Summary
De elektrofysiologische techniek van intracellulaire opname wordt gebracht en benut spectrale gevoeligheden van enkele fotoreceptorcellen bepalen het samengestelde oog van een vlinder.
Abstract
Intracellulaire opname is een krachtige techniek gebruikt om te bepalen hoe een enkele cel kan reageren op een bepaalde prikkel. In de visie van het onderzoek, is de intracellulaire opname van oudsher een veel voorkomende techniek die gebruikt wordt om de gevoeligheden van de individuele fotoreceptorcellen bestuderen om ander licht stimuli die nog vandaag wordt gebruikt geweest. Toch blijft er een gebrek aan gedetailleerde methodologie in de literatuur voor onderzoekers die willen intracellulaire opname experimenten repliceren in het oog. Hier presenteren we de insecten als model voor het onderzoeken oog fysiologie algemeen. Insect fotoreceptorcellen bevinden zich in de buurt van het oppervlak van het oog en zijn dus gemakkelijk te bereiken, en veel van die betrokken zijn bij de visie mechanismen zijn geconserveerd over dierlijke phyla. We beschrijven de basisprocedure voor in vivo intracellulaire opname van fotoreceptorcellen in het oog van een vlinder, met het doel om deze techniek toegankelijker voor onderzoekers maar weinig ervaring in electrophysiology. We introduceren de basisuitrusting die nodig is, hoe je een live-vlinder voor te bereiden voor het opnemen, hoe je een glas micro-elektrode in een enkele cel, en tenslotte de opname procedure zelf in te voegen. Ook de elementaire analyse van ruwe responsgegevens leggen voor het bepalen van de spectrale gevoeligheid van individuele celtypen. Hoewel onze protocol gericht op het vaststellen spectrale gevoeligheid, andere stimuli (bijv gepolariseerd licht) en variaties van de werkwijze van toepassing op deze opstelling.
Introduction
De elektrische eigenschappen van cellen zoals neuronen worden waargenomen door het meten ionenstroom door celmembranen als een verandering in spanning of stroom. Verschillende elektrofysiologische technieken ontwikkeld om bio-elektrische gebeurtenissen in cellen te meten. Neuronen in de ogen van dieren toegankelijk zijn en de schakeling is vaak minder complex dan in de hersenen, waardoor deze cellen goede kandidaten voor elektrofysiologisch onderzoek. Voorkomende toepassingen van elektrofysiologie in het oog omvatten Electroretinografie (ERG) 1,2 en micro-elektrode intracellulaire opname. ERG betreft het plaatsen van een elektrode in of op het oog van een dier onder lichte stimulus, en meten van de verandering van de spanning als een som van de reacties van alle nabijgelegen cellen 3-6. Als men in het bijzonder geïnteresseerd in het karakteriseren van de spectrale gevoeligheid van de individuele fotoreceptorcellen, vaak meerdere celtypen tegelijk reageren op verschillende sterktes van een bepaalde prikkel; alduskan moeilijk zijn om de gevoeligheden van specifieke celtypen van ERG data bepalen vooral als er verschillende soorten spectraal vergelijkbare fotoreceptorcellen in het oog. Een mogelijke oplossing is het gebruik van transgene Drosophila te maken met de fotoreceptor (opsin) gen van belang tot uitdrukking in de meerderheid R1-6 cellen in het oog en voer ERG 7. Potentiële nadelen van deze methode zijn geen low-expressie van het fotoreceptor eiwit 8, en de lange termijn voor de productie en screening van transgene dieren. Voor de ogen met minder soorten spectraal verschillende fotoreceptoren, kan de aanpassing van het oog met gekleurde filters helpen bij het verlagen van de bijdrage van een aantal celtypen van de ERG, waardoor het toelaat schatting van de spectrale gevoeligheid maxima 9.
Intracellulaire opname is een techniek waarbij een fijne elektrode doorboort een cel en een stimulus wordt toegepast. De elektrode platen alleen dat indivrespons idual cel, zodat het opnemen van en het analyseren van meerdere afzonderlijke cellen kunnen specifieke gevoeligheden van fysiologisch verschillende celtypen 10-14 opleveren. Hoewel onze protocol richt zich op de analyse van de spectrale gevoeligheid, de basisprincipes van de intracellulaire opname met scherpe elektroden aanpasbaar voor andere toepassingen. Een andere bereiding van een monster, bijvoorbeeld, en met een scherpe kwarts elektroden kan men opnemen dieper in de optische kwab en andere hersengebieden, afhankelijk van de vraag wordt gesteld. Bijvoorbeeld responsietijden van individuele fotoreceptorcellen 15, celactiviteit in de optische lobben 16 (laminaat, medulla of lobula 17), hersenen 18 of andere ganglia 19 kunnen ook worden opgenomen met soortgelijke technieken of kleurstimuli kunnen worden vervangen door polarisatie 20 -22 of bewegende stimuli 23,24.
Fototransductie, het proces waarbij het lichtenergie wordt geabsorbeerd en omgezet in een elektrochemische signaal, is een oude eigenschap gemeen hebben bijna alle heden dier phyla 25. De visuele pigment gevonden in fotoreceptorcellen en verantwoordelijk voor het initiëren visuele fototransductie is rhodopsine. Rodopsine in alle dieren uit een opsin eiwit, een lid van de 7 transmembraan G-proteïne gekoppelde receptorfamilie een corresponderend chromofoor die is afgeleid van het netvlies of een soortgelijk molecuul 26,27. Opsin aminozuursequentie en structuur chromofoor invloed op de absorptie van rhodopsine verschillende golflengten van licht. Wanneer een foton geabsorbeerd wordt door de chromofoor rhodopsine wordt geactiveerd, het initiëren van een G-proteïne in de cel cascade die uiteindelijk leidt tot het openen van membraangebonden ionkanalen 28. In tegenstelling tot de meeste neuronen, fotoreceptorcellen ondergaan graded potentiële veranderingen die kunnen worden gemeten als relatieve verandering responsamplitude met veranderende licht stimulus. Meestal een bepaaldefotoreceptor soort uiting slechts één opsin gen (hoewel uitzonderingen bestaan 8,10,29-31). Geavanceerde kleur visie, van de soort te vinden in vele gewervelde dieren en geleedpotigen, wordt bereikt met een complexe oog van honderden of duizenden fotoreceptorcellen elke uiting van één of gelegenheid meer rhodopsine types. Visuele informatie wordt vastgelegd door vergelijking antwoorden via fotoreceptor mozaïek via complexe neurale stroomafwaartse signalering in het oog en de hersenen, wat resulteert in de waarneming van een beeld compleet met kleur en beweging.
Na meting van de respons van een ruwe fotoreceptorcel verschillende golflengten van licht via intracellulaire opname, is het mogelijk om de spectrale gevoeligheid berekenen. Deze berekening is gebaseerd op het principe van Univariance, volgens welke reactie een fotoreceptorcel is afhankelijk van het aantal fotonen absorbeert, maar niet op de specifieke eigenschappen van de fotonen absorbeert 32. Elke foton dat is Absorbed door rhodopsine Dezelfde soort reactie induceren. In de praktijk betekent dit dat een cel ruwe responsamplitude zal toenemen als gevolg van hetzij een toename van de lichtintensiteit (meer fotonen te absorberen), of een verschuiving in golflengte naar zijn piekgevoeligheid (hogere waarschijnlijkheid van rhodopsine absorberen die golflengte). We maken gebruik van dit principe in verband cellulaire reacties op bekende intensiteit en dezelfde golflengte om de reacties bij verschillende golflengten en dezelfde intensiteit maar onbekend relatieve gevoeligheid. celtypen worden vaak aangegeven door de golflengte waarbij de gevoeligheid pieken.
Hier laten we een methode voor de intracellulaire registratie en analyse van de spectrale gevoeligheid van fotoreceptoren in het oog van een vlinder, met een focus op het maken van deze methode meer toegankelijk voor de bredere onderzoeksgemeenschap. Hoewel intracellulaire opname vaak blijft in de literatuur, met name wat betreft kleurwaarneming bij insecten, hebben we gevonden that beschrijvingen van de materialen en werkwijzen zijn gewoonlijk te kort om voor reproductie van de techniek. Wij stellen deze werkwijze videoformaat met het doel van het toestaan zijn gemakkelijker replicatie. We beschrijven ook de techniek met gemakkelijk verkrijgbare en betaalbare materialen. We pakken voorkomende valkuilen die vaak niet gemeld, waarin onderzoek vertragen wanneer het optimaliseren van een nieuwe en complexe techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werden behandeld zo humaan mogelijk. Insecten werden verzonden als poppen uit Costa Rica Entomologische Supply, Costa Rica.
1. Heliconius Poppen Care
- Hang alle poppen afstand van 2-3 cm van elkaar in een vochtige kamer met behulp van insect pinnen.
- Na eclosion, laat vleugels drogen dan blijven de vlinders leven gedurende ten minste 1 dag in een vochtige kamer en diervoeders een verdunde honing oplossing dagelijks voor de opname.
- Verdunnen honing met water tot ongeveer 20% honing oplossing door volume, en giet het in een ondiepe petrischaal.
- Breng individuele vlinders de petrischaal, één voor één. Bij de oplossing met hun voorkant tarsi te raken, zal de vlinders automatisch hun proboscides breiden en te drinken uit de petrischaal. Als hun slurf niet automatisch uit te breiden, een tang om de slurf trekken en breng dit aan de honing oplossing.
2. optische Track, kalibratie en MEASURement Experimentele Light Voorwaarden
- Plaats een 150 W xenon booglamp met huisvesting en universele voeding en een aangrenzende condensor lens montage aan de ene kant van de tafel ten minste één meter lang helder wit licht te leveren.
LET OP: xenonlamp produceren extreem helder licht met een sterke UV-intensiteit. Een veiligheidsbril moet worden gedragen ten alle tijden en de lamp moet worden gebruikt zoals voorgeschreven door de fabrikant om ophoping van ozon veroorzaakt door de interactie van UV-licht met atmosferische zuurstof te voorkomen. - Maak een optische baan een meter lang voor het licht dat het behuizingssamenstel met (figuur 1) te passen.
- Plaats in deze volgorde op de optische baan met geschatte afstand van elkaar: 1) een convexe silicium of kwarts lens 40 cm uit de condensor samenstel, 2) een grijsfilter wiel (zonder filters nog in het lichtpad) 22 cm verderop de baan 3) een sluiter met aandrijfeenheid 14 cm van het ND-filters, 4) een concave silicium of kwarts lens onmiddellijk grenzend na de sluiter, en 5) een collimerende bundel probe 6 cm verder op het einde van het spoor.
- Kleef een 600 pm diameter glasvezelkabel naar het collimeren straal sonde.
Opmerking: Afhankelijk van de lichtintensiteit, kan een 5-10 mm diameter glasvezelkabel worden verplicht om voldoende licht te leveren aan andere PREPS en kunnen worden vervangen door dit. - Stel de afstand, hoogte en hoek van elke optisch element, zodat de lichtstraal het verlaten van de vergadering is de hoogste intensiteit mogelijk te maken.
- Als optische spoor elementen enigszins kan verschillen met verschillende toepassingen, ervoor zorgen dat alle elementen zenden licht in het UVA en zichtbare gebied (315-700 nm).
- Zodra de optische baan wordt geassembleerd, meet het licht dat door de installatie loopt met een spectrometer. Kalibreer de eerste spectrometer met behulp van een calibratie lamp met een bekende spectrum en software van de fabrikant.
Notitie: We beschrijven de volgende set-up met behulp van Ocean Optics producten voor de duidelijkheid, maar andere fabrikanten (bijv Avantes) te verkopen vergelijkbare producten.- Zet de wolfraam kalibratie lamp ten minste 45 minuten voordat u metingen.
- Om te kalibreren, sluit u de spectrometer via USB op een computer met de bijbehorende software geïnstalleerd. Sluit vervolgens de spectrometer om de wolfraam kalibratie lamp via een UV-zichtbare zendende cosinus corrector.
- Selecteer "Nieuwe Absolute Bestralingssterkte Meten" op het tabblad "File", en selecteer de spectrometer als de 'Source'.
- Volg de aanwijzingen om een nieuwe kalibratie "cal" bestand te maken. Wanneer u wordt gevraagd, plaatst u de verstrekte gegevens bestand voor de bekende spectrum van de wolfraam kalibratie lamp in het zichtbare licht (300-800 nm) in de software, die automatisch berekent de gecorrigeerde spectrum van de spectrometer output.
- Sla het kalibratie-bestand. Laad dit bestand wanneer initializing de software voor alle toekomstige metingen van lichtspectrum met de spectrometer.
- Zodra de spectrometer wordt gekalibreerd, gebruiken om het licht spectra van de experimentele opstelling nemen. Hierna wanneer de software wordt geopend, selecteert u "New Absolute Bestralingssterkte Measurement" en de eerder opgeslagen kalibratie bestand te laden. Neem vervolgens een donkere spectrum door het blokkeren van al het licht naar de spectrometer.
- Met de spectrometer momenteel het meten van de gewenste experimentele lichtomstandigheden, pas de integratie tijd (4 msec), scans tot gemiddeld (5), en gesloten goederenwagen breedte (5), zodat het spectrum goed geschaald en afgevlakt. Houd de instellingen voor alle spectrale metingen, zodat licht intensiteiten van verschillende afmetingen kunnen worden vergeleken.
- Gemeten spectra voor verzwakte wit licht voor grijsfilters bij experimenten worden gebruikt, en voor elke bandpass interferentiefilter (figuur 2).
- Maatregel het witte licht spectrum zonder filter in de lichtbaan wordt door het vrije einde van de glasvezelkabel uit stap 2.2.2 naar de spectrometer. Met de kalibratie-bestand geladen vanaf stap 2.3, sparen het witte licht spectrum met behulp van de spectrometer van de software als een tekstbestand.
Opmerking: Spectra opgeslagen als tekstbestanden lijst van de golflengte (x-coördinaten) in één kolom en de lichtintensiteit (y coördinaten) in de tweede kolom, zodat de gegevens in een spreadsheet voor stap 2.6 kan worden geladen. - Met behulp van de zelfde opstelling als stap 2.5.1, noteert het spectrum van elke optische dichtheid (OD) (0-3,5 OD) gebruikt tijdens de experimenten door het draaien van de neutrale dichtheid (ND) filter wiel in de optische baan, en sla het tekstbestand elk OD.
- Met behulp van de zelfde opstelling als stap 2.5.1, plaatst u de 10 nm helft bandbreedte storing filtert een voor een in het lichtpad en het spectrum waargenomen voor elk filter op te nemen. Herhaal deze procedure voor elk van de 41 verschillende interferentiefilters wet piek transmissies afstand elke 10 nm 300-700 nm. Filters verder uit elkaar (20 nm) op afstand zijn aanvaardbaar voor de meeste toepassingen (spectra, zie figuur 2).
- Maatregel het witte licht spectrum zonder filter in de lichtbaan wordt door het vrije einde van de glasvezelkabel uit stap 2.2.2 naar de spectrometer. Met de kalibratie-bestand geladen vanaf stap 2.3, sparen het witte licht spectrum met behulp van de spectrometer van de software als een tekstbestand.
- Corrigeren voor verschillen in intensiteit van licht wanneer interferentiefilters zijn geplaatst in het lichtpad. Elke interferentiefilter kan een ander totaal aantal fotonen te passen en de lage transmissie van bepaalde filters bemoeilijkt verder intensiteit verzwakken zodat alle filters mogelijk gelijk aantal fotonen.
- De relatieve intensiteit (I) per 10 nm bandbreedte interferentiefilter berekenen lossen voor I in de expressie, I = T / sec, waarbij T = het oppervlak van de spectrale curve van elke 10 nm interferentiefilter (van 2.5.3) en s is de maximale absolute bestralingssterkte (y-waarde opgeslagen tekstbestand 2.5.1) van wit licht in de piekgolflengte van elk filter (zie figuur 2 voor een voorbeeld bij 520 nm).
- Verdeel alle berekende intensitven de maximale intensiteitswaarde berekend 2.6.1 normaliseren één en neem de omgekeerde van de relatieve genormaliseerde waarden voor toepassing als een correctiefactor waarbij de grondstof gevoeligheid bij elke golflengte (zie stap 6,4).
- Voer de stappen 2.1 tot en met 2.6 maar één keer eerder een reeks van experimenten. In de loop van een experiment periodiek te nemen van de absolute instraling van de Xenon booglamp onder fel licht en neutral density filters, om ervoor te zorgen dat de intensiteit van het licht stimulus niet verandert.
- Tijdens een experiment eventuele cellulaire respons op licht dat door de interferentiefilters nadert de maximale responsamplitude Gebruik de ND-filters om het signaal te verzwakken. Als ND filters worden gebruikt tijdens een experiment, vertegenwoordigen de overeenkomstige daling in intensiteit tijdens de berekening van de spectrale gevoeligheid.
- Opgericht optische spoor, kalibratie en filters dagen of weken voor experimenten beginnen. Houd filtersafgedekt om stofophoping te voorkomen.
3. Recording Equipment Setup
- Voed dezelfde glasvezelkabel gebruikt voor de kalibratie door middel van een kooi van Faraday en monteren op een goniometrisch apparaat zoals een Cardan arm omtrek (zie figuur 3 voor het schema). De kabel zal ongeveer 10 cm van het oog De monsters.
- Plaats een metalen stadium een vibratie die tafel met een elektrodehouder gemonteerd direct boven het podium onder besturing van een micromanipulator (figuur 4). Plaats de Cardan arm, zodat het monster het hoofd is in het centrum van de bol die door roterende beweging van de arm.
- Met behulp van een intracellulaire voorversterker systeem, dat een versterker (buiten de kooi van Faraday) en voorversterker (headstage, vlakbij de prep in de kooi van Faraday) monteer de headstage boven de metalen podium waar het specimen zal worden geplaatst omvat.
- Sluit een coaxiale kabel aan op de headstage via eenBNC-aansluiting. Opengespleten alleen de tip over het andere uiteinde van de coaxiale kabel en scheid de buitenste metalen mantel van de kabel van de binnendraad.
- Soldeer de buitenmantel (bewaard op aardpotentiaal) met een einde van een geïsoleerde koperdraad met een krokodillenklem aan het andere uiteinde. Deze alligator clip zal hechten aan de metalen referentie-elektrode op het monster platform (stap 5.1.4).
- Soldeer de binnenste draad van de coax-kabel aan op een dunne zilveren draad, om te dienen als de registratie-elektrode. Deze draad moet dun genoeg in de oplossing gevulde glazen elektrode toe te voeren in stap 5.2.3 zijn.
- Plaats een stereomicroscoop bevestigd aan een zwenkarm en gebaseerd op de houten bank buiten de kooi van Faraday, zodat het kan worden gezwaaid om de elektrode in het oog te verlagen en zwaaide terug naar buiten wanneer de elektrode in het oog.
- Zorg ervoor dat alles metalen onderdelen in de kooi van Faraday goed geaard is.
- Buiten de kooi van Faraday, bevestig de preamplifer aan de ingang van een 50-60 Hz ruis verloopstuk (optioneel) en sluit de uitgang op een kanaal van een oscilloscoop met een BNC T-adapter.
- Met het andere uiteinde van de T-adapter, sluit het signaal dat door de oscilloscoop een kanaal van de hardware. Bevestig deze hardware op een computer met een USB-kabel, waardoor de reacties die zijn opgenomen met de voorversterker te worden gelezen door software op de computer.
- Bevestig de sluiter driver van de optische baan naar het tweede kanaal van de oscilloscoop een andere T-adapter en sluit deze aan een pulsgenerator die de frequentie en duur van lichtflitsen afgegeven worden (stap 5,5) bedient.
Opmerking: Setup van het tuig zelf moet slechts één keer worden gedaan. Breek hier tot klaar om opnames te beginnen.
4. Prep op de Dag van de Recording
- Zet de Xenon-lamp ten minste 45 minuten voor het experiment en zet het glas micro-elektrode trekker ten minste 30 minuten vóór pulleng glas elektroden.
- Zet alle opname-apparatuur (sluitertijd, versterker, lawaai eliminator, pulse generator, oscilloscoop, en data-acquisitie hardware) en zorg ervoor dat de sluiter wordt gesloten door standaard zodat er geen licht door de glasvezelkabel.
- Trek fijne borosilicaat (of aluminosilicaat) glas micro-elektroden (100-250 MQ weerstand is ideaal) met behulp van een glas micro-elektrode trekker. Gebruik glas elektroden binnen enkele uren van wordt getrokken.
- Opvulling de elektroden met 3 M kaliumchloride (KCl). Merk op dat deze oplossing kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker, zoals verven injectie.
5. Specimen Prep en Opnameprocedure
- Bereid de Specimen
- Bevestig een individu vlinder in een kleine plastic buis met hete was zodat de kop immobiel en uitsteekt vanaf een einde van de buis. Wax naar beneden slurf, antennes en vleugels (Figuur 5).
- Houd thij buik met een droog stuk van was en houden de buis bevochtigd door het plaatsen van een natte weefsel in de buis achter de buik. Zorg ervoor dat het monster is volledig immobiel.
- Monteer de buis met behulp van een klein stukje van was op een klein platform met een bal-en-socket joint die een magnetische basis is bevestigd.
- Onder een dissectiemicroscoop plaats een zilverdraad met een diameter van 0,125 mm in de kop via de monddelen wordt als referentie-elektrode. Voor het experiment, permanent bevestig de draad aan het platform zodanig dat de koperdraad in stap 3.3.2 kan vastklemmen zodra het platform wordt op het podium voor opname.
- Zodra het referentie-elektrode is op een geschikte plaats kan zijn plaats worden gehouden door snel te smelten en vervolgens afkoelen was rond de draad.
- Met behulp van een breekbare koolstofstaal scheermesje, greep een deel van het blad met een bladhouder en afbreken van een klein stukje om te gebruiken voor het snijden van het hoornvlies.
- Snij een klein gaatje (~ 10 ommatidia diameter) in de linker cornea met het scheermes en sluit de opening met vaseline om uitdroging te voorkomen.
- Zodra het hoornvlies gesneden, plaatst de registratie-elektrode in de ogen zo snel mogelijk omdat hemolymfe in het oog zal snel uitharden en maakt het onmogelijk om een elektrode te voegen. Indien mogelijk uitvoeren van de dissectie in het tuig waar de opname zal plaatsvinden.
Opmerking: Vaseline mag niet gesmeerd op de rest van het oog als deze de optica onscherp.- Als dit niet al op het podium, plaatst de gemonteerde monster en het platform op het podium in de opname rig. Sluit de headstage grond draad van stap 3.3.2 tot de referentie-elektrode op het monster platform met behulp van alligator clips.
Opmerking: Indien mogelijk gebruik maken van een rode filter om het dier te verlichten. - Gebruik een lichtbron met zwanenhals bijlagen kort oplichten het monster onder een stereoscoop terwijl het verlagen van de registratie-elektrode in het oog.
- Insteek de zilverdraad aangesloten op de headstage uit stap 3.3.3 in de KCl oplossing in de achterkant van een glas micro-elektroden. Monteer de glazen elektrode op de elektrode houder.
- Stel de elektrodehouder zodat de micro-elektrode is direct boven de opening voordien in het hoornvlies gesneden, ongeveer een millimeter boven het hoornvlies. Laat de micro-elektrode in het oog met de micromanipulator totdat schakeling is voltooid, zoals blijkt uit een grote verandering in potentiaal (mV) op de oscilloscoop.
- Als dit niet al op het podium, plaatst de gemonteerde monster en het platform op het podium in de opname rig. Sluit de headstage grond draad van stap 3.3.2 tot de referentie-elektrode op het monster platform met behulp van alligator clips.
- Eenmaal in het oog, zwaaien de stereoscoop buiten de kooi van Faraday, en zet de lichtbron het verlichten van het monster. De kamer moet donker worden bewaard zodat de ogen donkere aangepast wordt.
- Controleer de weerstand van de elektrode door een 1 nA stroom van de versterker en gezien de spanningsverandering. Weerstand moet typisch in het gebied tussen 100-250 MQ. Hogere weerstanden zijn indicatief voor verstopping of buigen van de elektrode en lage weerstanden van elektrode breuk.
- Activeer de pulsgenerator zodat de sluiter geopend waarin een lichtflits met een 50 msec elke 0,5 sec, en deze te blijven knipperen gedurende de duur van het experiment.
- Stel de pulsgenerator nu toelaat flitsen van maximaal 50 msec. Deze duur en 0,5 sec pauze tussen flitsen houdt het monster zo dicht mogelijk bij donkere aangepast mogelijk tijdens het experiment. Vijftig msec ligt dicht bij de kortste flitsduur dat dezelfde amplitude zal uitlokken in reactie als langere flash looptijden.
- Re maat responsen aan het begin en einde van het experiment (stap 5.16). In de loop van ongeveer twintig minuten experiment, deze flitsinstellingen niet de respons na verloop van tijd afnemen. Verschillende preps kunnen aanpassingen aan deze flitsinstellingen vereisen.
- Plaats de Cardan arm zodat de glasvezelkabel wordt geleid naar het oog.
- Controleer de oscilloscoop voor spanning verandering bij elke lichtflits.Een negatieve verandering in spanning betekent dat de elektrode nog geen cel is binnengegaan.
- Beweeg de Cardan arm om het monster totdat het onder een hoek voor het oog waarbij er een maximale spanning reactie.
- Draai de micromanipulator heen en weer, waardoor zeer kleine verticale bewegingen van de elektrode in beide richtingen en voorzichtig de onderkant van de elektrodehouder toetsen of met behulp Buzz functie op de voorversterker. Verder kleine aanpassingen tot een depolariserende lichtreactie verschijnt op de oscilloscoop (figuur 6).
- Pas de Cardan arm weer om de hoek van inval, waar een lichtflits produceert het grootste depolariserende signaal te vinden. Maak kleine aanpassingen aan de micromanipulator en gebruik maken van de Buzz-functie op de versterker als nodig is om ervoor te zorgen dat de elektrode stabiel opnemen van de cel en dat het zal blijven in de cel voor het hele experiment (zie stap 5.11).
- Zodra de installatie stabiel is, begint Recording. (: 1 signaal-ruisverhouding minstens 10) een stabiele opname moet weinig of geen verandering in rustpotentiaal, lage achtergrondruis en een constant grote depolariserende respons.
- Start de software op de computer, en beginnen met een "nieuw experiment," die een pop-up venster geopend met vier kanalen.
- Pas de spanning schaal op de rechterbovenhoek van de software-venster tot 500 mV. Het eerste kanaal de reacties opgenomen van de elektrode in real time weer te geven, terwijl het tweede kanaal van de blokgolf door de functiegenerator vastlegt wanneer het signaal via de oscilloscoop voor de data-acquisitie hardware toegevoerd, weergegeven wanneer de sluiter geopend . De andere twee kanalen onnodig.
- Klik op "Start" in de rechter benedenhoek om de opname te starten, en laat de software te draaien voor de duur van het experiment. Pas de zoom van de x (tijd) en y (spanning) assen, zodat de antwoorden zijn duidelijk.
- Ten eerste, met wit licht, opnemen tot 10 individuele reacties met het ND-filter wiel op 3,5 OD (ongeveer 5-10 sec).
- Volgende record hetzelfde aantal reacties op 3,3 OD dan 3,1, 3,0, 2,5, 2,3, 2,1, enz. In elke combinatie tot 0,0 OD. Deze reactie amplitudes het ND-filter serie zal de reactie-log intensiteitscurve voorzien in paragraaf 6. Wanneer bleken optreedt, gebruik minder flitsen van licht stimuli tijdens het experiment.
- Noteer de respons van de cel op alle golflengten, met de interferentiefilters.
- Zoek eerst de golflengte piek. Zonder ND filters in het lichtpad (0.0 OD), plaats een UV-filter zendende in het lichtpad en kort observeer de reactie amplitude. Herhaal dit met een blauwe zendende filter, een groene verzendende filter, en een rode zend- filter, die een idee van waar de grootste gevoeligheid zal moeten geven.
- Gebruik filters op ongeveer 350, 450, 550, 650 nm aan de algemene regio topgevoeligheid vinden instap 5.14.1. De exacte golflengte maakt niet uit in deze eerste fase zoekopdracht omdat alle golflengten in de volgende stap zal worden opgenomen. Als schattingen bestaan uit piek gevoeligheden, of deze eerder zijn opgenomen, om gebruik te maken bekend golflengten snel de grootste gevoeligheid te identificeren.
- Zodra de grootste gevoeligheid of dichtbij wordt geïdentificeerd record op deze golflengte voor 10 reacties (ongeveer 5 seconden).
- Na opname bij de golflengte van maximale reactie, record met de andere interferentiefilters, 300-700 nm bij 10 nm stappen. Start vanaf de piek en stap uit in de richting van zowel de kortere en langere golflengten door het omwisselen van de filters uit het lichtpad één voor één (bijvoorbeeld als de grootste gevoeligheid ligt bij 520 nm, registreert de reacties op deze golflengte, daarna 510 nm, gevolgd door 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, en zo verder tot er geen er geen reactie).
- Toestaan tot 10 reacties per filter (5 seconden elk). Bij het omwisselen interferentie filters, zodat de cel RespNDD tot 1-2 flitsen van wit licht, zonder filter in het lichtpad, wat handig is om te controleren of de grootste gevoeligheid is vernederend loop van de tijd. Verminder het aantal reacties of verhoog de OD als bleken optreedt.
- Als het antwoord in geen interferentie filter is te dicht bij de maximale respons onder wit licht bij 0 OD, daarna verzachten met ND filters. De interferentiefilters en de grootte van de glasvezelkabel bij dit experiment sterk verminderen de lichtintensiteit enz ND filters zijn doorgaans niet noodzakelijk.
- Als de opname blijft stabiel, opnieuw opnemen golflengte rond de piek reactie, dat als pseudoreplicate voor het bevestigen eerdere antwoord amplitudes en helpt de reactie niet afgebroken langere termijn te waarborgen. Zodra alle golflengten worden opgenomen, opnieuw opnemen van de reacties in het kader van de ND-serie, zoals in stap 5.12.
- Zodra de opname is voltooid, klikt u op "Stop" op de software, en de opname voor analyse.
- Na een experiment, offeren de individuele bevroren, of koeling van enkele minuten, gevolgd door snel doorsnijden het hoofd en malen van de thorax.
- Schakel alle apparatuur. Breek hier als voor het doen van de analyse nodig is.
6. spectrale gevoeligheid Analyse
- Met de software die wordt gebruikt om ruwe reacties te nemen, het berekenen van de gemiddelde respons amplitude van 10 individuele antwoorden voor elk filter in het ND-serie en voor elke interferentie filter.
- Maak een response-log-intensiteit (VlogI) functie uit de ND-filter serie opgenomen in Steps 5,12-5,13 (figuur 7). Doe dit door het uitzetten van log-eenheden van de intensiteit (OD) op de X-as, en de respons op elke intensiteit op de y-as.
- Spectrale gevoeligheid van de cel bij verschillende golflengten leiden, doorgaans past de Naka-Rushton vergelijking om de gegevens uit stap 6.2, en deze vergelijking om experimenteel verkregen spectrale respons van verschillende golflengten t betrekkingo opzichte fotonen vereist die reactie onder een constante golflengte (in dit geval wit licht) op te wekken.
Opmerking: De Naka-Rushton vergelijking is: V / V max = I n / (I n + K n), waarin I de stimulus intensiteit, V het responsamplitude, Vmax is de maximale respons amplitude K de stimulus intensiteit geven ½ Vmax en n is de exponentiële helling. Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om deze vergelijking om de VlogI gegevens, waaronder curve fitting software of-code gebaseerde statistische pakketten passen. - Om de Naka-Rushton vergelijking met behulp van eenvoudige berekeningen en een spreadsheet-programma past, transformeren de VlogI respons gegevens voor elk stimulusintensiteit: log [(V max / V) - 1]. Voer vervolgens lineaire regressie op de getransformeerde gegevens om de vergelijking van de lijn van de beste pasvorm te krijgen.
Opmerking: Vmax moet groter zijn dan alle gemeten reacties zijn; deze consistent is deze methode schat Vmax als 1% grater dan de hoogste gemeten respons. - Uit de vergelijking van de regressielijn, schatten de exponent (n) bij het nemen van de negatieve helling, en log (K) = y-as / n.
- Spectrale gevoeligheid van de cel bij verschillende golflengten leiden, doorgaans past de Naka-Rushton vergelijking om de gegevens uit stap 6.2, en deze vergelijking om experimenteel verkregen spectrale respons van verschillende golflengten t betrekkingo opzichte fotonen vereist die reactie onder een constante golflengte (in dit geval wit licht) op te wekken.
- Zodra de parameters Vmax, n en K zijn geschat, bepaalt het relatieve aantal fotonen vereist om de spectrale respons van de cel op elke golflengte wekken door het aansluiten van de gemeten spectrale responsie bij een bepaalde golflengte (V) en het oplossen voor I.
- Vermenigvuldig het berekende stimulus intensiteit (I) van stap 6.3 met correctiefactor per interferentiefilter (uit stap 2.4.3) bij elke golflengte.
- Om de gevoeligheid te krijgen, moeten alle intensiteiten worden gerelateerd aan de Vlog-I curve zodat ze kunnen worden vergeleken. Doe dit door in verband elke golflengte intensiteit V max of K ½, berekend in stap 6.2.3.
- Trek elke gecorrigeerd golflengte intensiteit (Stap 6.4) van K.
- Dan voor elke golflengte intensiteit, voeg deze "afstand van K "waarde K, en vermenigvuldigen met (-1).
- Volgende brengen alle gegevenspunten positief door toevoeging van de absolute waarde van de laagste gegevenspunt in de reeks elke golflengte.
- Vind gevoeligheid bij elke golflengte van het nemen van de wederzijdse van alle nieuw berekende intensiteiten van Stap 6.5.1. Transformeer de gegevens, zodat de gevoeligheid spectrum ligt tussen 0 en 1.
- Na het opnemen van meer dan één cel van hetzelfde type gemiddelde het uiteindelijke reacties en grondstuk standaardfout bars of 95% betrouwbaarheidsintervallen (Figuur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor veel elementen van de opname setup, heeft een beschrijving niet voldoende detail. Figuur 1 is een schema van de bij de volledige opname setup componenten. In figuur 2, worden spectra weergegeven voor wit licht en elk interferentiefilter een gevoel waarom een correctiefactor nodig is en wat nodig is om deze correctie te berekenen geven. Figuur 3 toont foto's en een schema van de Cardan arm die wordt gebruikt voor deze experimenten. Figuur 4 is een samengestelde afbeelding met de opname podium en micromanipulator. Figuur 5 toont verscheidene stappen in de bereiding van een vlinder voor het experiment.
Zodra een opname begint, een negatieve verandering in spanning in reactie op een lichtflits betekent dat de elektrode buiten een cel, zoals in figuur 6a. De kracht van de reactie is afhankelijk van de nabijheid van de elektrodetip een afdrukband cel, en de invalshoek van het licht knipperen. De reactie moet groot zijn (> 30 mV) voor de tip is dicht genoeg bij een cel te spietsen. Figuur 6b toont een duidelijke depolariserende reactie op een lichte prikkel, betekenende binnenkomst in een foto-cel. De rustpotentiaal moet stabiel zijn en de responsamplitude moet groot zijn (minstens 40 mV), hoewel de absolute amplitude sterk kan variëren. Wij meten relatieve respons, dus is het belangrijk dat de signaal-ruisverhouding hoog. Indien de rustpotentiaal sterk wisselt, de respons golfvorm lijkt ongewone of de maximale respons te laag is, dan vergelijkt relatieve respons voor alle interferentiefilters onmogelijk. Voorbeelden van onbruikbare opnames worden getoond in figuur 6c, 6d.
Na het voltooien van de opname is, moet de ND reacties worden uitgezet en de Naka-Rushton vergelijking moet de data 33 worden aangebracht, shown in figuur 7. Dit cijfer wordt uitgezet met behulp van de ND-filter serie, zonder enige inmenging filters. Als de opname stabiel is, moeten de gegevens van de ND-filter serie Soortgelijke vóór en na het experiment. Spectrale gevoeligheid wordt bepaald door het aanbrengen van de Naka-Rushton vergelijking om de VlogI grafiek in figuur 7, dan oplossen van (I) voor elke reactie (V) bij een gegeven golflengte, zoals in de berekening van sectie 6 van het protocol.
Een representatief voorbeeld van spectrale gevoeligheid afkomstig is van één opname is uitgezet in figuur 8a (let op: dit voorbeeld toont real berekende gegevens, maar de piek is verschoven, omdat dit resultaat is niet gepubliceerd). celtypen kunnen worden ondergebracht topgevoeligheid bij dezelfde golflengte en algemene vorm van de gevoeligheid spectrum. Vergelijkbare celtypen worden dan gemiddeld en de gemiddelde gevoeligheid wordt uitgezet met standaard error bars in elke golflengte in Figure 8b. Spectrale gevoeligheden van de drie typische celtypes in een insect worden getoond in Figuur 8c (magnitude en foutbalken worden berekend uit echte data, maar de pieken verschoven).
Figuur 1:. Schema van opname-apparatuur Onderdelen van het lichtpad, specimen setup, en het opnemen van hardware worden aangeduid. Optische spoor zit op de houten bank buiten de kooi van Faraday. Xe, xenon booglamp, Cd, condensor assemblage, Lx, bolle lens, ND, grijsfilter wiel, Cf, interferentie filter, S, sluitertijd, Lc, concave lens, Co , collimeren straal sonde, Fo, glasvezelkabel. De kooi van Faraday bevindt zich op dehouten bankje rond het monster. De houten bank zit boven, maar doet de vibratie geïsoleerde marmeren tafel niet onder te raken. Opname (Rc) en referentie (Rf) elektroden zijn bevestigd aan de headstage (Hs). Rc wordt ingebracht in het oog (E) en Rf wordt ingebracht in een ander deel van het lichaam. Het headstage is onderdeel van de voorversterker (Pa) opstelling buiten de kooi van Faraday. Het signaal wordt doorgegeven van de voorversterker via de Humbug lawaai verloopstuk (Hb), en in de oscilloscoop (Os). Van de oscilloscoop het signaal loopt de Powerlab hardware (Plb) en in de laptop computer (CPU) wanneer wordt gelezen door de LabChart software. De sluiter wordt bestuurd door een functiegenerator (Fg) die via een tweede kanaal op de oscilloscoop wordt doorgegeven, en kunnen ook via een tweede kanaal worden overgedragen Powerlab de hardware als dit signaal zal ook worden geregistreerd.
Figuur 2:. Wit Licht en interferentie Filter Spectra gebruikt om Correctiefactoren berekenen van de spectra gemeten in stap 2.5 van het protocol worden getoond 300-700 nm, voor wit licht, alsmede elk van de 41 interferentie filters. Elke interferentie filter spectrum wordt gemeten met alleen dat filter in het lichtpad. T 520 komt overeen met het gebied onder het spectrum van het filter met een piek 520 nm en 520 en komt overeen met de intensiteit van wit licht piekgolflengte van het filter, 520 nm. Deze waarden worden gebruikt bij het berekenen van de correctiefactoren voor elk filter (in dit geval 520 nm) zoals beschreven in stap 2.6 in het protocol.
Figuur 3:. Beschrijving Cardan Arm Perimeter gebruikt in de experimenten De Cardan arm houdt de glasvezelkabel en biedt volledige sferische rotatie en hoekinstelling zodat licht kan worden afgegeven in de juiste invalshoek aan de cel wordt opgenomen. (A) Top down view. (B) Uitzicht vanaf de zijkant in een hoek. Nummers corresponderen met hetzelfde deel van alle panelen. (1) De bodemplaat maakt volledige cirkelvormige rotatie in het horizontale vlak. (2) de verticale plaat maakt volledige cirkelvormige rotatie van de arm in een verticaal vlak. (3) Deze cilinder bevat de metalen arm van de glasvezelkabel aan het uiteinde, en geeft een tweede verticaal vlak een cirkelvormige rotatie loodrecht op (2). (4) De glasvezelkabel wordt gehouden in plaats aan het einde van de arm, en het licht wordt gericht naar de plaats van het monster in de experimentele opstelling.
Figuur 4:. Onderdelen van de Recording Setup (A) Plastic buis gebruikt om het monster te houden. (B) Lucht mening van het platform waarop het monster en de buis zijn gemonteerd. (C) Zijaanzicht van de ball-and-joint platform met magnetische voet (1). Referentie-elektrode gehouden immobiel met lijm en was aan de zijkant van het platform (2). Referentie-elektrode gewikkeld rond alligator clip en gesoldeerd op zijn plaats, het verstrekken van een bijlage gebied waar de headstage referentie-elektrode kan clip (3). (D) elektrode onder 20x vergroting. Schaal bar, 25 pm. (E) Stage, elektrodehouder en micromanipulator setup. De headstage (1) boven de inrichting met de vastezilver opname draad (2), en de referentie-elektrode met een alligator clip (3) bevestigd. Elektrodehouder (4) is bevestigd aan een handmatige micromanipulator (5) met een post daaronder kan worden ingesteld met knop voor verticale beweging of kan worden geduwd of getrokken voor horizontale beweging van de elektrodehouder. De magnetische platform met exemplaar zit op het podium (6) net onder de elektrode houder. (F) omringt de kooi van Faraday de opname opstelling met een scherm dat in de voorzijde kan worden getrokken of. Aluminiumfolie wordt geplaatst onder alle apparatuur met rubberen pads op de top. De glasvezelkabel (1) leidt naar de kooi van de optische baan buiten, en wordt geleid door de Cardan arm (2) naar het werkvlak (3). De opname podium en manipulator apparaat wordt geplaatst in een zandbak (4) rust op een marmeren tafel onder de setup. Alle andere apparatuur berust op de houten bank top die niet de marmeren tafel te raken. De zandbak ligt op de top van de marmeren tafel in een gatuitgesneden van de houten tafel, zodat het monster volledig vibrationally geïsoleerd van de apparatuur op de houten tafelblad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Butterfly Prep (A) De vlinder is in de buis en het hoofd, vleugels geplaatst, en antennes worden geïmmobiliseerd met hete wax. De neutrale elektrode wordt ingebracht in de mondstukken (1), is een droge gebruikte was ingedrukt houden van de buik (2), en een vochtige tissue wordt achter het specimen. (B) Close-up van het hoofd was gezet naar beneden. Het oog op te nemen uit (1) wordt duidelijk uit was of puin gehouden, en de referentie-elektrode (2) in de monddelen gestoken en heet kaarsvet snel gesmolten erover om het op zijn plaats te houden.(C) Een gat in het oog waarin de rozewit fotoreceptor cellaag zichtbaar gesneden. Pigment zwart en geel hemolymfe afwezig. (D) Zijaanzicht van het monster met een glas registratie-elektrode (1) geplaatst in het oog en de indifferente elektrode (2) aan de kop fase, die een circuit moet voltooien zoals te zien op de oscilloscoop. Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
Figuur 6:. Ruw Antwoorden van voorbeeld Recordings Elke reactie komt overeen met een lichtflits van 50 msec (zwarte staven). (A) Een voorbeeld van de grote negatieve spanningsverandering die alleen moet worden gezienvoor het invoeren van een cel. (B) Een schoon opname moet weinig ruis en een grote depolariserende respons, typisch ten minste 40 mV. (C) Een voorbeeld van een slechte opnamekwaliteit te wijten aan de negatieve potentiaal verandering na de belangrijkste piek (pijlpunten). (D) Een ander voorbeeld van een slechte opname. De rustpotentiaal ondergaat grote fluctuaties (rode balk) en de grote hoeveelheid achtergrondruis kan de amplitude van de respons (pijlpunt) verduisteren.
Figuur 7:. Reactie-intensiteit Log-lineaire functie Dichte rondjes geven de gemeten respons van een cel 3,5-0 OD voor deze experimentele opstelling. Lichtintensiteit op een logaritmische schaal. Bij zeer hoge intensiteiten de respons is verzadigd, en tegen zeer lage intensiteit een kleine respons aanhoudt in plaats van te laten vallen naar nul langs de lijn. THij Naka-Rushton vergelijking 33 wordt aangebracht op deze niet-lineaire vorm (stippellijn).
Figuur 8:. Spectrale gevoeligheid Voorbeelden (A) reacties Een enkele typerende cellen werden geregistreerd en relatieve spectrale gevoeligheid berekend. De piek van deze cel is bij 440 nm, wat betekent dat het reageert het beste op blauw licht. Enkele cel data kan er lawaaierig (piek bij 380 nm). (B) Cellen met dezelfde relatieve piek en vorm samen gemiddeld en standaard error bars worden toegevoegd. Hier, zeven blauwe cellen uit zeven personen werden gemiddeld sterke aanwijzingen dat een type cel bestaat in deze soort maximaal gevoelig voor licht bij 440 nm. (C) Deze werkwijze kan worden herhaald voor alle celtypes gevonden en uitgezet samen. Insect ogen variëren sterk in hun spectrale gevoeligheden, maar een typische insect kan pieken hier hebben, bij 370 nm, 440 nm en 510 nm. Opmerking Deze spectrale gevoeligheden worden allemaal berekend reële gegevens, maar de pieken zijn verschoven omdat de gegevens nog niet voor deze soort is gepubliceerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intracellulaire opname kan een moeilijke techniek om te beheersen vanwege de vele technische trappen. Voor een succesvolle experimenten een aantal belangrijke punten moet worden beschouwd. Ten eerste is het belangrijk om een goed trilling geïsoleerde tafel waarop het experiment werd uitgevoerd hebben. Veel onderzoekers gebruikslucht tabellen, die het tafelblad volledig gescheiden van de basis, waardoor superieure trillingsisolatie. Onze opstelling betreft een dikke marmeren tafel met een zandbak op de top, waarin wordt geplaatst micromanipulator / elektrode houder / specimen stadium apparaten. Dit is een effectieve en goedkoper alternatief voor een luchttafel, vooral als toegang tot interne gas of perslucht beperking. Extra trillingsabsorberende maatregelen kunnen worden genomen zoals passieve luchtvering, of het toevoegen van demping elementen om de tafelpoten (bijv geopend tennisballen, fiets buizen, dikke gel pads). Voorts is het essentieel dat de experimentele opstelling worden in eenKooi van Faraday met alles geaard. De Faraday kooi moet een metaalgaas scherm vooraan die verwijderd kunnen worden bij het werken in de kooi en vervangen gemakkelijk tijdens het opnemen. Zelfs een kleine hoeveelheid omgevingslicht elektrische ruis (met name 50 Hz lawaai van de belangrijkste AC-voeding) kan een anders goede opname onbruikbaar te maken.
Bij de voorbereiding van het monster, hemolymfe en pigment lagen rond de ommatidia kan succesvolle opnames te voorkomen. Als het gat in het hoornvlies te groot wordt gesneden, normale pompen van hemolymfe in het lichaam veroorzaakt het vloeistofoppervlak omhoog en omlaag op de snede plaats, wat resulteert in een onstabiele opname. Zodra het gat wordt gesneden, zal hemolymfe en oppervlakte pigmentlagen snel stolt tot een ondoordringbare korst zelfs wanneer afgedicht met vaseline, dus is het belangrijk om de elektrode in de ogen zo snel mogelijk. Ringer's oplossing kan ook worden gebruikt in plaats van vaseline. De aardelektrode kan worden ingebracht in demonddelen of in de stronk van een cut-antenne.
Bovendien is het vaak nuttig om het dier donker aangepaste mogelijk te houden. Voor deze methode, onder meer stappen waarbij de opnameruimte erg donker, het blokkeren van strooilicht van de Xenon-lamp uit het invoeren van de kooi van Faraday, korte duur stimulus flitsen (30-50 msec), en een laag genoeg frequentie tussen flitsen (0,5 of hoger). Wanneer een visuele pigment absorbeert een foton, de chromofoor in rhodopsine schakelt van 11- cis-3-hydroxyretinal om all - trans -retinal, het induceren van de conformationele verandering van de opsin eiwit, en het activeren van het gehele complex als metarhodopsin, waarbij de G-eiwit initieert cascade. Foto-bleken treedt op wanneer een hoge intensiteit licht zorgt ervoor dat de chromofoor om fysiek te scheiden van de opsin eiwit. Time is een beperkende factor in dit experiment, omdat de elektrode enige stabiele reacties binnen de cel opnemen van een bepaalde periode voordat het uitvaltof het membraan beschadigd. Om deze reden hebben we niet breken om de cel te herstellen, maar we maken gebruik van een flitser duur en de frequentie die we hebben gevonden is niet de reactie van de cel na verloop van tijd afnemen. Het is belangrijk om zowel de frequentie en intensiteit van het licht afnemen als foto-bleken optreedt.
Tijdens de opname kan een grote elektrode tip of grote beweging van de elektrode de cel beschadigt bij het penetreren van de membraan. Alleen fijne tips (tenminste ~ 100 MQ) en kleine bewegingen moeten worden gebruikt bij het naderen van een cel voor opname. Als intracellulaire opname toegepast op andere toepassingen, zoals hersenen opnames, kan zeer fijne, stevige elektroden worden getrokken met behulp kwartsglas, maar een speciale trekker moet worden gebruikt voor deze elektroden. Bij de eerste van een elektrode te trekken programma maken, checkten we tip weerstand door opvullen van de elektrode, vast aan de elektrode houder in een mock setup, en het plaatsen van de tip en massa-elektrode in zoutoplossing. Next we toegepast een stroom om verandering in spanning op de oscilloscoop te meten. Om de elektrode tip we gebruik maken van een handmatige micromanipulator die beweegt langs twee assen te verplaatsen. Andere manipulators zijn, inclusief digitale apparaten die kunnen bewegen langs alle drie de assen en deze kunnen worden gebruikt voor deze of complexere toepassingen. Er zijn vele manieren om een podium voor opname bouwen, en er zijn vele verschillende typen hardware en software voor het registreren en analyseren van de waargenomen gegevens. Onze installatie vertegenwoordigt een eenvoudig, gemakkelijk en betaalbaar setup van de opname rig.
Bij het construeren van de curve VlogI, functies ontwikkeld door Naka en Rushton 33 cs 34,35 aanmerking voor de niet-lineaire gedeelten van de geplotte reacties. Verschillende methoden worden gebruikt om deze bocht naar gegevens aanpassen en uitgezet we de resultaten van een dergelijke werkwijze die geen curve-fitting software vereist, hoewel andere werkwijzen zijn ook geschikt 36,37 (
Een beperking van de methode is dat als de studie organisme meer dan één genetisch soortgelijke opsin in het oog uitdrukt, kan het moeilijk zijn om te bepalen welke opsin mRNA waarschijnlijk overeenkomt met welk spectrale klasse fotoreceptorcel. Om dit probleem te verhelpen, heeft deze werkwijze gecombineerd met kleurstof-injecties en in situ hybridisatie en immunohistochemie op de opsins succesvol identificeren expressie in cellen opgenomen 10.
Onze methode is eenvoudig en toegankelijk voor onderzoekers niet bekend zijn met visuele elektrofysiologie. Deze techniek is gebruikelijk in neurologie, maar specifieke en duidelijke methoden afwezig zijn in de literatuur, waardoor deze werkwijze moeilijk te reproduceren. Hoewel vele variaties van deze techniek bestaat, bieden wij een eenvoudige manier om de spectrale gevoeligheid in de samengestelde oog te meten. De fysiologische gegevens is een belangrijk bewijsstuk in de verhalen van de visuele ecologie en evolutie 41. Opsin sequentievariatie is nauw verbonden met de gevoeligheid van een fotoreceptor cellen, waardoor deze werkwijze geschikt voor studies naar de genetische basis van fenotypische veranderingen. Meting van fotoreceptorcel gevoeligheden kan ook worden gecombineerd met gedrags-discriminatie kleur assays, waarin de fysiologische basis voor belangrijke discriminatie drempels in kleur visie 42-46. Genetische of therapeutische manipulaties in Drosophila bijvoorbeeld, deze technique kan een goede manier om de juiste fysiologische functie van het oog of de hersenen, alsmede 47,48 meten. Hoewel onze is niet de eerste of de meest complexe methode van intracellulaire opname in het oog, onze hoop is dat we deze methode meer gemakkelijk beschikbaar voor de voortplanting en de integratie in onderzoeksprogramma's buiten het formele neurowetenschappen kan maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken de late Rudy Limburg voor het vervaardigen van de cardan arm omtrek, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, en Raju Metherate voor het lenen ons apparatuur en Almut Kelber en Kentaro Arikawa, voor bemoediging. Dit werk werd ondersteund door een National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship om KJM en NSF subsidie IOS-1257627 naar ADB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al. Heterologous expression of Limulus rhodopsin. J. Biol. Chem. 278, 40493-40502 (2003).
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413, 186-193 (2001).
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D. Red-absorbing visual pigment of butterflies. Science. 203, 1125-1127 (1979).
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
