הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן

11K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53829

⸱

26 בפברואר 2016

 ,  , 
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

במאמר זה

סיכום

הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.

תקציר

הקלטה תאית היא טכניקה רבה עצמה להשתמש כדי לקבוע כיצד תא בודד יכול להגיב לגירוי נתון. במחקר חזון, הקלטה תאית כבר היסטורי טכניקה נפוצה בשימוש ללמוד רגישויות של תאי קולטי אור פרט לגירויים באור שונים כי הוא עדיין בשימוש כיום. עם זאת, יש עדיין מחסור של המתודולוגיה מפורט בספרות לחוקרים המעוניינים לשכפל ניסויי הקלטה תאיים בעיניים. כאן אנו מציגים את מקק מודל לבחינת פיזיולוגית עין באופן כללי יותר. תאי קולטי אור חרקים נמצאים קרוב לפני השטח של העין ולכן קלים להגיע, ורבי המנגנונים המעורבים חזון שמורים פני טווח מערכת חיה. אנו מתארים את ההליך הבסיסי הקלטת in vivo התאית של תאי קולטי אור בעיניים של פרפר, עם המטרה של עשיית טכניקה זו לנגישה יותר חוקר עם ניסיון קודם קצת בדוארlectrophysiology. אנחנו מציגים את הציוד הבסיסי הדרוש, איך להכין פרפר חי להקלטה, כיצד להוסיף microelectrode זכוכית לתוך תא בודד, ולבסוף הליך ההקלטה עצם. אנו גם להסביר את הניתוח הבסיסי של נתונים בתגובת גלם לקביעת רגישות ספקטרלית של סוגי תאים בודדים. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד בקביעת רגישות ספקטרלית, גירויים אחרים (למשל, אור מקוטב) וריאציות של השיטה הם החלימו על התקנה זו.

מבוא

התכונות החשמליות של תאים כגון נוירונים הם נצפו על ידי מדידת זרימת יונים על פני קרום התא כשינוי מתח או זרם. מגוון של טכניקות אלקטרו פותח כדי למדוד אירועים ביואלקטריים בתאים. נוירונים נמצאים בעיני חיות נגישים המעגלים שלהם הם בדרך כלל פחות מורכבים ממה במוח, מה שהופכים תאים אלה מועמדים טובים במחקר אלקטרו. יישומים נפוצים של אלקטרופיזיולוגיה בעיניים כוללים electroretinography (ERG) 1,2 ו הקלטה תאית microelectrode. ERG כוללת הצבת אלקטרודה או על העין של חיה, החלת גירוי אור, ומדידת השינוי במתח כסכום של התגובות של כל התאים הסמוכים 3-6. אם מישהו מעוניין במיוחד באפיון רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור בודדים, לעתים קר....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל החיות טופלו באופן הומני ככל האפשר. חרקים נשלחו כמו גלמים מקוסטה ריקה אספקה ​​האנטומולוגי, קוסטה ריקה.

טיפול 1. Heliconius גלמים

  1. Hang כל גלמים במרווחים 2-3 ס"מ בתא humidified באמצעות סיכות חרקים.
  2. לאחר eclosion, לאפשר כנפיים לייבוש ולאחר מכן לשמור פרפרים בחיים 1 יום לפחות בתא humidified ולהאכיל פתרון דבש לדלל יומי לפני ההקלטה.
    1. לדלל דבש עם מים לכ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עבור אלמנטים רבים של הגדרת ההקלטה, תיאור בכתב אינו מספק פירוט מספיק. איור 1 הוא סכימטי של הרכיבים מעורבים הגדרת ההקלטה המלאה. באיור 2, ספקטרה הם זממו עבור אור לבן כל מסנן התערבות כדי לתת תחושה של למה בגורם תיקון נחוץ ומה נדרש כדי לחשב את התיקון הזה. איור 3 מציג תמונות ותרשים של הזרוע קרדן המשמש אלה ניסויים. איור 4 היא תמונה מורכבת מראה להקליט את הבמה ואת micromanipulator. איור 5 מראה כמה .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקלטה תאית יכולה להיות טכניקה קשה לשלוט בשל הצעדים טכניים הרבים המעורבים. עבור ניסויים מוצלחים כמה נקודות חשובות יש לקחת בחשבון. ראשית, חשוב שיהיה שולחן מבחינת רטט-מבודד כראוי שבו הניסוי מבוצע. חוקרים רבים משתמשים בלוחות אוויר, אשר לחלוטין להפריד את השולחן מהבסיס, מתן בידוד רעידות מעולה. ההגדרה שלנו כרוכה שולחן שיש עבה עם ארגז חול על גבי, שלתוכו הוא הניח את בעל micromanipulator / אלקטרודה / דגימת מנגנון במה. זוהי אלטרנטיבה יעילה יותר סבירה כדי שולחן אוויר, במיוחד אם גישה לגז בתוך .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים המנוח רודי לימבורג בודת היקף זרוע קרדן, קימברלי ג'יימיסון, מתיו מקהנרי, ו ראג'ו Metherate עבור השאלה לנו ציוד, Almut קלבר ו קנטר Arikawa, על עידוד. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע (NSF) כדי KJM ומענק NSF IOS-1,257,627 ל ADB

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גלמימספר מינים מקומיים זמינים, זקוקים לאישורי USDA למשלוח. ל-Carolina Bio Supply יש מספר מיני חרקים שניתן להזמין בתוך ארה"ב ללא צורך באישורים נוספים
גלילכל תא שנשאר לח יעבוד
סיכות חרקים, גודל 2BioQuip1208B2
100% Desert MesquiteHoney Trader Joe'sכל תמיסת דבש או סוכרוז תעבוד
מנורת קשת קסנוןOriel מכשירים66003אוריאל הוא כעת חלק מאספקת
החשמל האוניברסליתOriel Instruments68805אוריאל הוא כעת חלק מ-Newport
Corporation Optical TrackOriel Instruments11190Oriel הוא כעת חלק מ-Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel הוא כעת חלק מתאגיד
ניופורטמנשא מסילה, קטן (4x)Oriel Instruments11647Oriel הוא כעת חלק ממתאם חוט של Newport Corporation
, 8-32 זכר עד 1/4-20 זכר, חבילה של 10של Newport CorporationTA-8Q20-10
, 1.0 אינץ', 0.5 אינץ'. נירוסטה, 8-32 & 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
מחזיק עמוד אופטי ללא החלקה, 2 אינץ', 0.5 אינץ'. עמודים בקוטר, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
תושבת עדשה קבועה, 50.8 מ"מNewport CorporationLH-2
תושבת עדשה קבועה, 25.4 מ"מNewport CorporationLH-1
מכלול עדשת מעבהNewport Corporation60006
עדשת סיליקה קמורה, 50.8 מ"מNewport CorporationSPX055
גלגל מסנן בעל שישה מצבים, x2Newport CorporationFW1X6
רכזת תושבת גלגל מסנןNewport CorporationFWM
עדשת סיליקה קעורה, 25.4 מ"מNewport CorporationSPC034
Newport Corporation77612
בדיקת קרן קולימציהNewport Corporation77644
ממיר פרול, סיומת SMA ל-11 מ"מ תקן FerruleNewport Corporation77670מתאם זה מאפשר לסיב האופטי להתאים למחזיק הקולימטור 
600 μ כבל סיבים אובטיים בקוטר UV-visOriel Instruments78367Oriel הוא כעת חלק מתריס תאגיד ניופורט
עם יחידת הנעהUniblitz100-2B
UV מסנן ND מתכתי התמזגות, 0.1 ODNewportFRQ-ND01
UV מסנן ND מתכתי סיליקה התמזגות, 0.3 ODNewportFRQ-ND03
UV מסנן ND מתכתי סיליקה התמזגות, 0.5 ODמסנןFRQ-ND05
UV, מסנן NDניופורטFRQ-ND10 OD ניופורט FRQ-ND10
מסנן NDניופורטFRQ-ND30
UV התמזגות, מנורת 3.0 ODניופורטFRQ-ND50
LS-1-Calאופטיקה אוקיינוסLS-1-Cal
ספקטרומטראופטיקה אוקיינוסUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
מסנן הפרעות פס, 300 ננומטר Edmund Optics67749
מסנן פס פס הפרעות, 310 ננומטר Edmund Optics67752
מסנן פס פס הפרעות, 320 ננומטר Edmund Optics67754
מסנן פס פס הפרעות, 330 ננומטר Edmund Optics67756
מסנן פס פס הפרעות, 340 ננומטר Edmund Optics65614
מסנן פס פס הפרעות, 350 ננומטר Edmund Optics67757
מסנן פס פס הפרעות, 360 ננומטר Edmund Optics67760
מסנן פס פס הפרעות, 370 ננומטר Edmund Optics67761
מסנן פס פס הפרעות, 380 ננומטר Edmund Optics67762
מסנן פס פס הפרעות, 390 ננומטר Edmund Optics67763
מסנן פס פס הפרעות, 400 ננומטר Edmund Optics65732
מסנן פס פס הפרעות, 410 ננומטר Edmund Optics65619
מסנן פס פס הפרעות, 420 ננומטר Edmund Optics65621
מסנן פס פס הפרעות, 430 ננומטר Edmund Optics65622
מסנן פס פס הפרעות, 440 ננומטר Edmund Optics67764
מסנן פס פס הפרעות, 450 ננומטר Edmund Optics65625
מסנן פס פס הפרעות, 460 ננומטר Edmund Optics67765
מסנן פס פס הפרעות, 470 ננומטר Edmund Optics65629
מסנן פס פס הפרעות, 480 ננומטר Edmund Optics65630
מסנן פס פס הפרעות, 492 ננומטר Edmund Optics65633
מסנן פס פס הפרעות, 500 ננומטר Edmund Optics65634
מסנן פס פס הפרעות, 510 ננומטר Edmund Optics65637
מסנן פס פס הפרעות, 520 ננומטר Edmund Optics65639
מסנן פס פס הפרעות, 532 ננומטר Edmund Optics65640
מסנן פס פס הפרעות, 540 ננומטר Edmund Optics65642
מסנן פס פס הפרעות, 550 ננומטר Edmund Optics65644
מסנן פס פס הפרעות, 560 ננומטר Edmund Optics67766
מסנן פס פס הפרעות, 570 ננומטר Edmund Optics67767
מסנן פס פס הפרעות, 580 ננומטר Edmund Optics65646
מסנן פס פס הפרעות, 589 ננומטר Edmund Optics65647
מסנן פס פס הפרעות, 600 ננומטר Edmund Optics65648
מסנן פס פס הפרעות, 610 ננומטר Edmund Optics65649
מסנן פס פס הפרעות, 620 ננומטר Edmund Optics65650
מסנן פס פס הפרעות, 632 ננומטר Edmund Optics65651
מסנן פס פס הפרעות, 640 ננומטר Edmund Optics65653
מסנן פס פס הפרעות, 650 ננומטר Edmund Optics65655
מסנן פס פס הפרעות, 660 ננומטר Edmund Optics67769
מסנן פס פס הפרעות, 671 ננומטר Edmund Optics65657
מסנן פס פס הפרעות, 680 ננומטר Edmund Optics67770
מסנן פס פס הפרעות, 690 ננומטר Edmund Optics65659
מסנן פס פס הפרעות, 700 ננומטר אופטיקה אדמונד67771
כלובכל מבנה מתכת יעבוד שניתן לקרקע ומתאים למערך הניסיוני.
סטריאומיקרוסקופ, 6X, 12X, 25X, הגדלה פי 50Wild HeerbruggWild M5כל סטריאומיקרוסקופ יעשה
מעמד מיקרוסקופ עם זרוע מתנדנדת ובסיס כבדמכשיריכל בסיס כבד עם זרוע
זרוענבנה בהתאמה אישית, ראה <חזק>איור 4
Fiber-lite תאורה בעוצמה גבוההדולן-ג'נרMI-150לדגימת תאורה
מדריך אור צוואר אווז פיבר-לייטדולן-ג'נרEEG 2823כל מדריך אור צוואר אווז יעשה
שולחן
שולחןיש לחתוך חור דרך שולחן זה כך שארגז החול יוכל לנוח על שולחן השיש שמתחתיו
קופסת עץ מלאה בחולשנבנתה בהתאמה אישית, כל קופסה עם חול
מניפולטורקארל זייס -
שלב
חוטי קליפ תנין להארקה
חוט
חוט כסף, קוטר 0.125 מ"מWorld Precision InstrumentsAGW0510
מגבר מקדים עם ראשתאגיד דגןIX2-700
מפחית רעש HumbugQuest ScientificHumbug
30 מגה-הרץ, 2 CH, עקבות כפולות, Alt-triggering, ללא בדיקהEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
חומרת Powerlab 2/20מכשירי ADIML820
תוכנת Labchartמכשירי ADIתרשים 5
מחולל דופק 10 מגה-הרץBK דיוק4030
חולץ פיפטות זכוכיתSutter InstrumentsP-87
נימי זכוכית Borosillicate עם נימהWorld Precision Instruments1B120F-4
אשלגן כלורי, 3 מ
פלסטיק מחורץ
שעווה
הלחמהפלטפורמת וולר
עם בסיס מגנטי של כדור ושקעחמה צילום ווידאו
פלדת פחמן בקצה כפול, סכין גילוח שבירמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72004
וזלין
מיקרוסופט אקסלמיקרוסופט
פרפרים פלסטיק גדול של תאגיד ניופורט עמוד הרכבה אופטי מחזיק קולימטור ND מתכתי מתכתי ניופורט מתכתי מתכתי , מתכתי מתכתי פאראדיי McBain יעשה קרדן שיש עץ מוגבה מחזיק אלקטרודות ג'נה דגימהנחושת מבודד כבלי BNC אוסילוסקופ , 'צינור בטמפרטורת התכה נמוכה ברזל

מקורות

  1. Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
  2. Leboulle, G., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הקלטה תוך-תאיתתאי פטורצפטוריםמיקרו-אלקטרודת זכוכיתמנורת קסנוןהתנגדות אלקטרודהגירוי אורניתוח תגובההסתגלות לחושך
קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.