävnad.

Vid användning av cyt. C-SiO 2 aerogeler för att detektera närvaron av kväveoxid, kommer Soret-bandet initialt att vara vid ~ 408 nm och kommer att flyttatill ~ 414 nm i närvaro av kväveoxid. Efter växla tillbaka till kväve, bör Soret-bandet vända tillbaka till att vara centrerad vid ~ 408 nm. Det kan också vara möjligt att använda cyt. C SiO 2 aerogel att detektera närvaron av andra ligander såsom kolmonoxid 27.

Olika publicerade förfaranden inkluderar en extra steget att kombinera guld- eller silvernanopartiklar med cyt. C i lösning före blandning med solen och supercritically torkning för att bilda aerogeler 4-8. Vid jämförelse av UV-synlig spektroskopi av cyt c. Inkapslad i aerogel med metallnanopartiklar till det av cyt c. Inkapslad i aerogel utan metallnanopartiklar visar att dessa två typer av inkapslingsteknik producerar cyt c. Om liknande livskraft inom aerogel (Figur 5) . Men är något stabilare än cyt den cyt c. Inkapslad med metallnanopartiklar. C kapslad utan metallnanopartiklar inom aerogel 9. CD-spektra av båda typerna av cyt c. Aerogel är också liknande, även om båda skiljer sig från det spektrum av cyt c. I buffert indikerar någon utvikning av cyt c. Inom aerogel (Figur 7). Tidigare rapporter om cyt. C inkapslade i aerogeler tyder på att cirkulär dikroism-spektroskopi är mest sannolikt att bedöma det yttersta skiktet av protein, ovikta vid kontakt med silikagel, inom antingen metall nanopartikel-kärnförsedda flerskikts cyt. C strukturer eller löst organiserade strukturer som bildar när inga metallnanopartiklar är närvarande i aerogel 4,9. Majoriteten av cyt c. Inom någon typ av självorganiserande struktur inuti aerogel förblir viks mätt med UV-synlig spektroskopi ändå. Fördelen med det protokoll som beskrivs häri sans nanopartiklar är att dyra inköp eller tidsödande syntes av metallnanopartiklar är inte nödvändigt. Proteiner har inte ofta framgångsrikt inkapslat inom aerogel, och så detta förfarande är viktigt att det kan leda till utveckling av en mer generell metod för inkapsling av andra proteiner i aerogel med potentiell betydelse för framtida bioanalytiska enheter.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Stöd för detta arbete och / eller offentliggörande som tillhandahålls av Science Institute of Fairfield University College of Arts and Sciences, Fairfield University fakulteten bidrag, en Cottrell College Science Award från Research Corporation för vetenskap Advancement, Fairfield University College of Arts & Sciences och Fairfield University Chemistry & Biochemistry Department. Vi tackar Jean Marie Wallace för mycket hjälpsamma insikter och råd när det gäller denna allmänna forskningsområde. Dessutom sträcker vi en mycket speciell tack till alla tidigare, nuvarande och framtida grund forskare i Harper-Leatherman Research Lab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 ml
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0%-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 ml syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
  2. Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
  3. Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
  4. Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
  5. Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
  6. Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
  7. US Patent. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
  8. Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
  9. Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
  10. Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
  11. Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
  12. Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
  13. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
  14. Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
  15. Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
  16. Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
  17. Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
  18. Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
  19. Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
  20. Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
  21. Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
  22. Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
  23. Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
  24. Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
  25. Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
  26. Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
  27. Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
  28. Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
  29. Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
  30. Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
  31. Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).

Tags

Bioteknik cytokrom sol-geler aerogeler kiseldioxid aerogel Ultraviolet-Visible kväveoxid
inkapslande cytokrom<em&gt; c</em&gt; I Silica Aerogel Nanoarchitectures utan Metal Nanopartiklar med bibehållen gasfas Bioaktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E.… More

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter