Summary
Den elektroteknikk av intracellulært opptak blir demonstrert, og brukes til å bestemme spektrale følsomheten til enkelt fotoreseptorcellene i sammensatt øyet av en sommerfugl.
Abstract
Intracellulære opptaket er en kraftfull teknikk som brukes for å bestemme hvordan en enkelt celle kan svare på et gitt stimulus. I visjonen forskning, har intracellulære opptaket historisk vært en vanlig teknikk som brukes til å studere sensitiviteten for enkelt fotoreseptorcellene til forskjellige lys stimuli som fortsatt blir brukt i dag. Men det er fortsatt en mangel på detaljerte metoder i litteraturen for forskere som ønsker å gjenskape intracellulære opptak eksperimenter i øyet. Her presenterer vi insekt som en modell for å undersøke øyet fysiologi mer generelt. Insekt fotoreseptorcellene er plassert nær overflaten av øyet og er derfor lett tilgjengelig, og mange av de som er involvert i syn mekanismer er konservert på tvers av dyr phyla. Vi beskriver den grunnleggende prosedyren for in vivo intracellulære opptaket av fotoreseptorcellene i øyet av en sommerfugl, med mål om å gjøre denne teknikken mer tilgjengelig for forskere med liten tidligere erfaring i electrophysiology. Vi introduserer den grunnleggende utstyr som trengs, hvordan å forberede en levende sommerfugl for opptak, hvordan du setter inn et glass microelectrode i en enkelt celle, og endelig opptaksprosedyren selv. Vi forklarer også den grunnleggende analyse av rå responsdata for å bestemme spektralfølsomheten til individuelle celletyper. Selv om vår protokoll fokuserer på å bestemme spektrale følsomhet, andre stimuli (f.eks polarisert lys) og varianter av metoden gjelder for dette oppsettet.
Introduction
De elektriske egenskaper til celler slik som nerveceller observeres ved å måle ion strømmen over cellemembraner som en endring i spenning eller strøm. En rekke elektrofysiologiske teknikker er blitt utviklet for å måle bioelektriske hendelser i cellene. Nerveceller som finnes i øynene til dyrene er tilgjengelige og deres kretser er ofte mindre komplisert enn i hjernen, noe som gjør disse cellene gode kandidater for elektrofysiologisk undersøkelse. Vanlige anvendelser av elektro i øyet inkluderer elektroretinografi (ERG) 1,2 og microelectrode intracellulære opptaket. ERG innebærer å plassere en elektrode i eller på øyet hos et dyr, å påføre en lett stimulus, og måle endringen i spenningen som en sum av responsene til alle nærliggende celler 3-6. Hvis man er spesielt interessert i å karakterisere spektrale følsomheten til enkelt fotoreseptorcellene, ofte flere celletyper samtidig svare på ulike styrker til et gitt stimulus; dermed detkan være vanskelig å bestemme sensitiviteter av spesifikke celletyper fra ERG data, spesielt hvis det finnes flere forskjellige typer spektralt-lignende fotoreseptorcellene i øyet. En mulig løsning er å lage transgene Drosophila med fotoreseptoren (opsin) genet uttrykkes i de fleste R1-6 celler i øyet og deretter utføre erg 7. Mulige ulemper ved denne metoden er ikke til lav-ekspresjon av fotoreseptoren protein 8, og den lange tid rammen for generering og screening av transgene dyr. For øynene med færre typer spektralt forskjellige fotoreseptorer, kan tilpasning av øyet med fargede filtre hjelpe til med å senke bidraget fra enkelte celletyper til ERG, og dermed tillater estimering av spektral følsomhet maxima 9.
Intracellulære opptaket er en annen teknikk der en fin elektrode impales en celle og en stimulus er brukt. Elektrode poster bare at individual celle respons, slik at opptak fra og analysere flere enkeltceller kan gi bestemte følsom av fysiologisk forskjellige celletyper 10-14. Selv om vår protokoll fokuserer på analyse av spektral følsomhet, de grunnleggende prinsipper for intracellulær opptak med skarpe elektroder er modifiserbare for andre programmer. Ved hjelp av en annen forberedelse av en prøve, for eksempel, og bruk skarpe kvarts elektroder, kan man ta opp fra dypere i den optiske lapp eller andre regioner i hjernen, avhengig av spørsmålet blir stilt. For eksempel, reaksjonstider på individuelle fotoreseptorcellene 15, celleaktivitet i den optiske fliker 16 (lamina, marg eller lobula 17), hjerne 18 eller annen ganglier 19, kan også registreres med lignende teknikker, eller farge stimuli kan bli erstattet med polarisasjon 20 -22 eller bevegelse stimuli 23,24.
Fototransduksjonskaskade, prosessen ved hvilken lysetenergi absorberes og omdannes til en elektrokjemisk signal, er en gammel egenskap som er felles for nesten alle dagens dyr phyla 25. Den visuelle pigment funnet i fotoreseptorcellene og ansvaret for å initiere visuell fototransduksjonskaskade er rhodopsin. Rhodopsins i alle dyr er bygd opp av en opsin protein, et medlem av syv transmembran G-protein-koblet reseptor-familien, og en tilhørende kromofor som er avledet fra retinal eller et lignende molekyl 26,27. Opsin aminosyresekvens og kromofor struktur påvirke absorbansen Rhodopsin til forskjellige bølgelengder av lys. Når et foton absorbert ved kromoforen den rhodopsin blir aktivert, igangsetter en G-protein kaskade i den celle som til slutt fører til åpning av membranbundne ionekanaler 28. I motsetning til de fleste nevroner, fotoreseptorcellene gjennomgå graderte mulige endringer som kan måles som en relativ endring i respons amplitude med skiftende lys stimulans. Vanligvis en gittfotoreseptoren typen uttrykker bare en opsin gen (men unntak finnes 8,10,29-31). Sofistikert fargesyn, av den typen som finnes i mange virveldyr og leddyr, oppnås med en kompleks øye av hundrevis eller tusenvis av fotoreseptorcellene hver uttrykker en eller noen ganger flere rhodopsin typer. Visuell informasjon registreres ved å sammenligne responsene over fotoreseptoren mosaikk via kompleks nedstrøms nevrale signalering i øyet og hjernen, noe som resulterer i oppfatningen av et bilde med farge og bevegelse.
Etter måling av de rå responsene til en fotoreseptor celle til forskjellige bølgelengder av lys via intracellulære opptaket, er det mulig å beregne den spektrale følsomhet. Denne beregningen er basert på prinsippet om Univariance, som sier at en fotoreseptoren celle respons er avhengig av antall fotoner det absorberer, men ikke på de spesielle egenskapene til fotoner det absorberer 32. Enhver foton som er absorbed av rhodopsin vil indusere samme type respons. I praksis betyr dette at en celle rå respons amplitude vil øke på grunn av enten en økning i lys intensitet (flere fotoner til å absorbere), eller til en endring i bølgelengde mot sin topp følsomhet (høyere sannsynlighet for rhodopsin absorberende at bølgelengde). Vi gjør bruk av dette prinsipp i forbindelse cellulære responser på kjente intensitet og den samme bølgelengde for å responser ved forskjellige bølgelengder, og det samme intensitet men ukjent relativ følsomhet. Celletyper er ofte identifisert ved den bølgelengde ved hvilken deres følsomhet topper.
Her viser vi en metode for intracellulær registrering og analyse av spektral følsomhet av fotoreseptorene i øyet av en sommerfugl, med fokus på å gjøre denne metoden mer tilgjengelig for bredere forskningsmiljø. Selv om det intracellulære opptaket er fortsatt vanlig i litteraturen, spesielt med hensyn til fargesynet i insekter, har vi funnet that beskrivelser av materialer og metoder som vanligvis er for kort for å muliggjøre gjengivelse av teknikken. Vi presenterer denne metoden i videoformat med sikte på å tillate det lettere replikasjon. Vi beskriver også teknikk med lett tilgjengelig og rimelig utstyr. Vi tar vanlige begrensninger som ofte ikke blir rapportert som tregere forskning når du optimaliserer en ny og komplisert teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene ble behandlet som humant som mulig. Insekter ble sendt som puppe fra Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica.
1. Heliconius puppe Care
- Hang alle puppe plassert 2-3 cm fra hverandre i en fuktet kammer bruker insekt nålene.
- Etter eklosjonshormon, la vingene til tørk deretter holde sommerfugler i live i minst en dag i en fuktet kammer og mate en fortynnet honning løsning daglig før opptak.
- Fortynn honning med vann til ca 20% honning løsning av volum, og hell i et grunt petriskål.
- Ta med enkelte sommerfugler til petriskål, en etter en. Ved å berøre løsning med sine foran tarsi, vil sommerfugler automatisk utvide sine proboscides og drikke fra petriskål. Hvis deres snabel ikke automatisk forlenge Bruk pinsett til å trekke snabel ut og presentere det til honning løsning.
2. Optisk Track, Kalibrering og Måltement av Eksperimentelle lysforhold
- Plasser en 150 W Xenon-buelampe med huset og universell kraftforsyning og en tilknyttet kondensator linsemontasjen på den ene enden av et bord på minst en meter lang for å gi hvitt lys.
FORSIKTIG: Xenon buelamper produsere ekstremt sterkt lys med sterke UV-intensitet. Vernebriller bør brukes til enhver tid, og lampen bør brukes som anvist av produsenten for å hindre opphopning av ozon forårsaket av interaksjon av UV-lys med atmosfærisk oksygen. - Sett opp en optisk spor én meter i lengde for lyset går ut av huset forsamlingen til å passere gjennom (figur 1).
- Plasser i følgende rekkefølge på den optiske banen med omtrentlige avstander fra hverandre: 1) en konveks silika eller kvartslinse 40 cm fra kondensatoren montasje, 2) en nøytral tetthet filter hjul (uten filter for tiden i lysbanen) 22 cm lengre framme sporet, 3) en lukker med drivenhet 14 cm fra ND-filters, 4) en konkav silika eller kvartslinse i umiddelbar nærhet etter lukkeren, og 5) en kollimerende stråle sonde 6 cm videre langs enden av sporet.
- Påføre en 600 um diameter fiberoptisk kabel til det kollimerende strålen sonden.
Merk: Avhengig av lysintensitet, kan en 5-10 mm diameter fiberoptisk kabel være nødvendig for å levere nok lys til andre preps og kan erstatte dette. - Juster avstand, høyde og vinkel på hvert optisk element, slik at lysstrålen som kommer ut av sammenstillingen er på det høyeste intensitet mulig.
- Som optiske sporelementer kan avvike noe med forskjellige programmer, sikre at alle elementer overføre lys i UVA og synlig område (315-700 nm).
- Når den optiske spor er montert, måle lyset som passerer gjennom oppsettet ved hjelp av et spektrometer. Kalibrere spektrometeret første ved hjelp av en kalibrerings lampe med et kjent spektrum og produsentens programvare.
Notat: Vi beskriver følgende oppsett hjelp Ocean Optics produkter for klarhet, men andre produsenter (f.eks Avantes) selger tilsvarende produkter.- Slå på kalibrerings lampen wolfram minst 45 minutter før du tar målingene.
- For å kalibrere, fest spektrometeret via USB til en datamaskin med tilhørende programvare installert. Deretter kobler spektrometeret til wolfram kalibrering lampen via en UV-synlig sende cosinus Corrector.
- Velg "New Absolute Irradians Measurement" fra fanen "File" og velg spektrometer som "Source".
- Følg instruksjonene for å opprette en ny kalibrering "cal" fil. Når du blir bedt, legger den medfølgende datafilen for den kjente spekteret av wolfram kalibrering lampe i synlig lys området (300-800 nm) i programvaren, som automatisk beregner den korrigerte spekteret fra spektrometeret utgang.
- Lagre kalibreringsfilen. Last denne filen når tt ig ngalizing programvaren for alle fremtidige målinger av lys spektra ved bruk av spektrometeret.
- Når spektrometeret er kalibrert, kan du bruke denne til å registrere lys spektra fra det eksperimentelle oppsettet. Heretter når programvaren er åpnet, velg "New Absolute Irradians Measurement" og last den tidligere lagrede kalibreringsfilen. Neste ta en mørk spektrum ved å blokkere alt lys til spektrometeret.
- Med spektrometer for tiden måle de ønskede eksperimentelle lysforhold, justere integrasjonstiden (4 millisekunder), skanner til gjennomsnittlig (5), og Boxcar bredde (5), så spekteret er riktig skalert og glattet. Hold innstillingene de samme for alle spektrale målinger, slik at lysintensitet fra ulike målinger kan sammenlignes.
- Måle spektrene for udempede hvitt lys, for alle nøytral tetthet filter som skal brukes i løpet av eksperimenter, og for hver båndpassinterferensfilter (figur 2).
- Measure det hvite lyset spekteret uten noen filtre i lysbanen ved å feste den frie ende av den fiberoptiske kabelen fra trinn 2.2.2 til spektrometeret. Med kalibrering fil lastet fra trinn 2.3, lagre det hvite lyset spekteret hjelp av spektrometeret programvare som en tekstfil.
Merk: Spectra lagret som tekstfiler liste bølgelengde (x koordinater) i en kolonne og intensiteten av lys (y koordinater) i den andre kolonnen, slik at dataene kan lastes inn i et regneark for trinn 2.6. - Ved å bruke samme oppsett som trinn 2.5.1, spille inn spekteret fra hver optisk tetthet (OD) (0 til 3,5 OD) brukt under forsøkene ved å rotere nøytral tetthet (ND) filter hjulet i den optiske banen, og lagre tekstfilen for hver OD.
- Ved å bruke samme oppsett som trinn 2.5.1, plasserer 10 nm halv båndbredde forstyrrelser filtrerer en etter en inn i lysbanen og registrere spekteret observert for hvert filter. Gjenta denne prosedyren for hver av 41 forskjellige interferensfiltre with peak Overføringene fordelt hver 10 nm 300-700 nm. Filtre i avstand lenger fra hverandre (20 nm) er akseptabelt for de fleste anvendelser (for spektra, se figur 2).
- Measure det hvite lyset spekteret uten noen filtre i lysbanen ved å feste den frie ende av den fiberoptiske kabelen fra trinn 2.2.2 til spektrometeret. Med kalibrering fil lastet fra trinn 2.3, lagre det hvite lyset spekteret hjelp av spektrometeret programvare som en tekstfil.
- Korrigere for forskjeller i intensiteten av lyset når interferensfiltre er plassert i lysbanen. Hvert interferensfilter tillater et forskjellig antall fotoner å passere, og den lave transmisjon av noen filtre som gjør det vanskelig å ytterligere dempe intensitet, slik at alle filtrene tillate likt antall fotoner.
- For å beregne den relative intensitet (I) for hver 10 nm båndbredde interferensfilter, løse for I i uttrykket I = T / sek, hvor T er arealet under kurven for hver spektrale 10 nm interferensfilter (fra 2.5.3) og s er den maksimale absolutte irradians (y-verdi av lagrede tekstfilen fra 2.5.1) av hvitt lys i maksimum bølgelengde på hvert filter (Se figur 2 for eksempel ved 520 nm).
- Fordel alt beregnet intensitetenies av den maksimale intensitetsverdi beregnet i 2.6.1 til å normalisere til en, og ta den resiproke verdi av de relative normaliserte verdier for anvendelse som en korreksjonsfaktor tilført rå følsomheten ved hver enkelt bølgelengde (se trinn 6.4).
- Utfør trinn 2.1 til 2.6 bare én gang før et sett av eksperimenter. I løpet av et eksperiment periodisk ta den absolutte irradians av Xenon-buelampen i sterkt lys og tetthetsfiltre nøytrale, for å sørge for at intensiteten til lyset stimulus ikke endres.
- I løpet av et eksperiment, hvis noen cellulær respons på lys som sendes gjennom interferensfiltre nærmer seg den maksimale respons amplitude, bruker ND filter for å dempe signalet. Hvis ND filter blir brukt i løpet av et eksperiment, står for den tilsvarende reduksjon i intensitet i løpet av beregningen av spektralfølsomhet.
- Sett opp optisk spor, kalibrering og filtre dager eller uker før forsøkene starter. Hold filtredekket for å hindre oppsamling av støv.
Oppsett 3. opptaksutstyr
- Feed samme fiberoptisk kabel som brukes for kalibrering gjennom et Faraday bur og montere på en goniometriske enhet som en Kardang arm omkrets (se figur 3 for diagram). Kabelen vil være ca 10 cm fra øyet av prøven.
- Plassere et metall trinn på et vibrasjonsmessig isolert bord med en elektrodeholder montert direkte over scenen under styring av en mikromanipulator (figur 4). Plasser Kardang armen slik at prøven hode er i sentrum av kulen skapt av armlengdes rotasjonsbevegelse.
- Ved hjelp av en intracellulær forforsterker system, som omfatter en forsterker (utenfor Faraday-bur) og forforsterker (heads, nær prep inne i Faraday-bur) montere heads over metall stadiet hvor prøven skal plasseres.
- Koble en koaksialkabel til heads via enBNC tilkobling. Sprekke bare spissen på den andre enden av koaksialkabelen, og separere den ytre metallkappen for kabelen fra den indre ledning.
- Lodd den ytre kappe (holdt på jordpotensial) til en ende av en isolert kobbertråd med en krokodilleklemme på den andre enden. Dette alligator klipp vil feste til metall referanseelektrode på prøveplattform (trinn 5.1.4).
- Lodde indre tråd av koaksialkabelen til en tynn sølvtråd, for å tjene som opptaks elektroden. Denne ledningen bør være tynn nok til å bli matet inn i oppløsningen fylt med glasselektrode i trinn 5.2.3.
- Plassere et stereomikroskop koblet til en svingende arm og base på tre benken utenfor Faraday-bur, slik at det kan svinges inn for å senke elektroden ned i øyet, og svinges ut igjen når elektroden er i øyet.
- Sørg for at alt metall inne i Faraday bur er skikkelig jordet.
- Utenfor Faraday bur, fester preamplifer til inngangen på en 50-60 Hz støy redusering (valgfritt), og koble utgangen til en kanal av et oscilloskop bruke en BNC T-adapter.
- Ved hjelp av den andre enden av T-adapter, kobler signalet passerer gjennom oscilloskop til en kanal av maskinvaren. Fest denne maskinvaren til en datamaskin via en USB-kabel, som vil tillate responser spilt inn med forforsterkeren å bli lest av programvare på datamaskinen.
- Fest lukkeren driveren fra den optiske spor til den andre kanalen av oscilloskop med en annen T-adapter og koble denne til en pulsgenerator som vil kontrollere frekvensen og varigheten av lyset blinker levert til øyet (trinn 5.5).
Merk: Oppsett av selve riggen trenger bare å gjøres en gang. Bryt her til den er klar til å begynne opptak.
4. Prep den dagen Recording
- Slå på Xenon lampe minst 45 minutter før forsøket og slå på glasset microelectrode avtrekker minst 30 min før pulling glass elektroder.
- Slå på alle opptaksutstyr (lukker, forsterker, støy eliminator, puls generator, oscilloskop, og datainnsamling maskinvare) og sørge for at lukkeren er lukket som standard, slik at ingen lys passerer gjennom fiberoptisk kabel.
- Trekk fin borsilikat (eller aluminosilikat) glassmikroelektroder (100-250 Megohm motstand er ideelt) ved hjelp av et glass microelectrode avtrekker. Bruk glasselektroder i bare noen få timer for å bli trukket.
- Fylle elektroder med 3 M Kaliumklorid (KCl). Legg merke til at denne løsningen kan bli modifisert i henhold til forskernes behov, f.eks fargestoff injeksjon.
5. Prøve Prep og opptak Prosedyre
- Klargjør Specimen
- Påføre et individ sommerfugl inne i et lite plastrør med varm voks, slik at hodet er ubevegelige og stikker ut fra en ende av røret. Voks ned snabel, antenner og vinger (figur 5).
- Hold nede than magen med en tørr stykke voks og holde røret fuktes ved å anbringe en våt vev inne i røret bak magen. Sørg for at prøven er helt immobile.
- røret festet ved hjelp av en liten del av voks på en liten plattform med et kuleledd som er festet til en magnetisk base.
- Under et disseksjonsmikroskop, sett inn en sølvtråd med diameter 0,125 mm inn i hodet via munndeler for å bli brukt som referanseelektrode. Før forsøket, permanent feste ledningen til plattformen på en slik måte at kobbertråd i trinn 3.3.2 kan klippe på til den når plattformen er plassert på scenen for opptak.
- Når referanseelektroden er i en passende stilling det kan holdes på plass ved hurtig smelting og deretter avkjøling voks rundt ledningen.
- Ved hjelp av en brytbar karbon stål barberblad, festedelen av bladet med bladholderen og bryte av et lite stykke til bruk for kutting av hornhinnen.
- Klipp et lite hull (~ 10 ommatidien i diameter) i venstre hornhinnen ved hjelp av barberbladet og forsegle hullet med vaselin for å hindre uttørking.
- Når hornhinnen er kuttet, sett opptak elektroden inn i øyet så raskt som mulig, fordi hemolymfe i øyet vil raskt stivne og gjøre det umulig å sette inn en elektrode. Hvis det er mulig å utføre disseksjon i riggen hvor innspillingen skal foregå.
Merk: Vaseline skal ikke utflytende på resten av øyet, da dette vil uskarp optikk.- Hvis ikke allerede er på scenen, plasserer montert prøven og plattform på scenen i innspillingen riggen. Koble headsjordledningen fra trinn 3.3.2 til referanseelektrode på prøven plattformen ved hjelp av krokodilleklemmer.
Merk: Hvis det er mulig å bruke et rødt filter for å belyse dyret. - Bruk en lyskilde med svanehals vedlegg til kort lyser prøven under et stereoskop samtidig som man reduserer opptaket elektrode inn i øyet.
- ISERT sølvet ledning koblet til den heads fra trinn 3.3.3 inn i KCl-oppløsning på baksiden av en glassmikroelektrode. Monter glasselektrode på elektrodeholderen.
- Juster elektrodeholderen, slik mikroelektroden er direkte over hullet som tidligere kuttet i hornhinnen, om en millimeter over hornhinnen. Senk mikroelektroden inn i øyet ved hjelp av mikromanipulator inntil en krets er fullført, som vist ved en stor endring i potensial (mV) på oscilloskop.
- Hvis ikke allerede er på scenen, plasserer montert prøven og plattform på scenen i innspillingen riggen. Koble headsjordledningen fra trinn 3.3.2 til referanseelektrode på prøven plattformen ved hjelp av krokodilleklemmer.
- En gang i øyet, svinge stereoskop utenfor Faraday bur, og slå av lyskilden belyse prøven. Rommet bør holdes mørkt så øyet blir mørkt tilpasset.
- Sjekk motstanden av elektroden ved å bruke en 1 nA strøm fra forsterkeren og å merke seg endringen i spenning. Resistance bør typisk være i området mellom 100-250 Megohm. Høyere motstander er tegn på blokkering eller bøying av elektroden, og lave motstander av strømode brekkasje.
- Aktivere pulsgeneratoren slik at lukkeren kan åpnes slik at et lysblink med en 50 msek varighet hvert 0.5 sek, og tillate det å fortsette å blinke for varigheten av forsøket.
- Juster pulsgeneratoren slik at den tillater blinker på opptil 50 msek varighet. Denne varighet og 0,5 sek pause mellom blinkene holder prøven så nær til mørk tilpasset som mulig i løpet av eksperimentet. Femti msek er nær den korteste flash varighet som vil lokke fram den samme amplitude som respons som lengre flash varighet.
- Re-tiltak svar på både begynnelsen og slutten av forsøket (trinn 5.16). I løpet av en tjue minutters eksperiment, disse blitsinnstillingene ikke dårligere respons over tid. Ulike forbereder kan kreve endringer i disse blitsinnstillingene.
- Plasser Cardan arm, slik at den fiberoptiske kabelen er rettet mot øyet.
- Sjekk oscilloskop for spenningsendring med hvert lys flash.En negativ endring i spenningen betyr at elektrode ennå ikke har gått inn i en celle.
- Beveg Cardan armen rundt prøven inntil den er plassert i en vinkel til øyet ved hvilken det er en maksimal spenningsrespons.
- Rotere mikromanipluatoren frem og tilbake og forårsaker meget små vertikale bevegelser av elektroden i begge retninger, mens et lett trykk på undersiden av elektrodeholderen eller ved hjelp av Buzz funksjonen på forforsterkeren. Fortsett å gjøre små justeringer til en depolariserende lys svar vises på oscilloskop (figur 6).
- Juster Kardang arm igjen for å finne den innfallsvinkelen der et lysglimt gir den største depolariserende signal. Lag små justeringer med micromanipulator og bruke Buzz-funksjonen på forsterkeren som nødvendig for å sørge for at elektroden er stabilt opptak cellen, og at den vil holde seg i cellen for hele forsøket (Se trinn 5.11).
- Når oppsettet er stabil, begynner recording. Et stabilt opptak bør ha liten eller ingen endring i hvilepotensialet, lav bakgrunnsstøy, og en gjennomgående stor depolariserende respons (minst et 10: 1 signal til støy-forhold).
- Kjøre programvaren på datamaskinen, og begynne et "nytt eksperiment", som vil åpne et pop-up vindu med fire kanaler.
- Juster spenningen skalaen øverst til høyre hjørne av programvaren vinduet til 500 mV. Den første kanalen viser de reaksjoner som er tatt opp fra elektroden i sann tid, mens den andre kanalen vil registrere den firkantbølge frembringes av funksjonsgenerator, hvis signal mates til datainnsamlingsmaskinvaren via oscilloskop, som viser når lukkeren er åpen . De to andre kanaler er unødvendige.
- Klikk "Start" nederst i høyre hjørne for å starte opptaket, og la programvaren til å kjøre for varigheten av forsøket. Juster zooming av x (tid) og y (spenning) aksene slik at svarene er klare.
- Først med hvitt lys, ta opp til 10 individuelle svar med ND-filter hjulet på 3,5 OD (5-10 sek).
- Neste rekord samme antall svar på 3,3 OD, deretter 3,1, 3,0, 2,5, 2,3, 2,1, etc. i alle kombinasjoner inntil 0,0 OD. Disse respons amplitudene til ND-filter serie vil gi respons-log intensitetskurven i avsnitt 6. Hvis blekingen skjer, bruke færre blinker av lyse stimuli i løpet av eksperimentet.
- Registrere responsen til cellen for alle bølgelengder, ved hjelp av interferensfiltre.
- Først finner maksimum bølgelengde. Uten ND filtre i lysbanen (0,0 OD), plassere en UV sende filter i lysbanen og kort observere responsen amplitude. Gjenta med en blå senderfilter, en grønn senderfilter, og en rød senderfilter, noe som bør gi en ide om hvor maksimal respons vil være.
- Bruk filtrene på ca 350, 450, 550, 650 nm for å finne den generelle delen av topp følsomhet itrinn 5.14.1. Den nøyaktige bølgelengde spiller ingen rolle i denne innledende søkefase fordi alle bølgelengder vil bli registrert i neste trinn. Hvis anslagene finnes av peak følsomhet, eller de har blitt spilt inn tidligere, bruke kjent bølgelengder for å raskt identifisere maksimal respons.
- Når maksimal respons eller nær det er identifisert, registrering ved denne bølgelengde for 10 responser (ca. 5 sek).
- Etter innspillingen på bølgelengde på topp respons, ta opp med de andre interferensfiltre, 300-700 nm 10 nm trinn. Start fra toppen og går ut mot både kortere og lengre bølgelengder ved å bytte filtrene ut fra lysbanen en etter en (for eksempel hvis maksimal respons er på 520 nm, rekord svar på dette bølgelengde først, deretter 510 nm, etterfulgt av 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, og så videre inntil det ikke er det ingen reaksjon).
- Tillat for opptil 10 svar per filter (5 sek hver). Når bytte interferensfiltre, la cellen til respond til 1-2 blinker av hvitt lys uten filter i lysbanen, som er nyttig for å overvåke om maksimal respons er nedverdigende over tid. Reduser antall svar eller øke OD hvis bleking oppstår.
- Hvis responsen under noen støyfilter er for nær den maksimale responsen under hvitt lys på 0 OD, deretter dempe med ND filtre. Interferensfiltre og størrelsen av den fiberoptiske kabel som brukes i dette eksperimentet i stor grad svekker intensiteten av lys og så ND filter er vanligvis ikke nødvendig.
- Hvis opptaket forblir stabile, re-record bølgelengder rundt maksimal respons, som fungerer som en pseudoreplicate for å bekrefte tidligere respons amplituder og bidrar til å sikre at responsen har ikke degradert over tid. Når alle bølgelengder blir registrert, re-rekord svarene under ND-serien, som i trinn 5.12.
- Når opptaket er ferdig klikk "Stopp" på programvaren, og lagre opptaket for analyse.
- Etter et eksperiment, ofrer den individuelle ved frysing eller kjøling for etterfulgt av raskt kuttet hodet og knusing av thorax flere minutter.
- Slå av alt utstyr. Bryt her hvis det er nødvendig før du gjør analysen.
6. Spectral Sensitivity Analysis
- Med programvaren som brukes til å ta opp rå svar, beregne gjennomsnittet respons amplitude av 10 individuelle svar for hvert filter i ND-serien og for hver støyfilter.
- Lag en respons-log intensitet (VlogI) funksjon fra ND-filter serien spilt inn i Steps 05.12 til 05.13 (figur 7). Dette gjøres ved å plotte log enheter av intensitet (OD) på X-aksen, og responsen til hver intensitet på y-aksen.
- For å utlede spektrale følsomhet av cellen ved ulike bølgelengder, vanligvis passer Naka-Rushton ligningen til data fra trinn 6.2, og bruker denne ligningen til å forholde eksperimentelt innhentet spektrale respons av forskjellige bølgelengder to i forhold fotoner som kreves for å fremkalle den reaksjon under konstant bølgelengde (i dette tilfellet hvitt lys).
Merk: Naka-Rushton ligning er: V / V maks = I n / (I n + K n), hvor I er den stimulus intensitet, er V responsen amplitude, er V maks den maksimale respons amplitude, er K stimulus intensitet gir ½ V max, og n er eksponentiell skråningen. Forskjellige fremgangsmåter kan benyttes for å montere denne ligning til de VlogI data, inkludert kurvetilpasning programvare, eller kodebaserte statistiske pakker. - For å montere Naka-Rushton ligningen ved hjelp av enkle beregninger og et regnearkprogram, transformere VlogI responsdata for hver stimulus intensitet: log [(V max / V) - 1]. Deretter utfører lineær regresjon på de transformerte data for å få ligningen for linjen av beste passform.
Merk: V max må være større enn noen målte responser; å holde dette konsekvent, anslår denne metoden V max som 1% greater enn den høyeste målte respons. - Fra ligningen av regresjonslinjen, anslår eksponenten (n) ved å ta den negative skråningen, og log (K) = y-skjærings / n.
- For å utlede spektrale følsomhet av cellen ved ulike bølgelengder, vanligvis passer Naka-Rushton ligningen til data fra trinn 6.2, og bruker denne ligningen til å forholde eksperimentelt innhentet spektrale respons av forskjellige bølgelengder to i forhold fotoner som kreves for å fremkalle den reaksjon under konstant bølgelengde (i dette tilfellet hvitt lys).
- Når parametrene for V max, n og K har blitt estimert, bestemme det relative antall fotoner som kreves for å fremkalle den spektrale respons av cellen ved hver bølgelengde ved å plugge den målte spektrale respons på en gitt bølgelengde som (V) og løse for I.
- Multiplisere den beregnede stimulus intensitet (I) fra trinn 6.3 med korreksjonsfaktor for hver interferensfilter (fra trinn 2.4.3) ved hver bølgelengde.
- For å få følsomhet, må alle intensiteter være relatert til V log-I kurven, slik at de kan sammenlignes. Gjør dette ved å knytte hver intensitet bølgelengde ½ V max eller K, beregnet i trinn 6.2.3.
- Trekk hver intensitet korrigert bølgelengde (trinn 6.4) fra K.
- Så for intensitet hver bølgelengde, legge til denne "avstand fra K "verdi til K, og multipliser med (-1).
- Neste bringe alle datapunkter positive ved tilsetning av den absolutte verdi av den laveste datapunktet i serie til hver bølgelengde.
- Finn følsomhet ved hver bølgelengde ved å ta den inverse verdien av alle nyberegnede intensiteter fra trinn 6.5.1. Omforme dataene slik at følsomheten spektrum faller mellom 0 og 1.
- Etter innspillingen fra mer enn én celle av samme type gjennomsnittet de endelige svar og tomt med standardfeilfelt eller 95% konfidensintervall (Figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For mange elementer av opptaket oppsett, betyr en skrevet beskrivelse ikke gi tilstrekkelig detalj. Figur 1 er et skjematisk riss av de som er involvert i den komplette opptak oppsettet komponenter. I figur 2 er spektra plottet for hvitt lys og hvert interferensfilter for å gi en følelse av at en korreksjonsfaktor som er nødvendig og hva som er nødvendig for å beregne denne korreksjonen. Figur 3 viser fotografier og et diagram av Cardan armen som benyttes for disse eksperimenter. Figur 4 er et sammensatt bilde som viser opptakstrinnet og mikromanipulator. Figur 5 viser flere trinn i fremstillingen av en sommerfugl for forsøket.
Når et opptak begynner, en negativ forandring i spenningen som reaksjon på en lett flash betyr at elektroden er utsiden av en celle, som i Figur 6a. Styrken av responsen er avhengig av nærheten av elektrodentippe til en fotoreseptoren celle, og innfallsvinkelen for lyset blinker. Svaret bør være stort (> 30 mV) før spissen er nær nok til en celle for å spidde. Figur 6b viser en klar depolariserende svar på en lys stimulans, som betegner inntreden i en fotoreseptoren celle. Hvilepotensialet bør være stabil og responsen amplitude bør være stor (minst 40 mV), selv om den absolutte amplitude kan variere betydelig. Man måler relativ respons, slik at det er mer viktig at signal-til-støy-forholdet er høyt. Dersom det hviler potensielle endringer i stor grad, ser responsen bølgeform uvanlig, eller den maksimale respons er for lav, så sammenligne relative respons på tvers av alle interferensfiltre blir umulig. Eksempler på ubrukelige opptak er vist i figur 6c, 6d.
Etter å ha fullført en vellykket opptak, må ND svar plottes og Naka-Rushton ligningen skal monteres til dataene 33, shown i Figur 7. Dette tallet er plottet ved hjelp av ND-filter serien uten interferensfiltre. Når opptaket er stabil, må dataene fra ND-filter serie være lik før og etter forsøket. Spectral følsomhet bestemmes ved å montere den Naka-Rushton ligningen til VlogI plottet i Figur 7, deretter løse for (I) for hvert svar (V) ved en gitt bølgelengde, som forklart i beregningene av § 6 i protokollen.
Et representativt eksempel på spektral følsomhet stammer fra et enkelt opptak er plottet i figur 8a (vær oppmerksom på at dette eksempelet viser ekte beregnede data, men toppen er skiftet da dette resultatet er upublisert). Celletyper kan klassifiseres ved topp følsomhet ved en tilsvarende bølgelengde og generelle formen på følsomhets spekteret. Lignende celletyper blir så gjennomsnittsberegnet og den midlere følsomhet er plottet med standard feilfelt ved hver enkelt bølgelengde i Figure 8b. Spektrale følsomheter for tre typiske celletyper som finnes i et insekt er vist i figur 8c (magnitude og feilstolper er beregnet fra virkelige data, men toppene er forskjøvet).
Figur 1:. Skjematisk av opptaks Komponenter Komponenter av lysbanen, prøveoppsett, og opptak maskinvare er angitt. Optisk spor sitter på trebenk utenfor Faraday bur. Xe, xenon arc lampe, Cd, kondensator montering, Lx, konveks linse, ND, nøytral tetthet filter hjul, Cf, filter, S, lukkertid, Lc, konkav linse, Co , kollimerende bjelke sonde, Fo, fiberoptisk kabel. Faraday-bur sitter påtrebenk rundt prøven. Den trebenk sitter over, men ikke berører vibrationally isolert marmor bord under. Opptak (Rc) og referanse (R ^) elektrodene er festet til heads (Hs). Rc innføres i (E) på øyet og Rf er innført i en annen del av kroppen. Den heads er en del av forforsterker (Pa) setup utenfor Faraday bur. Signalet føres fra forforsterkeren gjennom Humbug støyreduksjon (Hb), og inn i oscilloskopet (Os). Fra oscilloskop signalet blir ført gjennom Powerlab maskinvare (PLB) og inn i den bærbare datamaskin (CPU), hvor det blir lest av Labchart programvare. Lukkeren styres av en funksjonsgenerator (Fg) som er ført gjennom en andre kanal på oscilloskopet, og kan også føres gjennom en andre kanal på Powerlab maskinvare hvis dette signal kommer til å bli registrert.
Figur 2:. Hvitt lys og interferensfilter Spectra brukes til å beregne korreksjonsfaktorer Spektra målt i trinn 2,5 av protokollen vises 300-700 nm, for hvitt lys, samt hver av de 41 interferensfiltre. Hvert interferensfilter-spekteret blir målt med bare at filteret i lysbanen. T 520 tilsvarer arealet under spektrum for filteret med toppen 520 nm, og s 520 svarer til intensiteten av hvitt lys ved maksimal bølgelengde på filteret, 520 nm. Disse verdier brukes ved beregning av korreksjonsfaktorer for hvert filter (i dette tilfelle 520 nm) som beskrevet i trinn 2.6 i protokollen.
Fig. 3: beskrivelse av Cardan Arm Perimeter anvendt i eksperimentene universalleddet arm holder den fiberoptiske kabelen og gir full sfærisk rotasjon og vinkelinnstilling, slik at lys kan leveres i riktig innfallsvinkelen til cellen blir tatt opp. (A) Top ned view. (B) Utsikt fra siden på skrå. Tallene tilsvarer de samme deler i alle paneler. (1) Bunnplaten gir full sirkulær rotasjon i horisontalplanet. (2) Den vertikale plate gir full sirkulær rotasjon av armen i et vertikalt plan. (3) Denne sylinderen holder metallarm med den fiberoptiske kabel på enden, og det gir et andre vertikalplan av den sirkelrunde rotasjonsvinkelrett på (2). (4) Den fiberoptiske kabelen blir holdt in sted ved enden av armen, og lyset er rettet mot plassering av prøven i forsøksoppsettet.
Figur 4:. Komponenter i Opptaksoppsett (A) Plastic tube brukes til å holde prøven. (B) Sett ovenfra av plattformen som prøven og rør er montert. (C) fra siden av ball-og-felles plattform med magnetisk base (1). Referanseelektrode holdt immobil med lim og voks på siden av plattformen (2). Referanseelektrode pakket rundt alligator klipp og loddet på plass, noe som gir et vedlegg område der headsreferanseelektrode kan feste (3). (D) elektrodespissen i henhold til 20X forstørrelse. Scale bar, 25 mikrometer. (E) Stage, elektrodeholder, og micromanipulator oppsett. Den heads (1) er festet over anordningen med densølv opptak ledning (2) og referanseelektroden med krokodilleklemme (3) er festet. Elektrodeholderen (4) er festet til en manuell mikromanipulator (5) med en etter nedenfor som kan justeres med en knott for vertikal bevegelse eller kan skyves eller trekkes for horisontal bevegelse av elektrodeholderen. Den magnetiske plattform med prøven sitter i trinn (6) rett under elektrodeholderen. (F) The Faraday bur omgir opptak oppsett med en skjerm som kan trekkes opp eller ned i front. Aluminiumsfolie er plassert under alt utstyr med gummiputer på toppen. Den fiberoptiske kabel (1) fører inn i buret fra den optiske bane utenfor, og blir ved hjelp av Cardan armen (2) mot trinn (3). Innspillingen scenen og manipulator apparatet er plassert i en sandkasse (4) hviler på en marmor bord under oppsettet. Alt annet utstyr hviler på tre benken toppen som ikke berører marmor bord. Sanden boksen sitter på toppen av marmor bord i et hullkuttet ut av trebord, slik at prøven er helt vibrasjons isolert fra utstyret på tre bordplaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Butterfly Prep (A) sommerfugl settes inn i røret og hodet, vinger, og antenner er immobilisert med varm voks. Den likegyldig elektrode settes inn i munndeler (1), blir et stykke av tørr voks brukes til å holde nede magen (2), og et vått vev er plassert bak prøven. (B) nærbilde av hodet vokset ned. Øyet som skal registreres fra (1) holdes klart fra voks eller rusk, og referanseelektrode (2) settes inn i munn og varm voks blir raskt smeltet over det å holde det på plass.(C) Et hull skåret inn i øyet, hvor den rosa-hvite fotoreseptoren cellelaget kan sees. Sort pigment og gul hemolymph er fraværende. (D) Lateral visning av prøven med et glass innspilling elektrode (1) plassert i øyet, og det likegyldig elektrode (2) festet til hodet scenen, som skal fullføre en krets som sett på oscilloskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Rå Svarene fra Eksempel Recordings Hvert svar tilsvarer en enkelt lys flash på 50 msek varighet (svarte striper). (A) Et eksempel på den store negative spenningsendring som bør sees barefør du går inn i en celle. (B) Et rent opptak bør ha liten bakgrunnsstøy og en stor depolariserende reaksjon, typisk på minst 40 mV. (C) Et eksempel på et dårlig opptak på grunn av det negative potensial forandring etter hovedtoppen (pilspisser). (D) Et annet eksempel på et dårlig opptak. Hvilepotensialet gjennomgår store svingninger (rød søyle) og den store mengden av bakgrunnsstøy kan skjule amplitude respons (pilspiss).
Figur 7:. Response-Intensity Log-lineær funksjon Fylte sirkler viser de målte responser i en celle 3,5 til 0 OD, for dette eksperimentelle oppsettet. Lysintensiteten er på en logaritmisk skala. Ved svært høye intensiteter responsen er mettet, og ved svært lave intensiteter en liten respons vedvarer i stedet for å falle til null langs linjen. Than Naka-Rushton ligning 33 er festet til denne ikke-lineære form (stiplet linje).
Fig. 8: spektralfølsomhet eksemplene (a) et enkelt representativ celle responser ble registrert og relativ spektralfølsomhet ble beregnet. Toppen av denne cellen er på 440 nm, noe som betyr at den reagerer best å blått lys. Encellete data kan se støy (topp på 380 nm). (B) Celler med samme relative topp og formen er i gjennomsnitt sammen og standardfeilfelt er lagt til. Her ble syv blå celler fra sju personer i gjennomsnitt gir sterke bevis på at en celletype som finnes i denne arten maksimalt følsomme for lys på 440 nm. (C) Denne prosessen kan gjentas for alle celletyper som finnes, og plottet sammen. Insekt øyne varierer mye i sine spektrale følsomhet, men en typisk insect kan ha topper som vises her, på 370 nm, 440 nm, og 510 nm. Legg merke til disse spektrale følsomhet er alle beregnet ved hjelp av reelle data, men toppene har blitt forskjøvet fordi dataene ennå ikke er publisert for denne arten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intracellulære opptaket kan være en vanskelig teknikk å mestre på grunn av de mange tekniske trinnene involvert. For vellykkede eksperimenter flere viktige punkter må vurderes. For det første er det viktig å ha et godt vibrasjonsisolert bord på hvilken forsøket blir utført. Mange forskere bruker uteservering, som fullstendig skille bordplaten fra basen, noe som gir overlegen vibrasjonsisolering. Vår involverer en tykk marmor bord med en sandkasse på toppen, der er plassert mikromanipluatoren / elektrodeholderen / prøvestadiet apparat. Dette er en effektiv og rimeligere alternativ til en luft bord, spesielt hvis tilgang til in-house gass eller trykkluft er en begrensning. Ekstra vibrasjonsdempende tiltak kan tas som passiv luftfjæring, eller tillegg av demping elementer til bordben (f.eks åpnet tennisballer, sykkel rør, tykke gel pads). Videre er det viktig at det eksperimentelle oppsettet være inne i enFaraday bur med alt jordet. Faraday bur bør ha et metallnett skjerm i front som kan fjernes når du arbeider inne i buret og erstattes lett når du tar opp. Selv en liten mengde ambient elektrisk støy (særlig 50 Hz støy fra hovedstrømforsyningen) kan gjøre en ellers god innspilling ubrukelig.
Ved utarbeidelsen av prøven, hemolymph og pigment lag rundt ommatidia kan hindre vellykkede opptak. Hvis hullet i hornhinnen er kuttet for stor, normal pumping av hemolymfe i legemet bevirker at væskeoverflaten for å bevege seg opp og ned i snitt området, noe som resulterer i en ustabil opptak. Når hullet er skåret, vil hemolymfe og overflatepigmentsjikt koagulere raskt inn i en ugjennomtrengelig skorpe selv når forseglet med vaselin, så det er viktig å få elektroden inn i øyet så snart som mulig. Ringers oppløsning kan også brukes i stedet for vaselin. Jordelektroden kan innføres imunn eller i stubben av et kutt antenne.
I tillegg er det ofte nyttig for å holde dyret som mørke-tilpasset som mulig. For denne metoden, blant annet skritt å holde opptaket rommet veldig mørkt, blokkerer strølys fra Xenon lampe fra å komme inn Faraday bur, kort varighet stimulans blinker (30-50 millisekunder), og en lav nok frekvens mellom blinker (0,5 eller høyere). Når en visuell pigment absorberer et foton, kromoforen i rhodopsin veksler fra 11- cis -3-hydroxyretinal til alle - trans -retinal, indusere konformasjonsendring av opsin protein, og aktivering av hele komplekset som metarhodopsin, som initierer G protein kaskade. Foto-bleking oppstår når lys med høy intensitet fører til at kromoforen til fysisk atskilt fra opsin protein. Tid er en begrensende faktor i dette forsøk fordi elektroden bare vil stabilt opp svarene fra inne i cellen i en viss tid før det faller uteller membranen skades. Av denne grunn har vi ikke bryte slik at cellen for å komme seg, men vi bruker en flash varighet og hyppighet at vi har funnet brytes ikke cellens respons over tid. Det er viktig å redusere både hyppigheten og intensiteten av lys hvis foto-bleking finner sted.
Under opptak, kan en stor elektrodespissen eller stor bevegelse av elektroden skade cellen når denne trenger gjennom membranen. Bare gode tips (minst ~ 100 Megohm) og små bevegelser skal brukes når du nærmer deg en celle for opptak. Hvis intracellulære opptaket er brukt til andre programmer, for eksempel hjerne innspillinger, kan ekstremt fine, solide elektroder trekkes ved hjelp av kvartsglass, men en spesialisert avtrekker må brukes for disse elektrodene. Når først å lage en elektrode trekke program, vi sjekket tips motstand ved tilbakefylling elektroden, sikre den til elektrodeholderen i en mock oppsett, og plassere tuppen og jordelektroden i saltvann. Next vi brukt en strøm til å måle endring i spenning på oscilloskop. Hvis du vil flytte elektrodespissen vi bruker en manuell micromanipulator som beveger seg langs to akser. Andre manipulatorer eksistere inkludert digitale de som tillater bevegelse langs alle tre akser, og disse kan bli anvendt for dette, eller mer komplekse programmer. Det er mange måter å bygge en scene for opptak, og det er mange forskjellige typer maskinvare og programvare som brukes i opptak og analyse av de observerte data. Vårt oppsett representerer en enkel, lett og rimelig oppsett av opptaket riggen.
I konstruere VlogI kurven, funksjoner utviklet av Naka og Rushton 33 og andre 34,35 konto for de ikke-lineære deler av de plottede svar. Forskjellige fremgangsmåter benyttes for å montere denne kurve til dataene, og vi plottet resultatene av en slik fremgangsmåte som ikke krever kurvetilpasning programvare, selv om andre metoder er også egnet 36,37 (
En begrensning ved fremgangsmåten er at hvis undersøkelsen organisme uttrykker mer enn en genetisk like opsin i øyet, kan det være vanskelig å identifisere hvilken opsin mRNA sannsynlig svarer til hvilken spektrale klassen av fotoreseptoren celle. For å overvinne dette problemet, har denne metoden vært kombinert med fargestoff-injeksjoner og in situ hybridisering eller immunhistokjemi for å kunne identifisere de opsins uttrykt på tatt opp celler 10.
Vår metode er enkelt og tilgjengelig for forskere ukjente med visuell elektrofysiologi. Denne teknikk er vanlig i nevro, men spesifikk og klare metoder er fraværende i litteraturen, noe som gjør denne fremgangsmåten er vanskelig å reprodusere. Selv om mange varianter av denne teknikken finnes, kan vi tilby en enkel måte å måle spektral følsomhet i sammensatt øye. Den fysiologiske data er en viktig del av bevis i historier om visuell økologi og evolusjon 41. Opsin sekvensvariasjon er forbundet tett med følsomheten til en fotoreseptoren celle, noe som gjør denne metoden ideell for studier som undersøker den genetiske basis for fenotypisk endring. Måling av fotoreseptoren celle følsomhet kan også kobles sammen med atferdsfargediskriminerings analyser, som viser fysiologiske grunnlaget for viktige diskriminerings terskler i fargesyn 42-46. I genetiske eller terapeutiske manipulasjoner i Drosophila for eksempel, dette technique kan være en god måte å måle riktig fysiologiske funksjon av øyet eller hjernen samt 47,48. Selv om vår er ikke den første eller den mest komplekse metoden for intracellulær opptak i øyet, er vårt håp at vi kan gjøre denne metoden lettere tilgjengelig for reproduksjon og integrering i forskningsprogrammer utenfor formell nevrovitenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker for sent Rudy Limburg for fabrikasjon av driv arm omkrets, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, og Raju Metherate for utlån oss utstyr, og Almut Kelber og Kentaro Arikawa, for oppmuntring. Dette arbeidet ble støttet av et National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship til KJM og NSF tilskuddet IOS-1257627 til ADB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al.
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P.
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D.
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
