Summary
הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.
Abstract
הקלטה תאית היא טכניקה רבה עצמה להשתמש כדי לקבוע כיצד תא בודד יכול להגיב לגירוי נתון. במחקר חזון, הקלטה תאית כבר היסטורי טכניקה נפוצה בשימוש ללמוד רגישויות של תאי קולטי אור פרט לגירויים באור שונים כי הוא עדיין בשימוש כיום. עם זאת, יש עדיין מחסור של המתודולוגיה מפורט בספרות לחוקרים המעוניינים לשכפל ניסויי הקלטה תאיים בעיניים. כאן אנו מציגים את מקק מודל לבחינת פיזיולוגית עין באופן כללי יותר. תאי קולטי אור חרקים נמצאים קרוב לפני השטח של העין ולכן קלים להגיע, ורבי המנגנונים המעורבים חזון שמורים פני טווח מערכת חיה. אנו מתארים את ההליך הבסיסי הקלטת in vivo התאית של תאי קולטי אור בעיניים של פרפר, עם המטרה של עשיית טכניקה זו לנגישה יותר חוקר עם ניסיון קודם קצת בדוארlectrophysiology. אנחנו מציגים את הציוד הבסיסי הדרוש, איך להכין פרפר חי להקלטה, כיצד להוסיף microelectrode זכוכית לתוך תא בודד, ולבסוף הליך ההקלטה עצם. אנו גם להסביר את הניתוח הבסיסי של נתונים בתגובת גלם לקביעת רגישות ספקטרלית של סוגי תאים בודדים. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד בקביעת רגישות ספקטרלית, גירויים אחרים (למשל, אור מקוטב) וריאציות של השיטה הם החלימו על התקנה זו.
Introduction
התכונות החשמליות של תאים כגון נוירונים הם נצפו על ידי מדידת זרימת יונים על פני קרום התא כשינוי מתח או זרם. מגוון של טכניקות אלקטרו פותח כדי למדוד אירועים ביואלקטריים בתאים. נוירונים נמצאים בעיני חיות נגישים המעגלים שלהם הם בדרך כלל פחות מורכבים ממה במוח, מה שהופכים תאים אלה מועמדים טובים במחקר אלקטרו. יישומים נפוצים של אלקטרופיזיולוגיה בעיניים כוללים electroretinography (ERG) 1,2 ו הקלטה תאית microelectrode. ERG כוללת הצבת אלקטרודה או על העין של חיה, החלת גירוי אור, ומדידת השינוי במתח כסכום של התגובות של כל התאים הסמוכים 3-6. אם מישהו מעוניין במיוחד באפיון רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור בודדים, לעתים קרובות סוגי תאים מרובים להגיב בו זמנית בעוצמות שונות לגירוי נתון; וכך זהיכול להיות קשה לקבוע את הרגישויות של סוגי תאים ספציפיים מנתוני ERG במיוחד אם ישנם מספר סוגים שונים של תאי קולטי אור ספקטרלית-דומים לעין. פתרון אפשרי אחד הוא ליצור תסיסנית מהונדס עם קולטי האור (opsin) הגן של עניין הביע בתאים רוב R1-6 בעיניים ולאחר מכן לבצע 7 ארג. חסרונות פוטנציאליים של שיטה זו לא נכללו כל לביטוי הנמוך של קולטי אור החלבון 8, ואת מסגרת זמן הרבה עבור הדור והקרנת חיות טרנסגניות. לעיניים עם סוגים פחות של קולטני אור ברור ספקטרלית, הסתגלות של העין עם מסננים צבעוניים יכולה לעזור עם הפחתת התרומה של סוגי תאים מסוימים על ERG, ובכך לאפשר הערכה של מקסימום הרגיש ספקטרלית 9.
הקלטה תאית היא טכניקה אחרת שבה אלקטרודה בסדר impales תא לבין גירוי מוחל. indiv הרשומה אלקטרודה שרקתגובת תא idual כך הקלטה וניתוח תאים בודדים מרובים יכולה להניב רגישויות ספציפיות של תאים מסוגים שונים פיסיולוגי 10-14. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד ניתוח רגישות ספקטרלית, את העקרונות הבסיסיים של תאיים הקלטה עם אלקטרודות חדה הם לשינוי עבור יישומים אחרים. באמצעות הכנה שונה של טיפוס, למשל, באמצעות אלקטרודות קוורץ חדה, אפשר להקליט עמוק באונה האופטית או אזורים אחרים במוח, תלוי השאלה נשאלת. לדוגמא, זמני תגובה של תאי קולטי אור פרט 15, פעילות התא האופטי אונות 16 (lamina, לשד או lobula 17), מוח 18 או גרעינים אחרים 19 יכולים גם להיות מוקלטות עם בטכניקות דומות, או גירויי צבע יכולים להיות מוחלפים עם קיטוב 20 -22 או תנועה לגירויים 23,24.
Phototransduction, התהליך שבו אורהאנרגיה נספגת מומר אות אלקטרוכימיים, היא תכונה עתיקה ועד עממית, כמעט כל ימינו חית טווח מערכת 25. הפיגמנט החזותית שנמצאה בתאי קולטי אור ואת אחראית ליזום phototransduction החזותי הוא לרודופסין. Rhodopsins בכל חיים מורכבים של חלבון opsin, חבר של משפחת קולטן המצומד לחלבון G 7 הטרנסממברני, וכן כרומופור הקשורים הנגזר רשתית או מולקולה דומה 26,27. Opsin רצף החומצות האמיניות ומבנה כרומופור להשפיע על ספיגת של rhodopsin אורכי גל שונים של אור. כאשר פוטון נספג על ידי כרומופור rhodopsin הופך מופעל, ייזום מפל G- חלבון בתא שבסופו של דבר מביא לפתיחת תעלות יונים קרום הנכנס 28. בניגוד לרוב נוירונים, תאי קולטי אור לעבור שינויים פוטנציאל מדורגים שניתן למדוד כשינוי יחסי משרעת תגובה עם שינוי גירוי אור. בדרך כלל נתוןסוג קולטי האור מבטא רק גן opsin אחד (אם כי קיימים חריגים 8,10,29-31). ראיית צבעים מתוחכם, מן הסוג שמוצאים בהרבה חוליות ופרוקי רגליים, מושגת עם עיניים מורכבות של מאות או אלפי התאים קולטי האור בכל להביע אחת או מדי פעם יותר סוגים לרודופסין. מידע חזותי הוא נתפס על ידי השוואת תגובות על פני פסיפס קולטי האור באמצעות איתות עצבית במורד מורכבות העין והמוח, וכתוצאה מכך תפיסת דימוי להשלים עם צבע ותנועה.
אחרי מדידת תגובות גלם של תא קולט אור לאורכי גל שונה של אור באמצעות הקלטה תאית, אפשר לחשב רגישות ספקטרלית שלה. חישוב זה מתבסס על עיקרון Univariance, הקובע כי תגובתו של קולטי אור תא תלויה במספר הפוטונים הוא סופגים, אך לא על התכונות המיוחדות של הפוטונים הם סופג 32. כל פוטון כי הוא absorbed ידי rhodopsin יניעו אותו סוג של תגובה. בפועל, זה אומר כי משרעת תגובת הגלם של תא תגדל בשל הן גדלה בעוצמת אור (פוטונים יותר לספוג), או שינוי אורך גל לכיוון רגישות לשיאו (הסתברות גבוהה יותר של rhodopsin קליטה גל כי). אנו עושים שימוש בעיקרון זה בהתייחסות תגובות הסלולר בעצימות ידועות אותו הגל לתגובות באורכי גל שונה, ואותה קיצוניות אבל רגישות ביחס ידועה. סוגי תאים מזוהים בדרך כלל על ידי אורך הגל שבו פסגות רגישותם.
הנה אנחנו מראים שיטה אחת עבור הקלטה תאית וניתוח הרגישות ספקטרלית של קולטני אור בעיניים של פרפר, עם דגש על ביצוע שיטה זו נגישה יותר לקהילת המחקר הרחבה יותר. למרות הקלטה תאית נותרת נפוצה בספרות, במיוחד ביחס ראיית צבע חרקים, שמצאנו thaתיאורי t של חומרים ושיטות הם בדרך כלל קצרים מכדי לאפשר רבייה של הטכניקה. אנו מציגים שיטה זו בפורמט וידאו במטרה מתיר שהכפול הקל שלה. כמו כן, אנו מתארים את הטכניקה באמצעות ציוד השגה ובמחיר סביר בקלות. אנו מנסים לפתור אזהרות נפוצות, שלעתים קרובות אינם מדווחות, אשר להאט מחקר כאשר אופטימיזציה טכניקה חדשה ולא מוכרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החיות טופלו באופן הומני ככל האפשר. חרקים נשלחו כמו גלמים מקוסטה ריקה אספקה האנטומולוגי, קוסטה ריקה.
טיפול 1. Heliconius גלמים
- Hang כל גלמים במרווחים 2-3 ס"מ בתא humidified באמצעות סיכות חרקים.
- לאחר eclosion, לאפשר כנפיים לייבוש ולאחר מכן לשמור פרפרים בחיים 1 יום לפחות בתא humidified ולהאכיל פתרון דבש לדלל יומי לפני ההקלטה.
- לדלל דבש עם מים לכ פתרון דבש 20% לפי נפח, ויוצק לתוך צלחת פטרי רדודה.
- תביא פרפרים בודדים כדי בצלחת פטרי, אחד אחרי השני. עם נגיעת הפתרון עם טרסי הקדמי שלהם, את הפרפרים ירחיבו proboscides שלהם באופן אוטומטי ולשתות מצלחת פטרי. אם החוטם שלהם אינו כולל באופן אוטומטי, להשתמש במלקחיים כדי למשוך את החוטם החוצה להציג את זה הפתרון דבש.
2. מסלול אופטי, כיול measurement של תנאי אור ניסיוני
- מניח מנורת קשת 150 W קסנון עם דיור ואספקת חשמל אוניוורסלי הרכבת עדשת קבל מצורפת בצד אחד של שולחן לפחות מטר אחד ארוך כדי לספק אור לבן בוהק.
זהירות: מנורות קשת קסנון לייצר מאוד אור בהיר עם עוצמות UV חזקות. משקפי מגן צריכים להיות משוחקים בכל העת ואת המנורה צריכה לשמש בבימויו של היצרן כדי למנוע הצטברות של אוזון נגרם על ידי אינטראקציה של אור UV עם חמצן אטמוספרי. - הגדרת מטר אופטי מסלול אחד באורך של אור יציאת הרכבת הדיור לעבור (איור 1).
- מקום לפי הסדר הבא על המסלול האופטי עם מרחקים המשוער בנפרד: 1) סיליקה קמורה או עדשה קוורץ 40 סנטימטרים ממכלול הקבל, 2) גלגל מסנן צפיפות ניטראלי (ללא מסננים כיום נתיב האור) 22 סנטימטר בהמשך המסלול, 3) תריס עם יחידת כונן 14 ס"מ ממסנן NDים, 4) עדשה סיליקה או קוורץ קעורה מיד בסמוך לאחר תריס, ו -5) גלאי קרן collimating 6 ס"מ יותר לאורך הקצה המרוחק של המסלול.
- להטביע כבל סיב אופטי 600 מיקרומטר בקוטר חללית קורה collimating.
הערה: בהתאם לעוצמת התאורה, כבל סיב אופטי בקוטר 5-10 מ"מ עשויה להידרש לספק אור מספיק כדי preps אחרים ועשוי להיות תחליף לכך. - התאם את המרחק, גובה וזווית של כל רכיב אופטי כך קרן אור יציאת האסיפה היא בעצימות הגבוהות ביותר אפשרית.
- כמו אלמנטים מסלול אופטי עשויים להיות שונים במקצת עם יישומים שונים, להבטיח כי כל האלמנטים לשדר אור UVA ו- בטווח הנראה לעין (315-700 ננומטר).
- לאחר המסלול האופטי מורכב, למדוד את האור שעובר דרך ההתקנה באמצעות ספקטרומטר. כייל את ספקטרומטר ראשון באמצעות מנורת כיול עם ספקטרום ידוע ואת התוכנה של היצרן.
הערה: אנו מתארים את שהוקמו לאחר שימוש במוצרי אופטיקה האוקיינוס לבהירות אבל יצרנים אחרים (למשל, Avantes) למכור מוצרים דומים.- להדליק את מנורת כיול טונגסטן לפחות 45 דקות לפני המדידה.
- כדי לכייל, לצרף את ספקטרומטר באמצעות USB למחשב עם התוכנה הנלווית המותקנת. ואז לחבר את ספקטרומטר מנורת כיול טונגסטן באמצעות מתקן קוסינוס שידור UV- גלוי.
- בחר "מדידת irradiance ניו המוחלטת" מתוך הכרטיסייה "קובץ", ובחר את ספקטרומטר כמו "המקור".
- פעל לפי ההנחיות כדי ליצור קובץ "קאל" כיול חדש. כשתתבקש, טען את קובץ הנתונים שנתקבלו לצורך ניתוח הספקטרום הידוע של המנורה כיול טונגסטן בטווח האור הנראה (300-800 ננומטר) לתוך התוכנה, המחשבת את הספקטרום תיקן באופן אוטומטי מהפלט ספקטרומטר.
- שמור את קובץ הכיול. לטעון קובץ זה כאשר initializing התוכנה עבור כל המדידות העתיד של ספקטרום האור באמצעות ספקטרומטר.
- לאחר ספקטרומטר הוא מכויל, להשתמש בזה כדי להקליט את ספקטרום האור מן ההתקנה הניסיונית. מכאן והלאה כאשר התוכנה נפתחת, בחר "ניו המוחלטת irradiance ומדידה" ו לטעון את קובץ הכיול שנשמר בעבר. הבא לקחת ספקטרום כהה ידי חסימת כל אור ספקטרומטר.
- עם ספקטרומטר כיום למדידה בתנאי תאורת הניסוי הרצוי, התאימו את זמן האינטגרציה (4 msec), סריקות הסכום ממוצעות (5), ורוחב קרון (5), כך הספקטרום ישתנה כראוי והחליק. שמור את ההגדרות זהות עבור כל מדידות ספקטרליות, כך עוצמות אור ממדידות שונות ניתן להשוות.
- מדוד ספקטרום האור unattenuated לבן, עבור כל מסנני צפיפות ניטרלי לשמש במהלך הניסויים, ובמשך כל מסנן הפרעות bandpass (איור 2).
- Measure ספקטרום האור לבן ללא כל בפילטרים נתיב האור על ידי הדבקת את הקצה החופשי של כבל סיב אופטי משלב 2.2.2 כדי ספקטרומטר. עם קובץ כיול טעון משלב 2.3, להציל את ספקטרום האור הלבן באמצעות התוכנה של ספקטרומטר כקובץ טקסט.
הערה: ספקטרה הציל כקבצי טקסט לפרט את אורך הגל (x קואורדינטות) בעמודה אחת ואת עוצמת האור (y קואורדינטות) בעמודה השנייה, כך שהנתונים ניתן לטעון לתוך גיליון אלקטרוני עבור בשלב 2.6. - שימוש באותו ההתקנה כמו צעד 2.5.1, להקליט הספקטרום מכל צפיפות אופטית (OD) (0-3.5 OD) השתמש במהלך ניסויים על ידי ההחלפה של הצפיפות הניטראלית (ND) גלגל לסנן במסלול האופטי, ולשמור את קובץ הטקסט עבור כל OD.
- השימוש באותו ההתקנה כמו צעד 2.5.1, המקום 10 את הפרעת רוחב פס חצי ננומטר מסננים אחד אחד לתוך נתיב האור ולהקליט את הספקטרום נצפה עבור כל מסנן. חזור על הליך זה עבור כל אחד 41 מסנני הפרעות שונים wtransmittances ה- i השיא במרווחים 10 ננומטר 300 כדי 700 ננומטר. מסננים במרווחים נוספים (20 ננומטר) כשרים עבור מרבית היישומים (עבור ספקטרום, ראה איור 2).
- Measure ספקטרום האור לבן ללא כל בפילטרים נתיב האור על ידי הדבקת את הקצה החופשי של כבל סיב אופטי משלב 2.2.2 כדי ספקטרומטר. עם קובץ כיול טעון משלב 2.3, להציל את ספקטרום האור הלבן באמצעות התוכנה של ספקטרומטר כקובץ טקסט.
- נכון להבדלים עוצמים אור כאשר מסנן הפרעות ממוקמות נתיב האור. כל מסנן התערבות מאפשר מספר כולל שונה של פוטונים לעבור, ואת השידור הנמוך של כמה מסננים מקשה להחליש עוצמת נוספת כך שכל המסננים לאפשר מספרים של פוטונים שווים.
- כדי לחשב את העוצמה היחסית (אני) עבור כל מסנן הפרעות רוחב פס 10 ננומטר, לפתור כי אני בביטוי, אני = T / sec, כאשר t הוא השטח מתחת לעקומה הרפאים של כל מסנן התערבות 10 ננומטר (מ 2.5.3) , ו- s הוא (ערך y של קובץ טקסט הציל 2.5.1) המרבי irradiance מוחלט של אור לבן באורך גל שיא של כל מסנן (ראה איור 2 למשל ב 520 ננומטר).
- מחלקים כל intensit מחושבies ידי הערך העוצם המקסימום מחושב ב 2.6.1 לנרמל לאחד, ולקחת את הגומלין של הערכים המנורמלים ביחס לשימוש כגורם תיקון להחיל את הרגישות גלם בכל אורך גל (ראה שלב 6.4).
- בצע שלבים 2.1 דרך 2.6 רק פעם אחת לפני קבוצה של ניסויים. במהלך ניסוי להקליט את irradiance המוחלט תקופתי של מנורת קשת קסנון תחת אור בהיר ומסנן צפיפות ניטראלית, כדי לוודא את עוצמת גירוי האור אינה משתנית.
- במהלך ניסוי, אם תגובה תאית כלשהי קרן אור העוברות דרך מסנני ההפרעות מתקרבת משרעת התגובה המרבית, השתמש במסנני ND כדי להחליש את האות. אם מסנני ND משמשים במהלך ניסוי, להסביר את הקיטון המקביל בעוצמת במהלך החישוב רגישות ספקטרלית.
- הגדרת מסלול אופטי, כיול, ומסננים ימים או שבועות לפני ניסויים להתחיל. שמור מסנניםמכוסה כדי למנוע הצטברות אבק.
3. הגדרת ציוד הקלטה
- להאכיל את הכבל אותו הסיב האופטי המשמש לכיול באמצעות כלוב פאראדיי ו הר במכשיר goniometric כגון היקף זרוע קרדן (ראה איור 3 עבור תרשים). הכבל יהיה כ 10 סנטימטרים מן העין של הדגימה.
- מניח בשלב מתכת על שולחן מבודד מבחינת רטט עם בעל אלקטרודה מותקן ישירות מעל הבמה תחת שליטה של micromanipulator (איור 4). מניח את יד קרדן כך שהראש של הדגימה עומד במרכז של המעגל נוצר על ידי התנועה הסיבובית של הזרוע.
- באמצעות מערכת מגבר תאית, הכוללת מגבר (מחוץ לכלוב פאראדיי) ו מגבר (headstage, ליד הכנה בתוך כלוב פאראדיי) לעלות על headstage מעל במת המתכת שבו הדגימה תוצב.
- חבר כבל קואקסיאלי אל headstage באמצעותחיבור BNC. פיצול פתוח רק קצתי על הקצה השני של כבל קואקסיאלי, ולהפריד את נדן המתכת החיצוני של הכבל מהחוט הפנימי.
- הלחם את המעטפת החיצונית (שמור על פוטנציאל קרקע) בקצה אחד של חוט נחושת מבודד עם קליפ תנין בצד השני. קליפ תנין זה יצרף האלקטרודה מתכת הפניה על פלטפורמת הדגימה (שלב 5.1.4).
- הלחם את החוט הפנימי של הכבל הקואקסיאלי אל חוט כסף דק, לשמש האלקטרודה ההקלטה. חוט זה אמור להיות דק מספיק כדי להיות מוזן לתוך אלקטרודת הזכוכית מלאת הפתרון בשלב 5.2.3.
- מניחים סטראו מחוברת זרוע מתנדנד ובסיס על ספסל העץ מחוץ לכלוב פאראדיי, כך שהוא עשוי להיות הניף כדי להוריד את האלקטרודה לתוך העין, והניף בחזרה החוצה פעם האלקטרודה הוא בעיני.
- הפוך הכל מתכת בטוחה בתוך כלוב פאראדיי מוארק כראוי.
- מחוץ לכלוב פאראדיי, לצרף את preamplifאה לכניסה של כמפחית רעש 50-60 רץ (אופציונאלי), ולחבר את הפלט לערוץ אחד אוסצילוסקופ באמצעות מתאם T BNC.
- באמצעות הקצה השני של מתאם T, לחבר את האות עוברת דרך האוסילוסקופ לערוץ אחד של החומרה. צרף חומרה זה למחשב באמצעות כבל USB, אשר יאפשר תגובות שנרשמו עם המגבר קדם להיקרא על ידי תוכנות במחשב.
- צרף נהג תריס ממסלול האופטי לערוץ השני של האוסילוסקופ באמצעות אחר T-מתאם ולהתחבר זה לגנרטור דופק שישלוט התדירות ומשך הבזקי אור נמסרו העין (שלב 5.5).
הערה: התקנה של המתקן עצמו צריכה רק צריך להיעשות פעם. לשבור כאן עד מוכן להתחיל הקלטות.
Prep 4. ביום הקלטה
- להדליק את מנורת קסנון לפחות 45 דקות לפני הניסוי ולהדליק את חולץ microelectrode זכוכית לפחות 30 דקות לפני pulאלקטרודות זכוכית לינג.
- הפעל את כל ציוד ההקלטה (התריס, המגבר, Eliminator רעש, גנרטור הדופק, אוסצילוסקופ, ורכישת נתוני חומרה) ולוודא את התריס סגור כברירת מחדל ולכן אין אור עובר דרך כבל הסיב האופטי.
- משוך בורוסיליקט קנס (או aluminosilicate) microelectrodes זכוכית (100-250 התנגדות MΩ אידיאלית) באמצעות חולץ microelectrode זכוכית. השתמש אלקטרודות זכוכית בתוך רק כמה שעות של שנגררת.
- למילוי האלקטרודות עם 3 כלוריד M אשלגן (KCl). הערה כי פתרון זה עשוי להיות שונה בהתאם לצרכים של החוקר, למשל לצבוע ההזרקה.
5. הכנת דגימה ונוהל הקלטה
- הכן את הדגימה
- להטביע פרפר פרט בתוך צינור פלסטיק קטן עם שעווה חמה כך הראש הוא נייח מבצבץ בקצה אחד של הצינור. שעווה למטה חוטם, אנטנות, וכנפיים (איור 5).
- חזק tהוא הבטן עם פיסת יבשה של שעווה לשמור על הצינור humidified ידי הצבת רקמות רטובות בתוך הצינור מאחורי הבטן. ודא הדגימה היא לחלוטין ללא תנועה.
- הר הצינור באמצעות חתיכה קטנה של שעווה על גבי פלטפורמה קטנה עם כדור משותף-ו-שקע מחובר בסיס מגנטי.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, להכניס חוט כסף בקוטר 0.125 מ"מ לתוך הראש באמצעות איברי הפה לשמש אלקטרודה ההשוואתית. לפני הניסוי, לצמיתות לתקן את החוט אל הרציף בצורה כזאת כי חוטי הנחושת בשלב 3.3.2 יכולים לחתוך על זה פעם הפלטפורמה מושם על הבמה להקלטה.
- לאחר אלקטרודה ההשוואתית נמצאת בעמדה מתאימה זה יכול להיות כל זמן במקום על ידי המסה במהירות ואז קירור שעווה סביב החוט.
- באמצעות סכין גילוח פלדת פחמן שביר, אחיזת חלק הלהב עם בעל להב ולשבור חתיכה קטנה להשתמש לחיתוך הקרני.
- חותכים חור קטן (~ 10 ommatidiא 'קוטר) בתוך הקרנית עזבה באמצעות סכיני הגילוח ולאטום את החור עם וזלין כדי למנוע התייבשות.
- לאחר הקרנית הוא חתך, הכנס את האלקטרודה הקלטה לתוך העין כמה שיותר מהר כי hemolymph בעיניים יקשיח במהירות ולעשות את זה אי אפשר להכניס אלקטרודה. אם אפשר לבצע את הנתיחה ב האסדה שבו ההקלטה תתקיים.
הערה: וזלין לא צריך להיות מרוח על שאר העין כמו זה יהיה defocus אופטיקה.- אם לא כבר על הבמה, למקם את הדגימה ופלטפורמה רכובה על הבמה במתקן ההקלטה. חבר את חוט הקרקע headstage משלב 3.3.2 אל האלקטרודה התייחסות בפלטפורמת הדגימה באמצעות קליפים תנין.
הערה: אם אפשר להשתמש במסנן אדום להאיר את החיה. - השתמש מקור אור עם קבצים מצורפים מתכווננת בקצרה להדליק את הדגימה תחת stereoscope תוך הפחתת האלקטרודה ההקלטה לתוך העין.
- בבהלבשת חוט הכסף מחובר headstage משלב 3.3.3 לתוך תמיסת KCl בחלק האחורי של microelectrode זכוכית. הר אלקטרודת זכוכית על בעל אלקטרודה.
- התאם את בעל אלקטרודה כך microelectrode הוא ישירות מעל החור לחתוך בעבר בתוך הקרנית, כמילימטר מעל הקרנית. מנמיכים את microelectrode לתוך העין באמצעות micromanipulator עד השלמת מעגל, כפי שמוצג על ידי שינוי גדול בפוטנציאל (mV) על האוסילוסקופ.
- אם לא כבר על הבמה, למקם את הדגימה ופלטפורמה רכובה על הבמה במתקן ההקלטה. חבר את חוט הקרקע headstage משלב 3.3.2 אל האלקטרודה התייחסות בפלטפורמת הדגימה באמצעות קליפים תנין.
- לאחר בעיניים, להניף את סטריאוסקופ מחוץ לכלוב פאראדיי, ומכבה את מקור האור המאיר את הדגימה. החדר צריך להיות כל הזמן חשוך כל כך לעין הופך לאפלולית.
- בדוק את ההתנגדות של האלקטרודה על ידי יישום זרם 1 נה מהמגבר וציין השינוי במתח. התנגדות בדרך כלל צריכה להיות בטווח שבין 100-250 MΩ. התנגדויות גבוהות מעידות על חסימה או כיפוף של האלקטרודה, התנגדויות נמוכות של אלקטרונשבירה תודה.
- הפעל את המחולל הדופק כך את התריס נפתח ומאפשר בזק האור עם משך 50 msec כל 0.5 שניות, ולאפשר לו להמשיך מהבהב למשך הניסוי.
- התאם את גנרטור הדופק אז זה מאפשר הבזקים של עד 50 משך msec. משך זה ו -0.5 שניות הפסקה בין הבזקים שומרים הדגימה כפי קרובים לאפלוליים ככל האפשר במהלך הניסוי. חמישים msec קרוב משך פלאש הקצר כי יהיה להפיק אותה משרעת בתגובה כמו המשכים פלאש כבר.
- Re-מידת תגובות היא ברמה של ההתחלה ואת הסוף של הניסוי (שלב 5.16). במהלך על ניסוי עשרים דקות, הגדרות פלאש האלה אינן מתפרקות התגובה לאורך זמן. preps השונה עשוי לדרוש התאמות להגדרות פלאש אלה.
- מקם את זרוע קרדן כך כבל הסיב האופטי מכוון העין.
- בדוק את הסקופ לשינוי מתח עם כל הבזק אור.שינוי שלילי מתח מסמן כי האלקטרודה לא נכנסה עדיין בתא.
- הזז את זרוע קרדן סביב הדגימה עד כי היא ממוצבת בזווית העין שבו יש תגובת מתח מקסימלי.
- סובב את micromanipulator הלוך ושוב, גורם לתנועות אנכיות קטנות מאוד של האלקטרודה בשני הכיוונים תוך הקשה על הבסיס של האלקטרודה מחזיק או באמצעות הפונקציה באז קלים על המגבר קדם. המשך ביצוע התאמות קטנות עד תגובה depolarizing אור מופיע על האוסילוסקופ (איור 6).
- התאם את זרוע קרדן שוב כדי למצוא את זוית הפגיעה שבו בזק האור יוצר את אות depolarizing הגדולה. בצע התאמות קטנות עם micromanipulator ולהשתמש בפונקציית באז על המגבר לפי הצורך כדי לוודא את האלקטרודה הקלטה התא ביציבות וכי הוא יישאר בתא עבור הניסוי כולו (ראה שלב 5.11).
- לאחר ההתקנה היא יציבה, להתחיל recording. הקלטה יציבה צריכה לא מעט על מנת שינוי נח פוטנציאל, רעש רקע נמוך, תגובת depolarizing גדולה באופן עקבי (לפחות 10: אות 1 יחס רעש).
- הפעל את התוכנה על המחשב, ולהתחיל "ניסוי חדש," אשר יפתח חלון pop up עם ארבעה ערוצים.
- להתאים את קנה המידה מתח בפינה הימנית העליונה של חלון התוכנה ל -500 mV. הערוץ הראשון מציג את התגובות רשמו האלקטרודה בזמן אמת, ואילו הערוץ השני יתעד את הגל המרובע המיוצר על ידי גנרטור הפונקציה, אם האות מוזן חומרת רכישת נתונים באמצעות האוסילוסקופ, מוצג כאשר התריס פתוח . ערוצי השניים האחרים הם לא נחוצים.
- לחץ על "התחל" בפינה הימנית התחתונה כדי להתחיל בהקלטה, ולאפשר את התוכנה להתמודד על תקופת הניסוי. התאם את הזום של x (הזמן) ו- y (מתח) גרזנים כך שהתגובות ברורות.
- ראשית, עם אור לבן, להקליט עד 10 תגובות בודדות עם גלגל מסנן ND 3.5 OD (כ 5-10 שניות).
- השיא בא אותו המספר של תגובות 3.3 OD, אז 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, וכו 'בכל שילוב עד 0.0 OD. אמפליטודות תגובה אלה לסדרת מסנן ND תספקנה את העקומה העוצמת-log בתגובה בסעיף 6. אם מתרחש לבן, להשתמש הבזקים פחות גירויים בהירים במהלך הניסוי.
- כתוב את התשובות של תא לכל אורכי הגל, באמצעות מסנני ההפרעה.
- ראשית למצוא את אורך גל השיא. בלי פילטרים ND בנתיב האור (0.0 OD), למקם מסנן משדר UV בנתיב האור בקצרה לבחון את משרעת התגובה. אני חוזר עם מסנן משדר כחול, מסנן שידור ירוק, ומסנן שידור אדום, שאמורה לתת לכם מושג מאיפת תגובת השיא תהיה.
- השתמש במסננים בסביבות 350, 450, 550, 650 ננומטר למצוא באזור הכללי של רגישות שיאצעד 5.14.1. אורך הגל המדויק לא משנה בשלב חיפוש הראשוני הזה בגלל כל אורכי הגל יירשמו לשלב הבא. אם הערכות קיימות של רגישויות שיא, או שהם כבר נרשמו בעבר, אורכי גל ידוע שימוש לזהות את תגובת השיא במהירות.
- לאחר תגובת השיא או קרוב לכך מזוהה, שיא באורך גל זה למשך 10 תגובות (כ -5 שניות).
- לאחר הקלטת באורך הגל של תגובת שיא, שיא עם מסנני התערבות האחרים, החל 300-700 ננומטר ב 10 צעדים ננומטר. התחל מהפסגה ולצעוד לעבר שני אורכי גל קצרים יותר על ידי החלפת מסננים מ- נתיב האור בזה אחר זה (למשל אם התגובה השיא הוא 520 ננומטר, תגובות שיא באורך גל זה הראשון, אז 510 ננומטר, ואחריו 530 ננומטר, 500 ננומטר, 540 ננומטר, 490 ננומטר, 550 ננומטר, וכן הלאה עד אין אין תגובה).
- אפשר עד 10 תגובות לכל מסנן (5 שניות כל אחד). כאשר החלפת מסננים הפרעה, המאפשר לתא שו"תond 1-2 הבזקים של אור הלבן ללא כל סינון בנתיב האור, שהוא מועיל לפקח האם תגובת השיא משפילה לאורך זמן. צמצם את מספר התגובות או להגדיל את OD אם הלבנה מתרחשת.
- אם התגובה בשום מסנן התערבות קרובה מדי התגובה המרבית תחת אור לבן ב 0 OD, ואז להחליש עם מסנני ND. מסנני ההפרעה והגודל של כבל הסיב האופטי השתמש בניסוי זה מאוד להחליש את עוצמת האור וכך מסנני ND בדרך כלל אין צורך.
- אם ההקלטה נשארה יציב, אורכי גל-שיא מחדש סביב תגובת השיא, אשר משמשת pseudoreplicate לצורך וידוא אמפליטודות תגובה קודמת ומסייעת להבטיח את התגובה לא מושפלת לאורך זמן. לאחר כל אורכי הגל נרשמים, להקליט מחדש את התגובות תחת סדרת ND, כמו בשלב 5.12.
- לאחר ההקלטה מלאה לחץ "עצורה" על התוכנה, ולשמור את ההקלטה לניתוח.
- לאחר ניסוי, להקריב את הפרט על ידי הקפאה, או קירור במשך כמה דקות אחריו במהירות על ידי ניתוק הראש ומוחץ בית החזה.
- כבה את כל הציוד. לשבור כאן במידת הצורך לפני ביצוע ניתוח.
6. ניתוח רגישות ספקטרלית
- עם התוכנה המשמשת להקליט תגובות גלם, לחשב את המשרעת התגובה הממוצעת של 10 תגובות בודדות עבור כל מסנן בסדרת ND ולכל מסנן הפרעות.
- צור פונקצית תגובה-log עוצם (VlogI) מהסדרה המסננת ND שנרשמה שלבי 5.12-5.13 (איור 7). עושים זאת על ידי התוויית יחידות יומן של אינטנסיביות (OD) על ציר ה- X, ותגובה לכל עוצמת על ציר y.
- כדי להפיק רגישות ספקטרלית של התא באורכי גל שונים, בדרך כלל להתאים את המשוואה Naka-ראשטון לנתונים משלב 6.2, ולהשתמש במשוואה הזאת להתייחס תחומי ספקטרום השיג באופן ניסיוני של t באורכי גל שוניםo פוטונים ביחס הנדרש כדי לעורר תגובה כי תחת גל קבוע (ב אור לבן במקרה זה).
הערה: משוואת Naka-ראשטון היא: V / מקס V = אני n / (אני n + K n), שבו אני נמצא את עוצמת הגירוי, V הוא משרעת בתגובה, V max היא משרעת התגובה המרבית, K הוא הגירוי עוצמת נותנת ½ V max, ו- n הוא שיפוע המעריכים. ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להתאים את המשוואה הזאת לנתוני VlogI, כולל תוכנה עקומה הולמת, או חבילות סטטיסטיות מבוסס קוד. - כדי להתאים את המשוואה Naka-ראשטון באמצעות חישובים פשוטים בתוכנית גיליון אלקטרוני, להמיר את הנתונים בתגובה VlogI לכל עוצמת הגירוי: יומן [(מקסימום V / V) - 1]. ואז לבצע רגרסיה ליניארית על הנתונים טרנספורמציה כדי לקבל את המשוואה של הקו של בכושר הטוב ביותר.
הערה: מקסימום V חייב להיות גדול יותר מכל תגובות שקולות; לשמור את זה עקבי, שיטה זו מעריכה מקסימום V כמו GRE 1%אטר מ התגובה המדודה הגבוהה ביותר. - מן המשוואה של קו הרגרסיה, להעריך את המעריך (n) על ידי לקיחת שיפוע שלילי, והיכנס (K) = Y-ליירט / n.
- כדי להפיק רגישות ספקטרלית של התא באורכי גל שונים, בדרך כלל להתאים את המשוואה Naka-ראשטון לנתונים משלב 6.2, ולהשתמש במשוואה הזאת להתייחס תחומי ספקטרום השיג באופן ניסיוני של t באורכי גל שוניםo פוטונים ביחס הנדרש כדי לעורר תגובה כי תחת גל קבוע (ב אור לבן במקרה זה).
- לאחר הפרמטרים עבור מקסימום V, n, ו- K היה מוערך, לקבוע את מספרם היחסי של פוטונים נדרש לעורר את התגובה הספקטרלית של התא בכל אורך גל ידי חיבור התגובה הספקטרלית נמדד באורך גל נתון (V) ופתרון עבור I.
- הכפל את עוצמת הגירוי חושב (I) משלב 6.3 במקדם התיקון עבור כל מסנן הפרעות (משלב 2.4.3) בכל אורך גל.
- כדי לקבל רגישות, כל העוצמות חייבות להיות קשורות עקומת V יומן-לי, כך שניתן יהיה להשוות ביניהם. עושים זאת על ידי הנוגעים בכל עוצמת הגל כדי ½ V max או K, המחושב בשלב 6.2.3.
- פחת כל עוצמת גל תיקן (שלב 6.4) מ ק
- אז עבור כל עוצמת גל, להוסיף את זה "המרחק מ K "ערך K, להכפיל (-1).
- הבא להביא את כל נקודות הנתונים החיוביות על ידי הוספת הערך המוחלט של נקודת הנתונים הנמוכה ביותר בסדרה לכל אורך גל.
- מצא רגישויות בכל אורך גל על ידי לקיחת ההופכי של כל העוצמות המחושבות חדש משלב 6.5.1. להמיר את הנתונים כך הספקטרום הרגיש נופל בין 0 ל -1.
- לאחר הקלטת מן יותר מתא אחד הממוצע מאותו סוג התגובות והעלילה הסופיות במוטות סטיית התקן או רווח סמך 95% (איור 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור אלמנטים רבים של הגדרת ההקלטה, תיאור בכתב אינו מספק פירוט מספיק. איור 1 הוא סכימטי של הרכיבים מעורבים הגדרת ההקלטה המלאה. באיור 2, ספקטרה הם זממו עבור אור לבן כל מסנן התערבות כדי לתת תחושה של למה בגורם תיקון נחוץ ומה נדרש כדי לחשב את התיקון הזה. איור 3 מציג תמונות ותרשים של הזרוע קרדן המשמש אלה ניסויים. איור 4 היא תמונה מורכבת מראה להקליט את הבמה ואת micromanipulator. איור 5 מראה כמה צעדים בהכנת פרפר לניסוי.
לאחר הקלטה מתחילה, שינוי שלילי מתח בתגובת בזק אור אומר כי האלקטרודה הוא מחוץ לתא, כמו איור 6 א. כוחו של התגובה תלויה הקרבה של האלקטרודהלהטות לתא קולטי אור, ואת זוית הפגיעה של בזק האור. התגובה צריכה להיות גדולה (> 30 mV) לפני הטיפ הוא קרוב מספיק לתא כדי לדקור. איור 6 מראים תגובת depolarizing ברורה גירוי אור, מסמל כניסה לתוך תא קולט אור. הפוטנציאל הנח צריך להיות יציבה משרעת התגובה צריך להיות גדול (לפחות 40 mV), אם כי משרעת המוחלטת עשויים להשתנות במידה ניכרת. אנו מודדים בתגובה יחסית, אז זה יותר חשוב כי יחס האות לרעש גבוהה. אם נח שינויים פוטנציאליים מאוד, צורת גל התגובה נראית יוצאת דופן, או התגובה המרבית היא נמוכה מדי, אז השוואת תגובות יחסית בכל מסנני ההפרעות הופכים לבלתי אפשריים. דוגמאות של הקלטות שמישות מוצגות באיור 6 ג, 6 ד.
לאחר השלים הקלטה מוצלחת, תגובות ND חייבים להתוות ומשוואת Naka-ראשטון צריכה להיות מצוידת לנתונים 33, shown באיור 7. נתון זה הוא זמם באמצעות סדרת מסנן ND ללא מסננים הפרעה. אם ההקלטה היא יציבה, הנתונים מהסדרה המסננת ND צריכים להיות דומים לפני ואחרי הניסוי. רגישות ספקטרלית נקבע על ידי התאמת המשוואה Naka-ראשטון לעלילה VlogI באיור 7, אז לפתרון עבור (אני) עבור כל תשובה (V) באורך גל נתון, כמוסבר בחישובי סעיף 6 של פרוטוקול.
דוגמא מייצגת של רגישות ספקטרלית נגזרה הקלטה יחידה היא להתוות איור 8 א (נא לציין מדוגמא זו אמת נתונים חושב, אבל השיא כבר עבר כמו תוצאה זו היא לא פורסמה). סוגי תאים ניתן לסווג על ידי רגישות שיא באורך גל דומה צורה כללית של הספקטרום הרגיש. סוגי תאים דומים אז בממוצע ואת הרגישות הממוצעת זממה במוטות סטיית התקן בכל אורך גל figuמחדש 8b. רגישויות ספקטרלית של שלושה סוגי תאים טיפוסיים המופיעים חרק מוצגי 8C איור (מוטות גודל וטעייה מחושבות לפי נתונים אמיתיים, אבל הפסגות מוזזות).
איור 1:. סכמטי של הקלטת רכיבי רכיבים של נתיב האור, דגימת התקנה, והקלטת חומרה מצוינת. מסלול אופטי יושב על ספסל העץ מחוץ לכלוב פאראדיי. Xe, מנורת קשת קסנון, Cd, קבל הרכבה, Lx, עדשה קמורה, ND, גלגל מסנן צפיפות ניטראלי, CF, הפרעות מסננות, S, תריס, Lc, עדשה קעורה, Co החללית, קרן collimating, פו, סיב אופטי כבל. כלוב פאראדיי יושב עלספסל עץ סביב הדגימה. ספסל העץ יושב מעל אבל לא נוגע שולחן השיש המבודד מבחינת רטט מתחת. הקלטה (RC) והתייחסות אלקטרודות (RF) מחוברת headstage (HS). Rc מוחדר העין (ה) ו- RF מוחדר חלק אחר של הגוף. את headstage הוא חלק מההגדרה מגבר קדם (Pa) מחוץ לכלוב פאראדיי. האות מועבר מן המגבר דרך כמפחית רעש הבלוף (Hb), ולתוך האוסילוסקופ (OS). מתוך אוסצילוסקופ האות עוברת דרך חומרת PowerLab (PLB) ולתוך המחשב הנייד (CPU) שם הוא נקרא על ידי תוכנת LabChart. התריס נשלט על ידי מחולל אותות (FG) אשר עובר דרך ערוץ שני על אוסצילוסקופ, ועלול גם להיות מועבר דרך ערוץ שני על חומרת PowerLab אם איתות הולכים להיות מוקלטים גם כן.
איור 2:. לבן אור והפרעה מסנן ספקטרה ששימשו לחישוב גורמי תיקון ספקטרה נמדד בשלב 2.5 של פרוטוקול מוצגים מתוך 300 כדי 700 ננומטר, עבור אור לבן כמו גם כל אחד 41 מסננים הפרעה. כל ספקטרום מסנן הפרעות נמדד רק עם מסנן כי נתיב האור. T 520 תואם את השטח מתחת הספקטרום עבור המסנן עם ננומטר שיא 520, ו- s 520 תואם את עוצמת האור הלבן באורך גל שיא של המסנן, 520 ננומטר. ערכים אלה משמשים לחישוב גורמי תיקון עבור כל מסנן (במקרה 520 ננומטר זה) כמתואר בשלב 2.6 בפרוטוקול.
page = "1"> 
איור 3:. תיאור של ההיקפי זרוע קרדן בשימוש בניסויים הזרוע קרדן מחזיקה את כבל סיב אופטי ומאפשרת סיבוב כדורי מלא וכוונון זוויתי כך שאור יכול להיות מועברת בזווית הנכונה של שכיחות לתא מוקלט. (א) מלמעלה למטה תצוגה. (ב) צפו מהצד בזווית. מספרים מתאימים לאותו חלק בכל הלוחות. (1) הצלחת התחתונה מאפשרת סיבוב עגול מלא במישור האופקי. (2) הצלחת האנכית מאפשרת סיבוב עגול מלא של הזרוע במישור אנכי. (3) גליל הזה מחזיק את זרוע מתכת עם כבל סיב אופטי על בסופו של דבר, וזה מאפשר במישור האנכי השני של סיבוב מעגלי בניצב (2). (4) כבל הסיב האופטי מתקיים iבמקום n בסוף של הזרוע, והאור מכוון המיקום של דגימת הגדרת הניסוי.
איור 4:. מרכיבי הגדרת ההקלטה (א) צינור פלסטיק המשמש להחזיק את הדגימה. (ב) מבט מלמעלה על הפלטפורמה שעליה דגימת הצינור מורכבת. (C) מבט צד של פלטפורמת כדור-ו-משותף עם בסיס מגנטי (1). הפניה אלקטרודה שמר נייח עם דבק שעווה בצד של פלטפורמה (2). הפניה אלקטרודה עוטפת קליפ תנין ו מולחמים במקום, מתן שטח מצורף שבו האלקטרודה התייחסות headstage יכול קליפ (3). (ד) אלקטרודה קצה בהגדלה 20X. סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר. (E) שלב, בעל אלקטרודה, והתקנת micromanipulator. את headstage (1) הוא קבוע מעל המנגנון עםחוט הקלטת כסף (2), ואת אלקטרודה ההשוואתית עם קליפ תנין (3) מצורפת. בעל אלקטרודה (4) הוא קבוע על micromanipulator ידנית (5) עם פוסט מתחת שעשוי להיות מותאם עם ידית לתנועה אנכית או עלול להיות דחף או משך לתנועה אופקית של בעל אלקטרודה. הפלטפורמה המגנטית עם דגימה יושבת על הבמה (6) ממש מתחת מחזיק האלקטרודה. (ו) כלוב פאראדיי המקיף את הגדרת הקלטה עם מסך שיכול להיות משך למעלה או למטה בחלק הקדמי. רדיד אלומיניום מושם מתחת כל הציוד עם רפידות גומי על העליונה. כבל הסיב האופטי (1) מוביל אל תוך הכלוב מן המסלול האופטי בחוץ, והיא נוהלה על ידי זרוע קרדן (2) לכיוון הבמה (3). המנגנון הבמה מניפולטור ההקלטה ממוקם בתוך קופסת חול (4) מונחת על שולחן השיש מתחת ההתקנה. כל הציוד האחר נשען על גבי ספסל העץ כי לא נוגע שולחן השיש. תיבת החול שיושבת על גבי שולחן השיש בתוך חורלגזור של שולחן העץ, כך הדגימה מבודדת מבחינת רטט לחלוטין מן הציוד על השולחן מהעץ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. פרפר Prep (א) הפרפר מוכנס לתוך הצינור ואת הראש, כנפיים, ואנטנות הם משותקים בשעווה חמה. האלקטרודה האדיש מוכנס לתוך איברי הפה (1), פיסת השעווה יבשה משמשת להחזיק את הבטן (2), וכן רקמות רטובות ממוקמות מאחורי הדגימה. (ב) תקריב של ראש שעווה למטה. העין שתירשם מ (1) נשמר ברור שעווה או פסולת, לבין אלקטרודה ההשוואתית (2) מוכנסת לתוך איברי פי שעווה חמה הוא נמס במהירות על זה כדי לשמור אותו במקום.(ג) יש חור לתוך העין שבו שכבת התאים קולטי האור ורוד-לבן ניתן לראות. פיגמנט שחור hemolymph צהוב נעדרים. (ד) עם נוף צדדי של הדגימה עם אלקטרודה הקלטת זכוכית (1) להציב את העין, ואת האלקטרודה האדיש (2) המצורפת לשלב את הראש, אשר אמור להשלים מעגל כפי שאפשר לראות על האוסילוסקופ. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. תגובות גלם מהקלטות לדוגמא כל תגובה תואמת בזק אור יחיד של 50 משך msec (פסים שחורים). (א) דוגמא של שינוי המתח השלילי הגדול כי יש לראות רקלפני הכניסה לתא. (ב) הקלטה נקיה צריכה מעט רעשי רקע ומתן מענה depolarizing גדול, בדרך כלל של לפחות 40 mV. (ג) דוגמא של הקלטה ירודה עקב השינוי השלילי האפשרי לאחר השיא הראשי (ראשי חץ). (ד) דוגמא נוספת הקלטה רעה. הפוטנציאל נח עובר תנודות גדולות (פס אדום) ואת הכמות הגדולה של רעש רקע יכול לטשטש את משרעת תגובה (ראש החץ).
איור 7:. התגובה-Intensity התחבר פונקציה לינארית חוגים מוצקים להראות התגובות השקולות של תא 3.5 כדי 0 OD, עבור התקנה ניסיונית זו. עוצמת אור על סולם לוגריתמים. בעצימויות גבוהות מאוד התגובה רוויה, בעוצמות נמוכות מאוד תגובה קטנה נמשכת במקום לצנוח לאפס לאורך הקו. Tהוא Naka-ראשטון המשוואה 33 הוא מצויד בכושר שאינו ליניארי זה (קו מקווקו).
איור 8:. דוגמאות רגישות ספקטרלית (א) התגובות של תא בודד נציג הוקלטו רגישות ספקטרלית יחסית חושבה. השיא של תא זה ב 440 ננומטר, כלומר הוא מגיב הטוב ביותר אור הכחול. נתוני תא בודדים עשויים להיראות (שיא ב 380 ננומטר) רועש. (ב) תאים עם אותו לשיא וצורה יחסית הם ממוצעים יחד וברי סטיית התקן מתווספים. הנה, שבעה תאים כחולים משבעה אנשים היו ממוצעי מתן עדויות מוצקות לכך לסוג תא קיים מין זה מקסימאלי רגיש לאור ב 440 ננומטר. (ג) תהליך זה ניתן לחזור לכל סוגי התאים מצאו, זמם יחד. עיני חרקים להשתנות נרחבות רגישויות הרפאים שלהם אלא תוספות טיפוסיותect יכול להיות פסגות המוצגות כאן, ב 370 ננומטר, 440 ננומטר, ו -510 ננומטר. הערה, רגישויות ספקטרלי כל אלה מחושבים באמצעות נתוני אמת, אבל הפסגות הוזזו משום שהנתונים טרם פורסם עבור מין זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקלטה תאית יכולה להיות טכניקה קשה לשלוט בשל הצעדים טכניים הרבים המעורבים. עבור ניסויים מוצלחים כמה נקודות חשובות יש לקחת בחשבון. ראשית, חשוב שיהיה שולחן מבחינת רטט-מבודד כראוי שבו הניסוי מבוצע. חוקרים רבים משתמשים בלוחות אוויר, אשר לחלוטין להפריד את השולחן מהבסיס, מתן בידוד רעידות מעולה. ההגדרה שלנו כרוכה שולחן שיש עבה עם ארגז חול על גבי, שלתוכו הוא הניח את בעל micromanipulator / אלקטרודה / דגימת מנגנון במה. זוהי אלטרנטיבה יעילה יותר סבירה כדי שולחן אוויר, במיוחד אם גישה לגז בתוך הבית או אוויר דחוס היא מגבלה. אמצעי רטט-קליט נוספים עשויים להילקח כגון מתלי אוויר פסיביים, או התוספת של אלמנטי ריפוד אל רגלי השולחן (למשל, פתח כדורי טניס, צינורות אופניים, רפידות ג'ל סמיכות). יתר על כן, זה הכרחי כי ההתקנה הניסיונית להיות בתוךכלוב פאראדיי עם הכל מוארק כראוי. כלוב פאראדיי צריך מסך רשת מתכת בחלק הקדמי כי ניתן להסיר כשעובדים בתוך הכלוב והחליפו בקלות בעת ההקלטה. אפילו כמות קטנה של רעש חשמלי הסביבה (בעיקר 50 רעש הרץ מאספקת החשמל AC הראשי) יכול לבצע הקלטה טובה אחרת שמיש.
בעת הכנת דגימה, hemolymph והשכבות פיגמנט שמסביב האומטידיה עשוי למנוע הקלטות מוצלחות. אם החור הקרני הוא חתך גדול מדי, שאיבה רגילה של hemolymph בגוף גורמת לפני השטח הנוזלי כדי לנוע למעלה ולמטה באתר לחתוך, וכתוצאה מכך הקלטה יציבה. לאחר חור הוא חתך, שכבות פיגמנט hemolymph משטח יהיה קריש במהירות לתוך גלד חדיר גם כאשר אטום עם וזלין, ולכן חשוב לקבל את האלקטרודה לתוך העין בהקדם האפשרי. הפתרון של רינגר עשוי לשמש גם במקום וזלין. האלקטרודה הקרקע עשויה להיות מוחדרתאיברי הפה או לתוך הגדם של אנטנה לחתוך.
בנוסף, זה בדרך כלל מועיל כדי לשמור על בעלי החיים כמו כהה מותאם ככל האפשר. בשיטה זו, צעדים כוללים שמירה בחדר ההקלטה כהה מאוד, חסימת אור התועה מן מנורת קסנון מלהיכנס כלוב פאראדיי, הבזקי גירוי זמן קצר (30-50 msec), ואת בתדירות מספיקה נמוכה בין ההבזקים (0.5 ומעלה). כאשר פיגמנט ויזואלי בולע פוטון, את כרומופור ב rhodopsin בוררים מ 11- ציס -3-hydroxyretinal לכל - טרנס -retinal, גרימת שינוי קונפורמציה של החלבון opsin, והפעלת המכלול כולו כפי metarhodopsin, אשר יוזם את חלבון G אֶשֶׁד. תמונה הלבנת מתרחשת כאשר אור בעוצמה גבוהה גורמת כרומופור להפריד פיזית בין חלבון opsin. זמן הוא גורם מגביל בניסוי הזה כי האלקטרודה יהיה רק להקליט ביציבות תגובות מתוך התא לתקופה מסוימת של זמן עד שזה נופל החוצהאו הקרום פגום. מסיבה זו אנחנו לא לשבור אותו המאפשרים לתא להתאושש, אך אנו כן משתמשים משך פלאש ותדירות שמצאנו לא לבזות את תגובת התא לאורך זמן. חשוב על מנת להפחית את התדירות והעצמה של אור אם תמונת הלבנה מתרחשת.
במהלך ההקלטה, טיפ אלקטרודה גדול או תנועה רבה על ידי אלקטרודה עלול לגרום נזק לתא כאשר חודר את הממברנה. רק טיפים בסדר (לפחות ~ 100 MΩ) ותנועות קטנות אמורים לשמש כאשר מתקרבים תא להקלטה. אם הקלטה תאית מוחלת ליישומים אחרים, כגון קלטות מוח, מאוד עדינה, אלקטרודות חסונה עשויה להיות משך באמצעות זכוכית קוורץ, אבל חולץ מיוחד חייב לשמש אלקטרודות אלה. כאשר ראשון שהופך אלקטרודה משייך תכנית, בדקנו התנגדות טיפ ידי למלא את המשבצות האלקטרודה, לקבע אותו לבעל אלקטרודה או בהתקנה מדומה, ומעמיד את קצה האלקטרודה קרקע תמיסת מלח. Nשלוחה אנחנו מוחלים זרם למדידת השינוי במתח על האוסילוסקופ. כדי להזיז את קצה האלקטרודה אנו משתמשים micromanipulator ידנית שזז לאורך שני צירים. מניפולטורים אחרים קיימים כולל אלה דיגיטליים המאפשרים תנועה לאורך כל שלושת צירים ואלה עשויים לשמש ליישומים זו או מורכב יותר. ישנן דרכים רבות כדי לבנות במה הקלטה, ויש הרבה סוגים שונים של חומרה ותוכנה המשמשות הקלטה וניתוח הנתונים הנצפים. ההגדרה שלנו מייצגת אחד התקנה פשוטה, קלה, ובמחיר סביר של אסדת ההקלטה.
בבניית עקומת VlogI, פונקציות שפותחה על ידי Naka ו ראשטון 33 ואחרים 34,35 חשבון עבור חלקים שאינם ליניאריים מהתגובות זממו. שיטות שונות משמשות כדי להתאים עקומה זו לנתונים, ואנחנו זממנו התוצאות של שיטה אחת כזו שאינה דורשת תוכנה עקומה-הולם, אם כי שיטות אחרות מתאימות גם 36,37 (
מגבלה אחת של השיטה היא שאם האורגניזם מחקר מבטא יותר מאחד opsin דומים גנטית בעיניים, זה יכול להיות קשה לזהות אילו opsin mRNA תואם עשוי איזו מחלקה ספקטרלי של תא קולט אור. כדי להתגבר על בעיה זו, שיטה זו כבר בשילוב עם זריקות צבע ו כלאה באתרו או אימונוהיסטוכימיה לזהות את opsins בהצלחה לידי ביטוי בתאים רשמו 10.
השיטה שלנו היא פשוטה ונגישה חוקרים זרים עם אלקטרופיזיולוגיה חזותי. טכניקה זו נפוצה במדעי המוח, אך הם ייחודיים ושיטות ברורות נעדרות בספרות, מה שהופך שיטה זו קשה לשחזר. למרות וריאציות רבות של טכניקה זו להתקיים, אנו מציעים דרך פשוטה למדוד רגישות ספקטרלית בעיניים המתחמות. הנתונים הפיסיולוגיים הוא חלק חשוב של ראיות בסיפורים של אקולוגיה חזותית אבולוציה 41. וריאציה רצף opsin קשורה קשר הדוק עם רגישות של תא קולט אור, מה שהופך אידיאלי בשיטה זו עבור מחקרים הבוחנים את הבסיס הגנטי שינוי פנוטיפי. מדידת רגישויות תא קולט אור ניתן לזווג גם עם מבחני ההבחנה בין צבעים התנהגותי, מראה את הבסיס הפיזיולוגי ספי אפליה חשוב ראיית צבעים 42-46. בשנת מניפולציות גנטיות או טיפוליות תסיסנית למשל, לא זהechnique יכולה להיות דרך טובה למדוד תפקוד פיזיולוגי תקין של העין או המוח, כמו גם 47,48. למרות שלנו אינו הראשון או שיטת המורכבים ביותר של הקלטה תאית בעיניים, תקוותנו היא כי נוכל להפוך שיטה זו יותר זמינה בקלות עבור רבייה ואינטגרציה בתוכניות מחקר מחוץ הנוירולוגיה רשמית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים המנוח רודי לימבורג בודת היקף זרוע קרדן, קימברלי ג'יימיסון, מתיו מקהנרי, ו ראג'ו Metherate עבור השאלה לנו ציוד, Almut קלבר ו קנטר Arikawa, על עידוד. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע (NSF) כדי KJM ומענק NSF IOS-1,257,627 ל ADB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al.
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P.
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D.
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
