De elektrofysiologische techniek van intracellulaire opname wordt gebracht en benut spectrale gevoeligheden van enkele fotoreceptorcellen bepalen het samengestelde oog van een vlinder.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bepaling van fotoreceptorcel spectrale gevoeligheid hebben een Insect Model van
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Intracellulaire opname is een krachtige techniek gebruikt om te bepalen hoe een enkele cel kan reageren op een bepaalde prikkel. In de visie van het onderzoek, is de intracellulaire opname van oudsher een veel voorkomende techniek die gebruikt wordt om de gevoeligheden van de individuele fotoreceptorcellen bestuderen om ander licht stimuli die nog vandaag wordt gebruikt geweest. Toch blijft er een gebrek aan gedetailleerde methodologie in de literatuur voor onderzoekers die willen intracellulaire opname experimenten repliceren in het oog. Hier presenteren we de insecten als model voor het onderzoeken oog fysiologie algemeen. Insect fotoreceptorcellen bevinden zich in de buurt van het oppervlak van het oog en zijn dus gemakkelijk te bereiken, en veel van die betrokken zijn bij de visie mechanismen zijn geconserveerd over dierlijke phyla. We beschrijven de basisprocedure voor in vivo intracellulaire opname van fotoreceptorcellen in het oog van een vlinder, met het doel om deze techniek toegankelijker voor onderzoekers maar weinig ervaring in electrophysiology. We introduceren de basisuitrusting die nodig is, hoe je een live-vlinder voor te bereiden voor het opnemen, hoe je een glas micro-elektrode in een enkele cel, en tenslotte de opname procedure zelf in te voegen. Ook de elementaire analyse van ruwe responsgegevens leggen voor het bepalen van de spectrale gevoeligheid van individuele celtypen. Hoewel onze protocol gericht op het vaststellen spectrale gevoeligheid, andere stimuli (bijv gepolariseerd licht) en variaties van de werkwijze van toepassing op deze opstelling.
Inleiding
De elektrische eigenschappen van cellen zoals neuronen worden waargenomen door het meten ionenstroom door celmembranen als een verandering in spanning of stroom. Verschillende elektrofysiologische technieken ontwikkeld om bio-elektrische gebeurtenissen in cellen te meten. Neuronen in de ogen van dieren toegankelijk zijn en de schakeling is vaak minder complex dan in de hersenen, waardoor deze cellen goede kandidaten voor elektrofysiologisch onderzoek. Voorkomende toepassingen van elektrofysiologie in het oog omvatten Electroretinografie (ERG) 1,2 en micro-elektrode intracellulaire opname. ERG betreft het plaatsen van een elektrode in of op het oog van een ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren werden behandeld zo humaan mogelijk. Insecten werden verzonden als poppen uit Costa Rica Entomologische Supply, Costa Rica.
1. Heliconius Poppen Care
- Hang alle poppen afstand van 2-3 cm van elkaar in een vochtige kamer met behulp van insect pinnen.
- Na eclosion, laat vleugels drogen dan blijven de vlinders leven gedurende ten minste 1 dag in een vochtige kamer en diervoeders een verdunde honing oplossing dagelijks voor de opname.
- Verdunnen honing met water tot ongeveer 20% honing oplossing door volume, en giet het in een ondiepe petrischaal.
- Breng individuele vlinders de petrischaal, één voor één. Bi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor veel elementen van de opname setup, heeft een beschrijving niet voldoende detail. Figuur 1 is een schema van de bij de volledige opname setup componenten. In figuur 2, worden spectra weergegeven voor wit licht en elk interferentiefilter een gevoel waarom een correctiefactor nodig is en wat nodig is om deze correctie te berekenen geven. Figuur 3 toont foto's en een schema van de Cardan arm die wordt gebruikt voor deze experimenten. Figuur 4
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Intracellulaire opname kan een moeilijke techniek om te beheersen vanwege de vele technische trappen. Voor een succesvolle experimenten een aantal belangrijke punten moet worden beschouwd. Ten eerste is het belangrijk om een goed trilling geïsoleerde tafel waarop het experiment werd uitgevoerd hebben. Veel onderzoekers gebruikslucht tabellen, die het tafelblad volledig gescheiden van de basis, waardoor superieure trillingsisolatie. Onze opstelling betreft een dikke marmeren tafel met een zandbak op de top, waarin word.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken de late Rudy Limburg voor het vervaardigen van de cardan arm omtrek, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, en Raju Metherate voor het lenen ons apparatuur en Almut Kelber en Kentaro Arikawa, voor bemoediging. Dit werk werd ondersteund door een National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship om KJM en NSF subsidie IOS-1257627 naar ADB
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Butterfly pupae | Meerdere lokale soorten beschikbaar, USDA-vergunningen nodig voor verzending. Carolina Bio Supply heeft verschillende insectensoorten die binnen de VS kunnen worden besteld zonder aanvullende vergunningen | ||
| Large plastic cylinder | Elke kamer die bevochtigd blijft, zal werken | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Elke honing of sucrose-oplossing werkt | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | Deze adapter laat de glasvezel in de collimatorhouder passen |
| 600 μm diameter UV-vis fiber optic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel maakt nu deel uit van Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 |
Referenties
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
