Summary
وأظهرت هذه التقنية الكهربية من تسجيل داخل الخلايا وتستخدم لتحديد الحساسيات الطيفية للخلايا مستقبلة للضوء واحدة في العين مجمع فراشة.
Abstract
تسجيل داخل الخلايا هي تقنية قوية تستخدم لتحديد كيف يمكن لخلية واحدة قد يستجيب لحافز معين. في بحث الرؤية، وقد تم تسجيل داخل الخلايا تاريخيا تقنية شائعة تستخدم لدراسة الحساسيات من خلايا مستقبلة للضوء الفردية للمؤثرات الضوء المختلفة التي لا تزال تستخدم اليوم. ومع ذلك، لا تزال هناك ندرة في منهجية مفصلة في الأدب للباحثين الذين يرغبون في تكرار التجارب تسجيل داخل الخلايا في العين. هنا نقدم الحشرة كنموذج لدراسة علم وظائف الأعضاء العين بشكل عام. وتقع خلايا مستقبلة للضوء الحشرات بالقرب من سطح العين، وبالتالي من السهل الوصول إليها، والعديد من الآليات التي تشارك في الرؤية وحفظها عبر شعب الحيوانات. نحن تصف الإجراء الأساسي في الجسم الحي تسجيل داخل الخلايا من خلايا مستقبلة للضوء في العين من فراشة، وذلك بهدف جعل هذه التقنية في متناول الباحثين لديهم خبرة سابقة قليلا في البريدlectrophysiology. ونحن نقدم المعدات الأساسية اللازمة، وكيفية إعداد فراشة حية للتسجيل، وكيفية إدراج مسرى مكروي الزجاج في خلية واحدة، وأخيرا إجراءات تسجيل نفسها. نحن أيضا شرح التحليل الأساسي للبيانات استجابة أولية لتحديد حساسية الطيفية من أنواع الخلايا الفردية. على الرغم من أن بروتوكول لدينا يركز على تحديد حساسية الطيفية، منبهات أخرى (على سبيل المثال، الضوء المستقطب) والاختلافات في طريقة قابلة للتطبيق لهذا الإعداد.
Introduction
ويلاحظ الخصائص الكهربائية للخلايا مثل الخلايا العصبية عن طريق قياس تدفق الأيونات عبر أغشية الخلايا على أنها تغير في الجهد أو التيار. وقد وضعت مجموعة متنوعة من التقنيات الكهربية لقياس الأحداث الكهربيولوجي في الخلايا. الخلايا العصبية الموجودة في عيون الحيوانات يمكن الوصول إليها والدوائر التي غالبا ما تكون أقل تعقيدا مما كانت عليه في الدماغ، مما يجعل هذه الخلايا مرشحين جيدين للدراسة الكهربية. وتشمل التطبيقات المشتركة للالكهربية في العين تخطيط كهربية الشبكية (أرج) 1،2 ومسرى مكروي تسجيل داخل الخلايا. أرج ينطوي على وضع القطب أو على العين من حيوان، وتطبيق حافز الضوء، وقياس التغير في التيار الكهربائي في شكل مبلغ من ردود جميع الخلايا المجاورة 3-6. إذا كان أحد يهتم تحديدا في وصف الحساسيات الطيفية للخلايا مستقبلة للضوء الفردية، وغالبا ما أنواع الخلايا متعددة تستجيب في وقت واحد في مختلف جوانب القوة لحافز معين؛ وبالتالي فإنهقد يكون من الصعب تحديد الحساسيات من أنواع معينة من الخلايا من البيانات أرج خاصة إذا كان هناك عدة أنواع مختلفة من خلايا مستقبلة للضوء طيفيا-مماثلة في العين. حل واحد محتمل هو خلق المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة مع مبصرة (أوبسين) الجينات في المصالح التي أعرب عنها في الخلايا غالبية R1-6 في العين ثم أداء ERGs 7. وتشمل العيوب المحتملة لهذه الطريقة لا للانخفاض في التعبير عن البروتين مستقبلة للضوء 8، والإطار الزمني الطويل لتوليد وفحص الحيوانات المعدلة وراثيا. للعيون مع أنواع أقل من المستقبلات الضوئية متميزة طيفيا، يمكن أن تكيف العين مع المرشحات الملونة تساعد في خفض مساهمة بعض أنواع الخلايا إلى أرج، مما يسمح تقدير حساسية الطيفية ماكسيما 9.
تسجيل داخل الخلايا هو أسلوب آخر حيث يخوزق القطب غرامة خلية ويتم تطبيق التحفيز. سجلات القطب فقط أن لحاقاستجابة الخلية idual بحيث تسجيل من وتحليل الخلايا الفردية متعددة يمكن أن تسفر عن حساسيات معينة من أنواع مختلفة من الخلايا من الناحية الفسيولوجية 10-14. على الرغم من أن بروتوكول لدينا يركز على تحليل الحساسية الطيفية، والمبادئ الأساسية من بين الخلايا تسجيل مع أقطاب الحادة للتعديل لتطبيقات أخرى. باستخدام إعداد مختلفة من العينة، على سبيل المثال، وباستخدام أقطاب الكوارتز حادة، يمكن للمرء أن يسجل من أعمق في الفص البصري أو مناطق أخرى في الدماغ، وهذا يتوقف على السؤال المطروح. على سبيل المثال، وأوقات استجابة خلايا مستقبلة للضوء الفردية 15، نشاط الخلايا في البصرية فصوص 16 (الصفيحة، النخاع أو lobula 17)، الدماغ 18 أو غيرها من العقد 19 ويمكن أيضا أن تسجل مع تقنيات مشابهة، أو يمكن الاستعاضة مؤثرات اللون مع الاستقطاب 20 -22 أو الاقتراح محفزات 23،24.
Phototransduction، العملية التي من خلالها الضوءيمتص الطاقة وتحويلها إلى إشارة الكهروكيميائية، هو سمة قديمة المشتركة إلى يوم تقريبا جميع الحاضرين شعب الحيوانات 25. الصباغ البصرية الموجودة في خلايا مستقبلة للضوء، ومسؤولا عن بدء phototransduction البصرية رودوبسين. مصنوعة رودوبسين في جميع الحيوانات تتكون من بروتين أوبسين، وهو عضو في 7 الغشاء G عائلة مستقبلات البروتين يقترن، وحامل اللون يرتبط وهي مشتقة من شبكية العين أو جزيء مشابه 26،27. أوبسين تسلسل الأحماض الأمينية وهيكل حامل اللون يؤثر على امتصاص رودوبسين لأطوال موجية مختلفة من الضوء. عندما يتم امتصاص الفوتون من قبل حامل اللون رودوبسين يصبح تفعيلها، وبدء سلسلة G-البروتين في الخلية الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى فتح قنوات أيون بغشاء 28. وخلافا لمعظم الخلايا العصبية، وخلايا مستقبلة للضوء تخضع التغييرات المحتملة متدرجة التي يمكن قياسها على أنها تغير نسبي في السعة استجابة مع تغيير التحفيز خفيفة. وعادة ما تعطىنوع مبصرة يعبر فقط الجين أوبسين واحد (على الرغم من وجود استثناءات 8،10،29-31). متطورة رؤية الألوان، من النوع الذي يوجد في كثير من الفقاريات والمفصليات، ويتحقق مع العين معقدة من مئات أو آلاف من خلايا مستقبلة للضوء كل تعبير عن واحد أو أكثر من أنواع أحيانا رودوبسين. يتم التقاط المعلومات البصرية من خلال مقارنة الردود على فسيفساء مبصرة عبر معقدة الإشارات العصبية المصب في العين والدماغ، مما يؤدي إلى تصور صورة كاملة مع اللون والحركة.
بعد قياس ردود الخام من خلية مستقبلة للضوء لأطوال موجية مختلفة من الضوء عبر تسجيل داخل الخلايا، فمن الممكن لحساب حساسيتها الطيفية. ويستند هذا الحساب على مبدأ Univariance، التي تنص على أن استجابة الخلايا المستقبلة للضوء هي تعتمد على عدد من الفوتونات أنها تمتص، ولكن ليس على خصائص معينة من الفوتونات أنها تمتص 32. أي الفوتون الذي absorbed بواسطة رودوبسين من شأنها أن تحفز نفس النوع من الاستجابة. في الممارسة العملية، وهذا يعني أن السعة استجابة الخام الخلية سيزيد إما بسبب زيادة في شدة الضوء (الفوتونات أكثر لاستيعاب)، أو إلى التحول في الطول الموجي نحو حساسية ذروته (احتمال أكبر من رودوبسين استيعاب أن الطول الموجي). علينا الاستفادة من هذا المبدأ في ربط الاستجابات الخلوية في كثافة معروفة ونفس الطول الموجي للردود على أطوال موجية مختلفة وبنفس الشدة ولكن الحساسية النسبية غير معروفة. وغالبا ما يتم تحديد أنواع الخلايا التي الطول الموجي الذي قمم حساسيتها.
هنا نعرض طريقة واحدة لتسجيل داخل الخلايا وتحليل الحساسية الطيفية للخلايا مستقبلة للضوء في العين فراشة، مع التركيز على جعل هذه الطريقة أكثر سهولة للمجتمع العلمي على نطاق أوسع. وعلى الرغم من تسجيل داخل الخلايا لا تزال شائعة في الأدب، ولا سيما فيما يتعلق رؤية الألوان في الحشرات، وقد وجدنا ثار أوصاف المواد والأساليب وعادة ما تكون قصيرة جدا للسماح لاستنساخ هذه التقنية. نقدم هذه الطريقة في شكل شريط فيديو بهدف السماح أسهل النسخ المتماثل. وصفنا هذه التقنية أيضا استخدام المعدات التي يمكن الحصول عليها بسهولة وبأسعار معقولة. نعالج المحاذير الشائعة التي غالبا ما لا يتم الإبلاغ، التي تبطئ البحوث عند تحسين تقنية جديدة ومعقدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم علاج جميع الحيوانات كما إنسانية ممكن. شحنت الحشرات والشرانق من كوستاريكا علم الحشرات توريد وكوستاريكا.
1. Heliconius العناية شرانق
- تعليق كل الشرانق متباعدة 2-3 سم بعيدا في غرفة ترطيب باستخدام دبابيس الحشرات.
- بعد eclosion، تسمح الأجنحة لتجف ثم الحفاظ على الفراشات على قيد الحياة لا يقل عن 1 يوم في غرفة ترطيب وتغذية محلول مخفف العسل يوميا قبل التسجيل.
- تمييع العسل مع الماء لنحو حل العسل 20٪ من حيث الحجم، وتصب في طبق بيتري الضحلة.
- جلب الفراشات الفردية إلى طبق بيتري، واحدا تلو الآخر. عند لمس الحل مع الجفن الأمامي، والفراشات تمتد تلقائيا proboscides وتشرب من طبق بيتري. إذا لم خرطوم بهم تمتد تلقائيا، واستخدام الملقط لسحب خرطوم من وندخله الى الحل العسل.
2. بصري المسار والمعايرة، وقياس آثافةement التجريبية ظروف الإضاءة
- وضع W زينون مصباح 150 قوس مع الإسكان وإمدادات الطاقة العالمية وتعلق المكثف الجمعية عدسة واحدة على نهاية جدول متر واحد على الأقل طويلا لتحقيق الضوء الأبيض الساطع.
تنبيه: زينون مصابيح القوس تنتج ضوء ساطع للغاية مع شدة الأشعة فوق البنفسجية القوية. نظارات واقية يجب أن ترتديه في جميع الأوقات، ويجب استخدام مصباح وفقا لتوجيهات من قبل الشركة المصنعة لمنع تراكم طبقة الأوزون الناجم عن تفاعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع الأكسجين في الغلاف الجوي. - انشاء الضوئية متر مسار واحد في طول لضوء الخروج من الجمعية السكنية لتمرير من خلال (الشكل 1).
- مكان بالترتيب التالي على المسار البصري مع المسافات التقريبية عدا: 1) السيليكا محدب أو عدسة الكوارتز 40 سم من التجمع المكثف، 2) محايدة عجلة تصفية الكثافة (مع عدم وجود مرشحات حاليا في مسار الضوء) 22 سم كذلك على طول المسار، 3) مصراع مع وحدة محرك 14 سم من فلتر NDالصورة، 4) السيليكا أو الكوارتز مقعرة عدسة المجاور مباشرة بعد مصراع، و 5) على الموازاة شعاع مسبار 6 سم كذلك على طول نهاية بكثير من المسار.
- يلصق 600 ميكرون قطر كابل الألياف البصرية إلى تحقيق الموازاة شعاع.
ملاحظة: اعتمادا على شدة الضوء، كابل الألياف البصرية قطرها 5-10 ملم قد تكون هناك حاجة لتوفير ما يكفي من الضوء لمحضرات أخرى ويمكن أن تكون بديلا لذلك. - ضبط المسافة والارتفاع وزاوية كل عنصر بصري بحيث شعاع ضوء الخروج من التجمع هو على أعلى كثافة ممكنة.
- كما قد تختلف العناصر مسار بصري قليلا مع التطبيقات المختلفة، وضمان أن جميع عناصر تنقل الضوء في الأشعة فوق البنفسجية والمدى المرئي (315-700 نانومتر).
- مرة واحدة يتم تجميعها في مسار بصري، وقياس الضوء الذي يمر من خلال الإعداد باستخدام مطياف. معايرة مطياف لأول مرة باستخدام مصباح معايرة مع الطيف المعروفة وبرنامج الشركة المصنعة.
ملاحظة: وصفنا ما يلي إعدادها باستخدام المنتجات المحيط البصريات وضوح ولكن غيرها من الشركات المصنعة (على سبيل المثال، Avantes) بيع المنتجات المماثلة.- تشغيل مصباح معايرة التنغستن 45 دقيقة على الأقل قبل أخذ القياسات.
- لمعايرة، ونعلق مطياف عبر USB إلى جهاز كمبيوتر مع برنامج المرتبطة المثبتة. ثم قم بتوصيل مطياف إلى مصباح معايرة التنغستن عن طريق الإرسال جيب التمام مصحح للأشعة فوق البنفسجية مرئية.
- حدد "جديد المطلق الإشعاع القياس" من علامة التبويب "ملف"، وحدد مطياف باسم "المصدر".
- اتبع المطالبات لإنشاء معايرة ملف "كال" الجديد. عند المطالبة، تحميل ملف البيانات المنصوص عليها ألوان الطيف المعروفة للمصباح معايرة التنغستن في نطاق الضوء المرئي (300-800 نانومتر) في البرنامج، الذي يحسب تلقائيا الطيف تصحيح من إخراج مطياف.
- حفظ ملف المعايرة. تحميل هذا الملف عند initializing البرنامج لجميع القياسات المستقبلية من الطيف الضوئي باستخدام مطياف.
- مرة واحدة يتم معايرة مطياف، استخدم هذا لتسجيل الطيف الضوئي من الإعداد التجريبية. الآخرة عند فتح البرنامج، حدد "جديد المطلق الإشعاع القياس" وتحميل ملف معايرة المحفوظة مسبقا. بجانب اتخاذ طائفة الظلام من خلال منع كل ضوء لطيف.
- مع مطياف قياس حاليا ظروف الإضاءة التجريبية المطلوبة، وضبط الوقت التكامل (4 مللي ثانية)، والمسح الضوئي للمتوسط (5)، وعرض عربة النقل (5)، لذلك يتم تحجيم بشكل صحيح الطيف وممهدة. الحفاظ على الإعدادات نفسها لجميع القياسات الطيفية، بحيث يمكن مقارنة ذلك شدة الضوء من قياسات مختلفة.
- قياس أطياف الضوء الأبيض ملوثا، لجميع مرشحات الكثافة محايدة لاستخدامها خلال التجارب، ولكل مرشح تدخل ممر الموجة (الشكل 2).
- مeasure ضوء الطيف الأبيض دون أي مرشحات في مسار الضوء من قبل الالصاق نهاية خالية من كابل الألياف البصرية من الخطوة 2.2.2 لطيف. مع ملف معايرة تحميل من الخطوة 2.3، حفظ طيف الضوء الأبيض باستخدام برنامج مطياف كملف نصي.
ملاحظة: حفظ الأطياف ك قائمة ملفات نصية الطول الموجي (خ الإحداثيات) في عمود واحد وشدة الضوء (ص الإحداثيات) في العمود الثاني، بحيث يمكن تحميل البيانات إلى جدول للخطوة 2.6. - باستخدام نفس الإعداد كخطوة 2.5.1، تسجيل الطيف من كل الكثافة الضوئية (OD) (0-3،5 OD) المستخدمة أثناء التجارب عن طريق تدوير الكثافة المحايدة (ND) مرشح عجلة في المسار البصري، وحفظ ملف نصي ل كل OD.
- باستخدام نفس الإعداد كخطوة 2.5.1، وضع 10 نانومتر نصف التدخل عرض النطاق الترددي مرشحات واحدا تلو الآخر في مسار الضوء وتسجيل الطيف الذي نراه لكل مرشح. كرر هذا الإجراء لكل من 41 مرشح التداخل مختلفة ثمتباعدة transmittances إيث ذروة كل 10 نانومتر 300-700 نانومتر. مرشحات متباعدة تباعدا (20 نانومتر) مقبولة بالنسبة لمعظم التطبيقات (لطيف، انظر الشكل 2).
- مeasure ضوء الطيف الأبيض دون أي مرشحات في مسار الضوء من قبل الالصاق نهاية خالية من كابل الألياف البصرية من الخطوة 2.2.2 لطيف. مع ملف معايرة تحميل من الخطوة 2.3، حفظ طيف الضوء الأبيض باستخدام برنامج مطياف كملف نصي.
- صحيح الاختلافات في شدة الضوء عندما توضع المرشحات تدخل في مسار الضوء. كل مرشح تدخل يسمح عدد مختلف من الفوتونات لتمرير، ونقل منخفضة من بعض المرشحات يجعل من الصعب على زيادة تخفيف كثافة حتى يتسنى لجميع المرشحات لتمكين أعداد متساوية من الفوتونات.
- لحساب الكثافة النسبية (I) لكل 10 نانومتر مرشح تدخل عرض النطاق الترددي، حل لأني في التعبير، وأنا = T / ثانية، حيث T هي المنطقة تحت المنحنى الطيفي لكل مرشح تدخل 10 نانومتر (من 2.5.3) والصورة هي الإشعاع المطلق القصوى (قيمة ص من ملف نصي حفظ من 2.5.1) من الضوء الأبيض في ذروة الموجة من كل مرشح (انظر الشكل 2 للحصول على مثال في 520 نانومتر).
- تقسيم كل كثافه تحسبالمنشأ من قيمة كثافة ماكس المحسوبة في 2.6.1 لتطبيع واحد، واتخاذ متبادلة من القيم تطبيع النسبية لاستخدامها كعامل تصحيح تطبيقها على حساسية الخام في كل طول موجي (انظر الخطوة 6.4).
- تنفيذ الخطوات 2.1 خلال 2.6 مرة واحدة فقط قبل مجموعة من التجارب. على مدار تجربة تسجيل دوري الإشعاع المطلق للمصباح قوس زينون تحت الضوء الساطع ومرشحات الكثافة محايدة، للتأكد من عدم تغيير شدة الحافز الضوء.
- خلال التجربة، إن وجدت استجابة الخلايا للضوء تنتقل عن طريق مرشح التداخل نهج الحد الأقصى لسعة الاستجابة استخدام المرشحات ND للتخفيف من إشارة. إذا تم استخدام المرشحات ND خلال التجربة، يعلل انخفاض مماثل في كثافة خلال حساب الحساسية الطيفية.
- إعداد مسار بصري، والمعايرة، والمرشحات أيام أو أسابيع قبل بدء التجارب. إبقاء المرشحاتمغطاة لمنع تراكم الغبار.
الإعداد 3. معدات تسجيل
- إطعام نفسه كابل الألياف البصرية المستخدمة في المعايرة من خلال قفص فاراداي وجبل على جهاز goniometric مثل محيط الذراع كاردان (انظر الشكل 3 لرسم بياني). سوف كابل أن يكون حوالي 10 سم بعيدا عن العين من العينة.
- ضع مرحلة المعدنية على طاولة منعزلة vibrationally مع حامل القطب شنت مباشرة فوق خشبة المسرح تحت السيطرة على micromanipulator (الشكل 4). وضع الذراع كاردان بحيث رئيس العينة هو في مركز المجال التي أنشأتها الحركة الدورانية للذراع.
- باستخدام نظام المضخم داخل الخلايا، والذي يتضمن مكبر للصوت (خارج قفص فاراداي) والمضخم (headstage، بالقرب من الإعدادية داخل قفص فاراداي) تركيب headstage فوق خشبة المسرح المعدنية حيث سيتم وضع العينة.
- توصيل الكابلات المحورية إلى headstage عبراتصال BNC. تقسيم مفتوحة سوى غيض على الطرف الآخر من كابل متحد المحور، وفصل غمد المعدن الخارجي للكابل من السلك الداخلي.
- لحام غمد الخارجي (حافظ على إمكانات الأرض) إلى نهاية واحدة من الأسلاك النحاسية المعزولة مع مقطع التمساح على الطرف الآخر. وهذا مقطع التمساح نعلق على القطب إشارة معدنية على منصة العينة (الخطوة 5.1.4).
- لحام السلك الداخلي من الكابلات المحورية لسلك فضة رقيقة، لتكون بمثابة القطب تسجيل. وينبغي أن يكون هذا السلك رقيقة بما يكفي لإدخالها في الزجاج الكهربائي مليئة حل في الخطوة 5.2.3.
- وضع مجهر تشريحي تعلق على ذراع يتأرجح وقاعدة على مقعد خشبي خارج قفص فاراداي، بحيث يمكن أن تتأرجح في خفض الكهربائي في العين، ووقفت إلى الوراء مرة أخرى الكهربائي في العين.
- تأكد من كل شيء المعدنية داخل يرتكز قفص فاراداي بشكل صحيح.
- خارج قفص فاراداي، إرفاق preamplifإيه للمدخلات من 50-60 هرتز الضوضاء المخفض (اختياري)، وربط مخرجات لقناة واحدة من الذبذبات باستخدام BNC T-محول.
- باستخدام الطرف الآخر من T-محول، قم بتوصيل الإشارات التي تمر عبر الذبذبات لقناة واحدة للأجهزة. إرفاق هذا الجهاز إلى جهاز الكمبيوتر عن طريق كابل USB، والتي سوف تسمح الردود المسجلة مع المضخم يمكن ان تقرأ من قبل البرامج على الكمبيوتر.
- إرفاق سائق مصراع من المسار البصري للقناة الثانية من الذبذبات باستخدام T-محول آخر، وربط هذا إلى مولد النبض التي من شأنها السيطرة على وتيرة ومدة ومضات ضوء تسليمها للعين (الخطوة 5.5).
ملاحظة: الإعداد للتلاعب نفسها يجب تحتاج فقط إلى أن يتم ذلك مرة واحدة. كسر هنا حتى على استعداد لبدء التسجيلات.
4. الإعدادية يوم تسجيل
- تشغيل مصباح زينون لا يقل عن 45 دقيقة قبل التجربة وتشغيل الزجاج مسرى مكروي مجتذب لا يقل عن 30 دقيقة قبل بولأقطاب الزجاج لينغ.
- تشغيل جميع المعدات تسجيل (مصراع الكاميرا، مكبر للصوت، مزيل الضوضاء، مولد النبض، والذبذبات، والحصول على البيانات الأجهزة) وتأكد من إغلاق مصراع افتراضيا حتى لا يمر الضوء من خلال كابل الألياف البصرية.
- سحب البورسليكات غرامة (أو ألومينوسيليكات) الميكروية الزجاج (100-250 المقاومة MΩ مثالية) باستخدام مجتذب الزجاج مسرى مكروي. استخدام أقطاب الزجاج داخل سوى ساعة قليلة من يتم سحبها.
- الردم الأقطاب مع 3 M البوتاسيوم كلوريد (بوكل). لاحظ أن هذا الحل يمكن تعديلها وفقا لاحتياجات الباحث، مثل صبغ الحقن.
5. عينة الإعدادية وإجراءات تسجيل
- إعداد العينات
- يلصق على فراشة الفردية داخل أنبوب صغير من البلاستيك مع الشمع الساخن حتى الرأس غير متحرك وجاحظ واحدة من نهاية الأنبوب. الشمع أسفل خرطوم، وهوائيات، وأجنحة (الشكل 5).
- اضغط باستمرار رانه البطن بقطعة جافة من الشمع والحفاظ على أنبوب مرطب قبل وضع منديل مبللة داخل الأنبوب وراء البطن. تأكد من أن العينة هي قادرة على الحركة تماما.
- تركيب أنبوب باستخدام قطعة صغيرة من الشمع على منصة صغيرة مع كرة مشتركة والمقبس التي يتم تركيبها على قاعدة مغناطيسية.
- تشريح تحت المجهر، اضافة الى وجود أسلاك الفضة قطرها 0.125 ملم في الرأس عن طريق فمها لاستخدامها القطب المرجعية. قبل التجربة، إصلاح دائم السلك إلى منصة في مثل هذه الطريقة التي الأسلاك النحاسية في الخطوة 3.3.2 قد مقطع على لمرة واحدة يتم وضع منصة على المسرح للتسجيل.
- مرة واحدة في القطب المرجعي هو في وضع مناسب قد يكون الاحتفاظ بها في مكان ذوبان بسرعة ثم التبريد الشمع حول السلك.
- باستخدام كسر الكربون الصلب شفرة حلاقة، وقبضة جزء من شفرة مع حامل شفرة وقطع قطعة صغيرة لاستخدامها لقطع القرنية.
- قطع ثقب صغير (~ 10 ommatidiوفي القطر) في القرنية اليسار باستخدام razorblade واغلاق فتحة مع الفازلين لمنع جفاف.
- مرة واحدة يتم قطع القرنية، إدراج القطب تسجيل في العين بأسرع وقت ممكن لأن الدملمف في العين سوف تتصلب بسرعة ويجعل من المستحيل لإدراج الكهربائي. إذا كان ذلك ممكنا إجراء تشريح في تلاعب فيها تسجيل ستجرى.
ملاحظة: يجب أن لا يكون لطخت الفازلين على بقية العين لأن ذلك سوف يزيل التباؤر البصريات.- إن لم يكن بالفعل على المسرح، ضع العينة التي شنت ومنصة على خشبة المسرح في تلاعب تسجيل. قم بتوصيل سلك الأرض headstage من الخطوة 3.3.2 إلى القطب إشارة على منصة العينة باستخدام مقاطع التمساح.
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا استخدام عامل تصفية الأحمر لإلقاء الضوء على الحيوان. - استخدام مصدر الضوء مع المرفقات معقوفة للضوء لفترة وجيزة العينة تحت المجسام في حين خفض القطب تسجيل في العين.
- فيسرت سلك الفضة متصلا headstage من الخطوة 3.3.3 في حل بوكل في الجزء الخلفي من مسرى مكروي الزجاج. تركيب الزجاج الكهربائي على حامل الكهربائي.
- ضبط حامل الكهربائي حتى مسرى مكروي مباشرة فوق الحفرة خفض سابقا في القرنية، عن المليمتر فوق القرنية. خفض مسرى مكروي في العين باستخدام micromanipulator حتى اكتمال الدائرة، كما يتضح من تغيير كبير في المحتملة (السيارات) على الذبذبات.
- إن لم يكن بالفعل على المسرح، ضع العينة التي شنت ومنصة على خشبة المسرح في تلاعب تسجيل. قم بتوصيل سلك الأرض headstage من الخطوة 3.3.2 إلى القطب إشارة على منصة العينة باستخدام مقاطع التمساح.
- مرة واحدة في العين، والتأرجح المجسام خارج قفص فاراداي، وإيقاف مصدر الضوء إلقاء الضوء على العينة. يجب أن تبقى في غرفة مظلمة حتى تصبح العين الظلام تكييفها.
- تحقق المقاومة من القطب عن طريق تطبيق 1 غ الحالية من مكبر للصوت ويلاحظ التغير في التيار الكهربائي. يجب أن تكون المقاومة عادة في نطاق بين 100-250 MΩ. المقاومة أعلى تدل على انسداد أو الانحناء من القطب، ومقاومة منخفضة من إلكترونياتالكسر قصيدة.
- تفعيل مولد النبض حتى يفتح مصراع السماح ومضة من الضوء مع 50 ميللي ثانية مدة كل 0.5 ثانية، والسماح لها بمواصلة امض لمدة التجربة.
- ضبط مولد النبض لذلك يسمح مضات تصل إلى 50 ميللي ثانية مدتها. هذه المدة وقفة 0.5 ثانية بين ومضات تحافظ على عينة أقرب إلى الظلام تكييفها ممكن خلال التجربة. خمسين ميللي ثانية على مقربة من مدة فلاش أقصر من شأنها أن تثير نفس السعة في استجابة كما مدد فلاش أطول.
- ردود إعادة التدبير في بداية ونهاية التجربة (الخطوة 5.16). على مدار نحو تجربة عشرين دقيقة، وهذه إعدادات الفلاش لا تتحلل وردا على مر الزمن. قد تتطلب محضرات مختلفة تعديلات على إعدادات الفلاش هذه.
- وضع الذراع كاردان بحيث يتم توجيه كابل الألياف الضوئية باتجاه العين.
- تحقق الذبذبات لتغيير الجهد مع كل ومضة ضوء.تغيير سلبي في الجهد يدل على أن القطب لم يدخل بعد خلية.
- نقل ذراع كاردان حول العينة حتى يتم وضعه في زاوية العين التي هناك استجابة الجهد القصوى.
- تدوير micromanipulator ذهابا وإيابا، مما تسبب في حركات صغيرة جدا العمودي من القطب في كلا الاتجاهين، بينما التنصت بخفة قاعدة حامل الكهربائي أو باستخدام وظيفة الطنين على المضخم. مواصلة إجراء تعديلات صغيرة حتى تظهر استجابة ضوء depolarizing على الذبذبات (الشكل 6).
- ضبط ذراع كاردان مرة أخرى للعثور على زاوية السقوط حيث ومضة من الضوء تنتج أكبر إشارة depolarizing. إجراء تعديلات صغيرة مع micromanipulator واستخدام وظيفة الطنين على مكبر للصوت حسب الحاجة للتأكد من أن القطب هو تسجيل ثابت الخلية، وأنه سوف يبقى في الخلية للتجربة كلها (راجع الخطوة 5.11).
- وبمجرد أن الإعداد هو مستقر، تبدأ ريكوrding. وينبغي أن يكون تسجيل مستقر قليلا إلى أي تغيير في وضع الراحة، وانخفاض الضوضاء الخلفية، واستجابة depolarizing كبيرة باستمرار (على الأقل 10: إشارة 1 إلى نسبة الضوضاء).
- تشغيل البرنامج على جهاز الكمبيوتر، والبدء في "تجربة جديدة"، والتي ستفتح لك نافذة منبثقة مع أربع قنوات.
- ضبط مقياس الجهد في الزاوية اليمنى العليا من نافذة البرنامج إلى 500 فولت. فإن القناة الأولى عرض الردود المسجلة من القطب في الوقت الحقيقي، في حين أن القناة الثانية سوف يسجل موجة مربع التي تنتجها المولدات وظيفة، إذا تم تغذية إشارة إلى الأجهزة الحصول على البيانات عن طريق الذبذبات، والتي تبين عندما مصراع مفتوح . القناتين الأخرى غير الضرورية.
- انقر على "ابدأ" في أسفل الزاوية اليمنى لبدء التسجيل، والسماح لبرنامج لتشغيل لمدة التجربة. ضبط التكبير من س (الوقت) و y (الجهد) محاور بحيث ردود واضحة.
- أولا، مع الضوء الأبيض، وتسجيل ما يصل إلى 10 الاستجابات الفردية مع عجلة تصفية ND بنسبة 3.5 OD (حوالي 5-10 ثانية).
- السجل التالي في نفس العدد من الردود على 3.3 OD، ثم 3.1، 3.0، 2.5، 2.3، 2.1، الخ في كل مجموعة حتى 0.0 OD. وهذه سعة ردا على سلسلة فلتر ND توفر منحنى شدة استجابة تسجيل في القسم 6. في حالة حدوث التبييض، واستخدام ومضات أقل من المحفزات مشرق أثناء التجربة.
- تسجيل استجابة الخلية لجميع الأطوال الموجية، وذلك باستخدام مرشح التداخل.
- العثور على أول ذروة الموجة. بدون فلاتر ND في مسار الضوء (0.0 OD)، وضع فلتر الأشعة فوق البنفسجية الإرسال في مسار الضوء لفترة وجيزة مراقبة السعة استجابة. كرر مع فلتر الأزرق الإرسال، وهو مرشح يحيل الأخضر، ومرشح يحيل الأحمر، والتي يجب أن تعطي فكرة عن المكان الاستجابة الذروة سيكون.
- استخدام الفلاتر في حوالي 350، 450، 550، 650 نانومتر للعثور على المنطقة العامة للذروة الحساسية فيخطوة 5.14.1. الطول الموجي المحدد لا يهم في هذه المرحلة البحث الأولية أنه سيتم تسجيل جميع الأطوال الموجية في الخطوة التالية. في حالة وجود تقديرات الحساسيات الذروة، أو أنها قد سجلت سابقا، استخدام معروف الأطوال الموجية للتعرف بسرعة الاستجابة الذروة.
- وبمجرد أن استجابة الذروة أو يتم التعرف على مقربة منه، وسجل في هذا الطول الموجي لمدة 10 الردود (حوالي 5 ثانية).
- بعد أن سجلت في الطول الموجي للالذروة ردا على ذلك، سجل مع مرشح التداخل أخرى، 300-700 نانومتر في 10 خطوات نانومتر. نبدأ من القمة والخروج تجاه كل من الأطوال الموجية أقصر وأطول عن طريق مبادلة المرشحات الخروج من مسار الضوء واحدا تلو الآخر (على سبيل المثال إذا كان الرد هو ذروة عند 520 نانومتر، والاستجابات سجل في هذه الموجة الأولى، ثم 510 نانومتر، تليها 530 نانومتر و 500 نانومتر، 540 نانومتر و 490 نانومتر و 550 نانومتر، وهلم جرا حتى لا يكون هناك أي رد).
- السماح لمدة تصل إلى 10 الردود في فلتر (5 ثانية لكل منهما). عندما مبادلة مرشح التداخل، والسماح للخلية لالتنأندو إلى 1-2 ومضات من الضوء الأبيض بدون أي مرشح في مسار الضوء، وهو أمر مفيد لمراقبة ما إذا كان الرد الذروة يسبب تدهورا مع مرور الوقت. تقليل عدد الردود أو زيادة OD في حالة حدوث التبييض.
- وإذا كانت الاستجابة تحت أي مرشح تدخل هي قريبة جدا من الحد الأقصى للاستجابة تحت الضوء الأبيض في 0 OD، ثم تخفف مع مرشحات ND. المرشحات تدخل وحجم كابل الألياف البصرية المستخدمة في هذه التجربة تخفف كثيرا من شدة الضوء وذلك عادة لا تحتاج المرشحات الثانية.
- إذا بقي تسجيل مستقرة، إعادة تسجيل موجات في جميع أنحاء استجابة الذروة، والتي هي بمثابة pseudoreplicate لتأكيد سعة استجابة السابقة، ويساعد على ضمان الاستجابة لم تتدهور مع مرور الوقت. مرة واحدة يتم تسجيل جميع الأطوال الموجية، وإعادة السجلات الاستجابات تحت سلسلة ND، كما في الخطوة 5.12.
- مرة واحدة تسجيل هو نقرة والكامل "وقف" على البرنامج، وحفظ تسجيل لتحليلها.
- بعد تجربة، تضحية الفرد من خلال تجميد أو تبريد لعدة دقائق تليها قطع بسرعة الرأس وسحق الصدر.
- إيقاف تشغيل كافة المعدات. كسر هنا إذا لزم الأمر قبل القيام التحليل.
6. الطيفي تحليل الحساسية
- مع البرمجيات المستخدمة لتسجيل استجابات الخام، حساب السعة استجابة متوسط من 10 الردود الفردية لكل مرشح في سلسلة ND ولكل مرشح تدخل.
- إنشاء كثافة وظيفة استجابة تسجيل (VlogI) من سلسلة فلتر ND المسجلة في خطوات 5،12-5،13 (الشكل 7). القيام بذلك عن طريق التآمر وحدات سجل من شدة (OD) على المحور العاشر، واستجابة لكل شدة على المحور الصادي.
- لاستخلاص حساسية الطيفية للخلية عند أطوال موجية مختلفة، تناسب عادة المعادلة ناكا-راشتون إلى البيانات من الخطوة 6.2، واستخدام هذه المعادلة لربط الردود الطيفية التي تم الحصول عليها تجريبيا من موجات مختلفة رس الفوتونات النسبية المطلوبة للحصول هذا الرد في إطار الطول الموجي ثابت (في هذه الحالة الضوء الأبيض).
ملاحظة: المعادلة ناكا-راشتون هي: V / V الحد الأقصى = أنا ن / (أنا ن + K ن)، حيث I هي شدة التحفيز، والخامس هو السعة ردا على ذلك، V الحد الأقصى هو الحد الأقصى لسعة ردا على ذلك، K هو التحفيز كثافة إعطاء نصف الخامس كحد أقصى، و n هو المنحدر الأسي. طرق مختلفة يمكن استخدامها لتتناسب مع هذه المعادلة إلى البيانات VlogI، بما في ذلك منحنى البرنامج المناسب، أو الحزم الإحصائية القائمة على التعليمات البرمجية. - لتناسب المعادلة ناكا-راشتون باستخدام العمليات الحسابية البسيطة وبرنامج جداول البيانات، وتحويل البيانات استجابة VlogI لكل كثافة التحفيز: تسجيل [(V ماكس / V) - 1]. ثم نفذ الانحدار الخطي على البيانات المحولة للحصول على معادلة خط أفضل مناسبا.
يجب أن يكون V ماكس أكبر من أي ردود قياسها. ملاحظة: للحفاظ على هذا متناسقة، ويقدر هذا الأسلوب الخامس كحد أقصى من 1٪ GREالعاطر من أعلى استجابة مدروسة. - من معادلة خط الانحدار، وتقدير الأس (ن) عن طريق أخذ الانحدار السلبي، وسجل (K) = التقاطع y / ن.
- لاستخلاص حساسية الطيفية للخلية عند أطوال موجية مختلفة، تناسب عادة المعادلة ناكا-راشتون إلى البيانات من الخطوة 6.2، واستخدام هذه المعادلة لربط الردود الطيفية التي تم الحصول عليها تجريبيا من موجات مختلفة رس الفوتونات النسبية المطلوبة للحصول هذا الرد في إطار الطول الموجي ثابت (في هذه الحالة الضوء الأبيض).
- مرة واحدة المعلمات ل V ماكس، ن، وK تم تقدير، وتحديد العدد النسبي للفوتونات المطلوبة للحصول على الاستجابة الطيفية للخلية في كل طول موجي عن طريق توصيل في الاستجابة الطيفية يقاس عند طول موجي معين كما (V) وحل لI.
- مضاعفة كثافة التحفيز حساب (I) من الخطوة 6.3 من معامل التصحيح لكل مرشح تدخل (من الخطوة 2.4.3) في كل الطول الموجي.
- للحصول على حساسية، كل شدة يجب أن تكون متصلة V منحنى سجل-I بحيث يمكن مقارنة. القيام بذلك عن طريق المتعلقة بكل شدة الموجة الى نصف الخامس كحد أقصى أو K، المحسوبة في الخطوة 6.2.3.
- طرح كل شدة الطول الموجي تصحيح (الخطوة 6.4) من ك.
- ثم لكل شدة الطول الموجي، إضافة هذا "المسافة من قيمة K "لK، وضرب من قبل (-1).
- بجانب جمع كل نقاط البيانات الإيجابية عن طريق إضافة قيمة مطلقة من أدنى نقطة بيانات في سلسلة لكل طول موجي.
- البحث عن حساسية في كل الطول الموجي من خلال اتخاذ متبادلة من كل شدة حساب حديثا من الخطوة 6.5.1. تحويل البيانات بحيث يقع الطيف حساسية بين 0 و 1.
- بعد تسجيل من أكثر من خلية واحدة من نفس النوع المتوسط الردود النهائية ومؤامرة مع أشرطة الخطأ القياسية أو فترات الثقة 95٪ (الشكل 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بالنسبة لكثير من عناصر الإعداد التسجيل، وصفا مكتوبا لا توفر ما يكفي من التفاصيل. الشكل رقم 1 هو التخطيطي من المكونات الداخلة في الإعداد التسجيل الكامل. في الشكل 2، يتم رسم أطياف الضوء الأبيض وكل مرشح التدخل لإعطاء معنى لماذا هناك حاجة إلى معامل التصحيح، وما هو مطلوب لحساب هذا التصحيح. ويبين الشكل 3 صورة ورسما تخطيطيا للذراع كاردان الذي يتم استخدامه لهذه التجارب. الرقم 4 هو صورة مركبة تظهر مرحلة التسجيل وmicromanipulator. ويبين الشكل 5 عدة خطوات في إعداد فراشة للتجربة.
وبمجرد أن يبدأ تسجيل، تغيير سلبي في الجهد ردا على ضوء فلاش يعني أن القطب هو خارج الخلية، كما في الشكل 6A. قوة استجابة تعتمد على القرب من القطبتلميح إلى خلية مستقبلة للضوء، وزاوية السقوط من ومضة ضوء. يجب أن تكون الاستجابة كبيرة (> 30 فولت) قبل طرف قريب بما فيه الكفاية إلى خلية أسعد الشكل 6B يدل على الاستجابة depolarizing واضحة لحافز الضوء، مما يدل على دخول خلية مستقبلة للضوء. وينبغي أن تكون إمكانات يستريح مستقر ويجب أن تكون السعة استجابة كبيرة (لا يقل عن 40 فولت)، على الرغم من أن السعة المطلقة قد تختلف إلى حد كبير. نقيس استجابة نسبية، لذلك هو أكثر أهمية أن إشارة إلى نسبة الضوضاء عالية. إذا كان يستريح التغيرات المحتملة إلى حد كبير، الموجي استجابة يبدو غير عادي، أو الحد الأقصى للاستجابة منخفض جدا، ثم مقارنة استجابات النسبية في جميع المرشحات تدخل تصبح مستحيلة. وترد أمثلة من التسجيلات غير صالحة للاستعمال في الشكل 6C، 6D.
بعد الانتهاء من تسجيل ناجحة، يجب أن تآمر الردود ND والمعادلة ناكا-راشتون يجب تركيبها على بيانات 33، قhown في الشكل 7. يتم رسم هذا الرقم باستخدام ND فلتر سلسلة بدون أي مرشح التداخل. إذا كان تسجيل مستقرة، يجب أن تكون البيانات من سلسلة فلتر ND مماثل قبل وبعد التجربة. يتم تحديد حساسية الطيفية عن طريق تركيب المعادلة ناكا-راشتون إلى مؤامرة VlogI في الشكل 7، ثم حل ل(I) لكل إجابة (V) في طول موجة معين، كما هو موضح في حسابات المادة 6 من البروتوكول.
يتم رسم مثال ممثل الحساسية الطيفية المستمدة من تسجيل واحد في الشكل 8A (يرجى ملاحظة هذا المثال يوضح البيانات المحسوبة حقيقية، ولكن تم نقل ذروة لأن هذا نتيجة غير منشورة). ويمكن تصنيف أنواع الخلايا التي كتبها ذروة الحساسية في طول موجة مماثلة، والشكل العام للالطيف حساسية. ثم وبلغ متوسط أنواع الخلايا مماثلة ويتم رسم حساسية يعني مع أشرطة الخطأ القياسية في كل طول موجي في فيقوإعادة 8B. وتظهر الحساسيات الطيفية من ثلاثة أنواع الخلايا نموذجية وجدت في حشرة في الشكل 8C (تحسب حجم والخطأ القضبان من بيانات حقيقية، ولكنها تحولت قمم).
الشكل 1: رسم تخطيطي للتسجيل مكونات مكونات مسار الضوء، عينة الإعداد، وتسجيل الأجهزة مبينة. المسار البصري يجلس على مقعد خشبي خارج قفص فاراداي. اكس، زينون مصباح قوس والكادميوم، والتجمع المكثف، LX، عدسة محدبة، ND، محايدة عجلة تصفية الكثافة، CF، مرشح تدخل، S، مصراع الكاميرا، وقانون العمل، عدسة مقعرة، شركة ، الموازاة شعاع التحقيق، للحصول على والألياف البصرية كابل. قفص فاراداي يجلس علىمقعد خشبي حول العينة. على مقعد خشبي يجلس أعلاه ولكن لا تلمس طاولة الرخام معزولة vibrationally تحتها. تسجيل (الصليب الأحمر) والمرجعية المرفقة (RF) الأقطاب الكهربائية إلى headstage (HS). وقدم الصليب الأحمر في العين (E) ويتم إدخال الترددات اللاسلكية في جزء آخر من الجسم. وheadstage هو جزء من الإعداد المضخم (باسكال) خارج قفص فاراداي. يتم تمرير الإشارة من المضخم من خلال الضوضاء المخفض الخدعة (الهيموغلوبين)، وإلى الذبذبات (OS). من الذبذبات يتم تمرير إشارة من خلال الأجهزة Powerlab (PLB) وإلى جهاز كمبيوتر محمول (CPU) حيث يتم قراءتها بواسطة برنامج Labchart. يتم التحكم في مصراع بواسطة مولد وظيفة (FG) التي يتم تمريرها من خلال القناة الثانية على الذبذبات، ويمكن أن تنتقل أيضا من خلال القناة الثانية على الأجهزة Powerlab إذا كان هذا إشارة سوف يتم تسجيلها أيضا.
الشكل 2: الضوء الأبيض والتدخل تصفية الأطياف المستخدمة فى حساب العوامل تصحيح الأطياف يقاس في الخطوة 2.5 من البروتوكول ترد 300-700 نانومتر، على ضوء أبيض، وكذلك كل من مرشح التداخل 41. يتم قياس كل الطيف مرشح تدخل فقط مع هذا الفلتر في مسار الضوء. تي 520 يتوافق مع المنطقة تحت الطيف للمرشح مع ذروة 520 نانومتر، وق 520 يتوافق مع شدة الضوء الأبيض في ذروة الموجة من مرشح، 520 نانومتر. يتم استخدام هذه القيم في حساب عوامل التصحيح لكل مرشح (في هذه الحالة 520 نانومتر) كما هو موضح في الخطوة 2.6 في البروتوكول.
الصفحة = "1"> 
الشكل (3): وصف الذراع محيط كاردان المستخدمة في التجارب يحمل الذراع كاردان كابل الألياف البصرية، ويسمح دوران كروية كاملة وتعديل زاوية بحيث ضوء يمكن تسليمها في الزاوية المناسبة من الإصابة إلى الخلية يتم تسجيلها. (A) من أعلى لأسفل. (ب) عرض من الجانب في زاوية. الأرقام تتوافق مع نفس الجزء في كل اللوحات. (1) لوحة أسفل يسمح بدورة دائرية كاملة في المستوى الأفقي. (2) لوحة رأسية يسمح دوران دائري كامل للذراع في الطائرة العمودية. (3) هذه الاسطوانة تحمل ذراع معدنية مع كابل الألياف الضوئية في نهاية المطاف، وأنه يسمح للطائرة العمودية الثانية من دوران دائري عمودي على (2). (4) ويقام كابل الألياف البصرية طويوجه مكان ن في نهاية الذراع، والضوء نحو موقع العينة في الإعداد التجريبية.
الرقم 4: مكونات الإعداد تسجيل (A) أنبوب بلاستيك تستخدم لعقد العينة. (ب) عرض العلوية من المنصة التي هي التي شنت على عينة وأنبوب. (ج) الجانب الشخصي من منصة الكرة ومشتركة مع قاعدة مغناطيسية (1). تبقى الإشارة القطب متحرك مع الغراء والشمع على جانب من منصة (2). إشارة القطب ملفوفة حول مقطع التمساح وملحوم في مكان، وتوفير مساحة المرفق حيث القطب headstage إشارة يمكن كليب (3). (D) الكهربائي طرف تحت 20X التكبير. شريط النطاق، 25 ميكرون. (E) المرحلة، حامل الكهربائي، وإعداد micromanipulator. يتم إصلاح headstage (1) أعلاه الجهاز معسلك تسجيل الفضة (2)، والقطب المرجعية مع مقطع التمساح (3) المرفقة. يتم إصلاح حامل الكهربائي (4) إلى micromanipulator اليدوي (5) مع وظيفة أدناه التي يمكن تعديلها مع مقبض للحركة الرأسية أو قد تكون دفعت أو سحبت لحركة أفقية للحامل الكهربائي. منصة المغناطيسية مع عينة يجلس على المسرح (6) أسفل حامل الكهربائي. (F) وقفص فاراداي يحيط الإعداد تسجيل مع الشاشة التي يمكن سحبها لأعلى أو لأسفل في الجبهة. يتم وضع رقائق الألومنيوم تحت جميع المعدات مع منصات المطاط على القمة. كابل الألياف الضوئية (1) يؤدي إلى القفص من المسار البصري خارج، وإخراج الذراع كاردان (2) نحو المرحلة (3). يتم وضع جهاز مرحلة التسجيل وتتلاعب في صندوق الرمل (4) يستريح على طاولة الرخام تحت الإعداد. جميع المعدات الأخرى تقع على رأس مقعد خشبي لا تلمس الطاولة من الرخام. يجلس مربع الرمل على أعلى الجدول الرخام في حفرةقطع من طاولة خشبية، بحيث يتم عزل تماما العينة vibrationally من المعدات على سطح الطاولة الخشبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (5): يتم إدخال الفراشة الإعدادية (أ) فراشة في أنبوب والرأس والأجنحة، وثبتوا هوائيات مع الشمع الساخن. يتم إدخال إلكترود غير مبال في فمها (1)، ويستخدم قطعة من الشمع الجاف إلى الاستمرار على البطن (2)، ويتم وضع منديل مبللة وراء العينة. (ب) عن قرب الرأس مشمع أسفل. العين ليتم تسجيلها من (1) تحفظ واضح من الشمع أو الحطام، ويتم إدراج القطب المرجعية (2) في فمها وذاب الشمع الساخن بسرعة أكثر من ذلك لإبقائه في مكانه.(C) ثقب قطع في العين حيث يمكن رؤية طبقة الخلايا المستقبلة للضوء الوردي والأبيض. الصباغ الأسود والأصفر الدملمف غائبة. (D) عرض جانبي للعينة مع القطب تسجيل زجاج (1) وضعت في العين، والقطب غير مبال (2) الملحق المرحلة الرأس، والتي يجب إكمال الدائرة كما رأينا على الذبذبات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6: الردود الخام من تسجيلات عينة يتوافق مع كل ردا على ضوء فلاش واحد من 50 ميللي ثانية مدتها (أشرطة سوداء). (أ) مثال على تغيير الجهد السلبي الكبير الذي ينبغي أن ينظر إليه فقطقبل الدخول في الخلية. يجب أن يكون (ب) تسجيل نظيف القليل من الضوضاء في الخلفية واستجابة depolarizing كبيرة، وعادة ما لا يقل عن 40 فولت. (C) مثال على تسجيل الفقراء بسبب التغير السلبي المحتمل بعد ذروة الرئيسي (السهام). (D) مثال آخر لتسجيل سيئة. إمكانات يستريح تشهد تقلبات كبيرة (شريط أحمر) وكمية كبيرة من الضوضاء في الخلفية يمكن أن يحجب اتساع استجابة (رأس السهم).
الرقم 7: استجابة الحدة دخول الخطية وظيفة الدوائر الصلبة تظهر الردود يقاس من خلية 3،5-0 OD، لهذا الإعداد التجريبية. كثافة الضوء على مقياس لوغاريتمي. في كثافة عالية جدا تشبع ردا على ذلك، وعلى شدة منخفضة جدا لا يزال قائما استجابة صغيرة بدلا من اسقاط إلى الصفر على طول الخط. تانه ناكا-راشتون المعادلة 33 غير المجهزة لهذا الشكل غير الخطية (الخط المنقط).
تم احتساب الحساسية الطيفية أمثلة (A) وسجلت ردود خلية تمثيلية واحدة والحساسية الطيفية النسبية: الرقم 8. ذروة هذه الخلية في 440 نانومتر، وهذا يعني أنه يستجيب أفضل للضوء الأزرق. قد تبدو البيانات خلية واحدة صاخبة (الذروة في 380 نانومتر). وبلغ متوسط (ب) الخلايا مع نفس الذروة وشكل النسبية معا وتضاف أشرطة الخطأ القياسية. هنا، وبلغ متوسط سبع خلايا زرقاء من سبعة الأفراد الذين يقدمون دليلا قويا على أن نوع الخلية موجود في هذه الأنواع الحساسة الحد الأقصى للضوء في 440 نانومتر. (C) وهذه العملية يمكن أن تتكرر لجميع أنواع الخلايا الموجودة، وتآمر معا. عيون الحشرات تختلف على نطاق واسع في حساسيتهم الطيفية ولكن الإضافية النموذجيةقد يكون إلخ القمم هو موضح هنا، في 370 نانومتر و 440 نانومتر، و 510 نانومتر. ملاحظة، وتحسب هذه الحساسيات الطيفية كل باستخدام بيانات حقيقية، ولكن تم نقل القمم لأن البيانات لم تنشر بعد لهذا النوع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تسجيل داخل الخلايا يمكن أن تكون تقنية صعبة لإتقان بسبب العديد من الخطوات التقنية المعنية. للتجارب ناجحة يجب أخذها بعين الاعتبار عدة نقاط هامة. أولا، من المهم أن يكون لديك جدول صحيح vibrationally معزولة التي يتم تنفيذ التجربة. استخدام العديد من الباحثين الجداول الهواء التي تفصل تماما الطاولة من القاعدة، وإعطاء متفوقة عزل الاهتزاز. الإعداد لدينا ينطوي على طاولة الرخام السميك مع رمل على القمة، حيث يتم وضع جهاز مرحلة micromanipulator / حامل الكهربائي / عينة. هذا هو بديل فعال وأكثر بأسعار معقولة إلى جدول الهواء، خاصة إذا كان الحصول على الغاز في المنزل أو الهواء المضغوط وجود قيود. يجوز اتخاذ تدابير إضافية لامتصاص الاهتزازات مثل نظام التعليق الهوائي السلبي، أو إضافة عناصر توسيد للأرجل الطاولة (على سبيل المثال، فتح كرات التنس، وأنابيب الدراجة، ومنصات هلام سميكة). وعلاوة على ذلك، فمن الضروري أن يكون الإعداد التجريبية داخلقفص فاراداي مع كل شيء أسس سليمة. يجب أن يكون قفص فاراداي شاشة شبكة معدنية في الجبهة التي يمكن إزالتها عند العمل داخل القفص واستبدالها بسهولة عند التسجيل. حتى كمية صغيرة من الضجيج الكهربائي المحيط (خصوصا 50 الضوضاء هرتز من التيار المتردد التيار الكهربائي الرئيسي) يمكن أن تجعل تسجيلا جيدة على خلاف ذلك غير صالحة للاستعمال.
عند إعداد العينة، الدملمف والصباغ الطبقات المحيطة ommatidia قد منع التسجيلات الناجحة. إذا تم قطع ثقب في القرنية كبيرة جدا، ضخ العادي من الدملمف في الجسم يسبب سطح السائل لتتحرك صعودا وهبوطا في موقع قطع، مما أدى إلى تسجيل غير مستقر. مرة واحدة يتم قطع حفرة، والدملمف وسطح طبقات الصباغ تجلط بسرعة إلى جرب اختراقها حتى عندما مختومة مع الفازلين، ولذلك فمن المهم أن يحصل الكهربائي في العين في أقرب وقت ممكن. ويمكن أيضا أن تستخدم حل قارع الأجراس بدلا من الفازلين. قد تكون أدخلت القطب الأرض فيفمها أو إلى جذع هوائي قطع.
بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما يكون مفيدا للحفاظ على الحيوانات كما داكنة تكييفها ممكن. لهذا الأسلوب، خطوات تشمل الحفاظ على غرفة تسجيل مظلمة جدا، ومنع الضوء الشارد من مصباح زينون من دخول قفص فاراداي، ومضات التحفيز قصيرة المدة (30-50 مللي ثانية)، وانخفاض وتيرة كافية بين ومضات (0.5 أو أعلى). عندما يمتص الصباغ البصرية الفوتون، حامل اللون في رودوبسين مفاتيح من 11- رابطة الدول المستقلة -3-hydroxyretinal لجميع - عبر -retinal، الأمر الذي أدى إلى تغيير متعلق بتكوين البروتين أوبسين، وتفعيل المجمع بأكمله كما ميتارودوبسين، الذي يبدأ بروتين G تتالي. يحدث الصور وتبييض عندما يؤدي ارتفاع شدة الضوء حامل اللون لفصل جسديا من البروتين أوبسين. الوقت هو العامل المحدد في هذه التجربة لأن القطب سوف يسجل فقط مستقر ردود من داخل الخلية لفترة معينة من الوقت قبل أن يخرجأو الغشاء تلف. لهذا السبب نحن لا كسر للسماح للخلايا لاسترداد، ولكن نحن لا تستخدم لمدة الفلاش وتردد أن وجدنا لا تتحلل استجابة الخلية على مر الزمن. من المهم أن ينخفض تواتر وشدة الضوء في حالة حدوث الصور التبييض.
أثناء التسجيل، وهي غيض القطب كبير أو حركة كبيرة من قبل القطب قد يؤدي إلى تلف الخلايا عندما تخترق الغشاء. فقط نصائح الجميلة (ما لا يقل عن 100 ~ MΩ) وحركات صغيرة وينبغي أن تستخدم عندما تقترب من خلية للتسجيل. إذا تم تطبيق تسجيل داخل الخلايا لتطبيقات أخرى، مثل التسجيلات الدماغ، قد يتم سحبها غرامة للغاية، كهربائي قوي باستخدام زجاج الكوارتز، ولكن يجب استخدامه مجتذب متخصص لهذه الأقطاب. عند اتخاذ أول إلكترود سحب البرنامج، ونحن إيداعه المقاومة غيض من الردم القطب، وتأمين لحامل الكهربائي في إعداد وهمية، ووضع طرف والقطب الأرض في محلول ملحي. Nتحويلة طبقنا تيار لقياس التغير في الجهد على الذبذبات. لنقل معلومات سرية القطب نستخدم micromanipulator اليدوي الذي يتحرك على محورين. وجود المتلاعبين الآخرين بما في ذلك تلك التي الرقمية التي تسمح حركة على طول كل المحاور الثلاثة وأنها يمكن أن تستخدم لهذا أو أكثر تعقيدا التطبيقات. هناك العديد من الطرق لبناء المرحلة للتسجيل، وهناك العديد من أنواع مختلفة من الأجهزة والبرمجيات المستخدمة في تسجيل وتحليل البيانات المرصودة. يمثل الإعداد الإعداد لدينا واحدة بسيطة وسهلة، وبأسعار معقولة للتلاعب تسجيل.
في بناء منحنى VlogI، وظائف وضعتها ناكا وراشتون 33 وغيرها 34،35 حساب للأجزاء غير الخطية من الردود المرسومة. وتستخدم أساليب مختلفة لتناسب هذا المنحنى إلى البيانات، ونحن تآمر نتائج هذا أسلوب واحد لا تتطلب برامج تركيب منحنى، على الرغم من أساليب أخرى هي أيضا مناسبة 36،37 (
واحد الحد من هذه الطريقة أنه إذا كان الكائن دراسة يعبر عن أكثر من واحد أوبسين مماثل وراثيا في العين، فإنه يمكن أن يكون من الصعب تحديد أي أوبسين المرجح يتوافق مرنا إلى أي فئة الطيفية للخلية مستقبلة للضوء. للتغلب على هذه المشكلة، تم الجمع بين هذه الطريقة مع صبغ الحقن و التهجين أو المناعية للتعرف على opsins بنجاح في المعبر عنها في خلايا سجلت 10.
لدينا وسيلة بسيطة ويمكن الوصول إليها للباحثين غير مألوف مع الكهربية البصرية. هذا الأسلوب هو أمر شائع في علم الأعصاب، ولكن محددة وأساليب واضحة غائبة في الأدب، مما يجعل هذه الطريقة يصعب استنساخها. على الرغم من أن العديد من الاختلافات من هذه التقنية موجودة، ونحن نقدم طريقة مباشرة لقياس حساسية الطيفية في مجمع العين. البيانات الفسيولوجية هو جزء مهم من الأدلة في قصص البيئة البصرية وتطور 41. يرتبط أوبسين تسلسل الاختلاف بشكل وثيق مع حساسية خلية مستقبلة للضوء، مما يجعل هذه الطريقة مثالية للدراسات دراسة الأساس الجيني للتغيير المظهري. ويمكن أيضا أن يقترن قياس الحساسيات خلية مستقبلة للضوء مع السلوكية المقايسات تمييز الألوان، والتي تبين الأساس الفسيولوجي للعتبات التمييز هامة في رؤية الألوان 42-46. في التلاعب الجيني أو العلاجية في ذبابة الفاكهة على سبيل المثال، هذه رechnique يمكن أن يكون وسيلة جيدة لقياس وظيفة فسيولوجية المناسبة من العين أو الدماغ فضلا 47،48. على الرغم من أن بلدنا ليست الأولى أو الأسلوب الأكثر تعقيدا من تسجيل الخلايا في العين، وأملنا هو أن نتمكن من جعل هذه الطريقة أكثر سهولة متاحة للاستنساخ والتكامل في البرامج البحثية خارج علم الأعصاب الرسمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر الراحل رودي ليمبورغ لافتعال محيط الذراع كاردان، كيمبرلي جاميسون، ماثيو ماك هنري، وراجو Metherate لإقراض لنا المعدات، والمط كيلبر وكينتارو أريكاوا، للتشجيع. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) العليا زمالة أبحاث لKJM ومنحة جبهة الخلاص الوطني IOS-1257627 لبنك التنمية الآسيوي
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al.
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P.
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D.
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
